Name: Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Leer FRET-imaging voor eiwit-eiwitinteracties in levende plantencellen met Nicotiana benthamiana. Deze methode maakt detectie van interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren op nanometerschaal mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk in het laboratorium van V.C. wordt ondersteund door subsidies van NIH (R35GM144059 en R01GM50224), NSF (MCB1913165 en IOS1758046) en BARD (IS-5276-20) tot V.C.

Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 of GV3101 werden gebruikt voor deze studie.
1. FRET vector constructie
<ol><li>Selecteer fluorescerende tags voor het FRET-paar donor/acceptor.<ol><li>Gebruik EGFP van pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (zie Materiaaltabel) om de donorvector te genereren.</li>
		<li>Gebruik mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (zie Materiaaltabel) om de acceptorvector te genereren.</li>
	</ol></li>
	<li>Genereer de donor/acceptor FRET-constructies met behulp van een locatiespecifieke recombinatiekloontechniek34, zoals het Gateway-recombinatieklonensysteem35.<ol><li>Versterk de coderende sequenties van de eiwitten van belang36 (d.w.z. de Arabidopsis OTLD1 en LSH10)15. OPMERKING: Het is ook een goed idee om een negatieve controle te gebruiken die een homoloog van een van de interagerende eiwitten vertegenwoordigt, maar naar verwachting geen interactie zal vertonen; de OTLD1-LSH10 interactiestudie maakt gebruik van een homoloog van LSH10, LSH4, die OTLD1 niet herkent. OTLD1, LSH10 en LSH4 cDNA's worden versterkt door PCR met behulp van primers vermeld in tabel 1.</li>
		<li>Kloon OTLD1, LSH10 en LSH4 in de ingangsvector pDONR207 met behulp van de site-specifieke recombinatie kloontechniek34.</li>
		<li>Gebruik de Gateway LR Clonase II (zie Tabel met materialen) om LSH10 en LSH4 van pDONR207 over te brengen naar de binaire doelvector pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 om de binaire donorconstructen p35S::LSH10-GFP (getest construct) en p35S::LSH4-GFP (negatieve controle) te genereren.</li>
		<li>Gebruik hetzelfde in de handel verkrijgbare enzym (stap 1.2.3) om OTLD1 van pDONR207 over te brengen naar de binaire doelvector pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 om de binaire acceptorconstructie p35S::OTLD1-mRFP (getest construct) te genereren.</li>
		<li>PCR-amplify36 mRFP van pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 met behulp van primers vermeld in tabel 1, kloon het door de recombinatie-kloontechniek in pDONR207 en gebruik vervolgens LR Clonase II om mRFP over te brengen naar pPZP RCS2A-DEST-EGFP-N1 om het binaire fusieconstruct p35S::mRFP-GFP (positieve controle) te genereren.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer transformatie van de donor- en acceptorconstructies uit in Agrobacterium.<ol><li>Voeg 1 μg van elk plasmide uit stap 1.2.3-1.2.5 toe aan 100 μL van de kweek van competente cellen van Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 of GV3101, bereid met behulp van standaardprotocollen37 of commercieel verkregen, en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg 1 ml LB-medium (1% trypton, 0,5% gistextract en 1% NaCl; zie materiaaltabel) toe aan het competente celmengsel en roer bij 200 tpm en 28 ° C gedurende 1,5 uur. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 3.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen in 0,1 ml LB-medium door pipetteer en verspreid ze op LB-agar aangevuld met de juiste antibiotica (bijv. 0,01% spectinomycine en 0,005% rifampicine; zie Materiaaltabel). Groei bij 28 °C gedurende 2 dagen.</li>
		<li>Kies individuele kolonies en ent elk van hen afzonderlijk in 1 ml LB-bouillon aangevuld met de juiste antibiotica.</li>
		<li>Laat de cellen groeien bij 28 °C gedurende 24 uur en breng 0,2 ml van de cultuur over in een nieuwe buis. Verzamel de cellen door centrifugeren bij 10.000 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Extraheer plasmide-DNA volgens een standaardprotocol voor het isoleren van plasmiden uit Agrobacterium-cellen38 en resuspendeer het geëxtraheerde DNA in 30 μL water. Om de kolonies te identificeren die de gewenste plasmiden herbergen, gebruikt u 2 μL van het DNA-preparaat als sjabloon voor PCR met genspecifieke primers vermeld in tabel 1. Meng 0,7 ml van de geïdