3-D Time-Lapse Beeldvorming van celwanddynamica met behulp van calcofluor in de Moss Physcomitrium patens
10 februari 2023
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol om de 3D-celwanddynamiek van levend mosweefsel in beeld te brengen, waardoor de onthechting van celwanden in ggb-mutanten en verdikking van celwandpatronen in het wilde type tijdens de ontwikkeling gedurende een lange periode mogelijk wordt.
Time-lapse beeldvorming met fluorescentiemicroscopie maakt observatie van de dynamische veranderingen van groei en ontwikkeling op cellulair en subcellulair niveau mogelijk. Dit eenvoudige protocol voor 3D time-lapse beeldvorming kan de celwanddynamiek over een lange periode direct bestuderen. Dit protocol maakt gebruik van calcofluorkleurstof om de dynamiek van de celwanddikte te markeren en vereist daarom geen transformatie van een fluorescerend eiwit.
De calcofluorsignalen zijn stabiel en kunnen langer dan een week aanhouden. Deze methode kan worden toegepast op veel andere systemen met eenvoudige structuren die celwanden bevatten en kan worden gekleurd door calcofluor zoals in bloeiende planten. In dit protocol zijn de calcofluorsignalen stabiel wanneer deze kleurstof in het medium wordt gemengd tijdens het hele proces van time-lapse beeldvorming.
Verspreid om te beginnen het zeven dagen oude mosweefsel in een microbuis van 1,5 milliliter met 20 microliter gesteriliseerd water. Gebruik voor het wilde type een tang om de protonemata te scheiden. Voor de ggb-mutant scheidt u de protonemata met behulp van de AP-1000-pipet.
Voeg 10 microliter van de gesteriliseerde calcofluor-white toe aan de microbuis en laat de buis twee minuten rechtop in de kap staan voor kleuring. Meng de planten onmiddellijk na het kleuren met 200 microliter gekoeld BCDATG met BCDAT-medium door vijf keer te pipetteren met een P1000-pipet en breng het mengsel over in een 27 millimeter glazen basisschaal. Zorg ervoor dat de 200 microliter BCDATG met monsters gelijkmatig wordt verdeeld over het oppervlak van de 27 millimeter glazen bodemschaal om een dunne laag film te produceren, zodat de monsters zich tijdens het beeld binnen de objectieve werkafstand bevinden.
Na twee minuten stollen bij kamertemperatuur, dek je de dunne laag af met drie milliliter afgekoeld BCDATG en laat je hem 10 minuten opstijven om weer te stollen. Teken aan de onderkant van de schotel negen lijnen elk in parallelle en loodrechte richtingen en markeer de rijen met tekens van A tot H en de kolommen met cijfers van één tot acht. Gebruik boven, onder, rechts, midden en links om de posities binnen elk vierkant te markeren.
Als een plant zich bijvoorbeeld in een vierkant in de tweede rij bevindt, in de zesde kolom en zich in de linkerbovenhoek van het vierkant bevindt, krijgt deze plant de naam b6 linksboven. Plaats de glazen bodemschaal één tot twee dagen onder wit licht voordat u elke dag wordt onderworpen aan time-lapse-beeldvorming, gedurende maximaal drie dagen. Als u de 3D-afbeeldingen wilt reconstrueren, opent u het ND2-bestand en klikt u op Volume.
Reconstrueer de celwand op dag nul, dag één, dag drie en dag vier. Nadat je elke afbeelding hebt gemaakt, plaats je de schaal op basis van glas terug in de kweekkamer. Dynamische veranderingen in dwarswanden werden aangetoond door calcofluor-witte kleuring in wildtype en ggb-mutanten.
Voor ggb-mutanten geven witte stippellijnen onder elke afbeelding de gebroken oppervlaktecelwand in de uitzettende cellen aan en oranje lijnen geven de cellen onder het celwandoppervlak aan in ggb. De verschillen in calcofluor-wit signaal kunnen worden gedetecteerd op de oppervlakteposities van de cellen en minder dicht bevlekte gebieden die wijzen op celexpansie in ggb-mutanten of nieuw vertakkende locaties in het wilde type. Voor wild type precultuur zijn de planten in zwak rood licht van het bovenstaande gedurende vijf dagen nodig om de fototrope reacties van protonemata te induceren, zodat de planten aan de bodem van gerechten kunnen worden bevestigd en de planten tijdens de beeldvorming binnen de objectieve upworking-afstand kunnen worden tevoorschijn kunnen komen, omdat calcofluor-wit kan worden gebruikt met andere kleurstoffen zoals microsfeer.
Aanvullende informatie over de celexpansie kan ook worden bestudeerd. Dynamiek van de celwand van planten is van cruciaal belang voor een efficiënte groei en ontwikkeling en voor de reactie op omgevingssignalen. Dit protocol maakt directe van de verdeling van veranderingen in celwandsignalen en integratie mogelijk.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol voor 3D time-lapse beeldvorming van celwanddynamica in levend mosweefsel. De methode maakt visualisatie van celwandloslating bij ggb mutanten en verdikkingspatronen bij wild-type mos mogelijk tijdens ontwikkeling over een langere periode.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Plantontwikkeling
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- Time-lapse beeldvorming is cruciaal voor het observeren van cellulaire dynamica.
- Fluorescentiemicroscopie maakt gedetailleerde visualisatie van groeiprocessen mogelijk.
- Calcofluor kleurstof wordt gebruikt om celwanden te kleuren zonder dat transformatie van fluorescerende eiwitten nodig is.
- De stabiliteit van calcofluor signalen verbetert de betrouwbaarheid van beeldvorming over tijd.
Doel van het onderzoek
- Om een protocol te ontwikkelen voor het observeren van celwanddynamica in mos.
- Om verschillen in celwandgedrag tussen ggb mutanten en wild-type mos te onderzoeken.
- Om een methode te bieden die toepasbaar is op andere plantensystemen met celwanden.
Gebruikte methoden
- 3D time-lapse beeldvorming met fluorescentiemicroscopie.
- Gebruik van calcofluor kleurstof om celwanddynamica te markeren.
- Stabile calcofluor signalen gehandhaafd gedurende het beeldvormingsproces.
- Toepassing van het protocol op verschillende plantensystemen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van celwandloslating in ggb mutanten.
- Observatie van verdikkingspatronen in wild-type mos.
- Demonstratie van de toepasbaarheid van het protocol op andere plantstructuren.
- Stabile calcofluor signalen bevestigd voor langere beeldvormingsperiodes.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van celwanddynamica.
- De verkregen inzichten kunnen het begrip van plantontwikkeling verbeteren.
- Deze methode kan worden aangepast voor gebruik in verschillende plantensoorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics using calcofluor in Physcomitrium patens enables direct, quantitative visualization of cell wall remodeling over extended periods without genetic transformation. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence in plant cell wall biology, which is critical for early discovery and target validation in crop trait engineering and plant-based bioproduction. The method's stability and adaptability position it as a reusable capability for diverse cell wall-containing systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell wall remodeling and expansion mechanisms in live tissues.
- Supports functional validation of genetic perturbations affecting cell wall integrity.
- Facilitates predictive confidence in pathway assignment and target prioritization for plant cell wall biosynthesis.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible readout for cell wall dynamics without the need for transgenic lines.
- Delivers quantitative, time-resolved imaging outputs suitable for comparative analysis across genotypes or treatments.
- Enables scalable preparation of validated biological systems for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker development by correlating cell wall staining patterns with future expansion or branching sites.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in plant-based production systems.
- Reduces biological risk by providing mechanistic insight into cell wall defects and their phenotypic consequences.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant cell wall research, supporting both hypothesis-driven studies and screening campaigns.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on cell wall expansion and integrity in live tissues.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Supports statistical comparison of cell wall dynamics across genotypes and time points.
- Translational Research: Facilitates alignment of imaging biomarkers with phenotypic outcomes relevant to plant productivity.
- Enterprise Reuse: Adaptable to multiple plant systems and experimental contexts requiring cell wall visualization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell wall biology.
- Operational Value: Offers standardized, scalable, and reproducible imaging workflows without genetic modification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of cell wall targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of plant-based R&D programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and time-lapse imaging analysis.
- Needs access to stable calcofluor dye and compatible imaging instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and imaging protocols.
- Adaptable to various plant systems with cell walls amenable to calcofluor staining.
- Signal stability and imaging duration should be validated for each new system.
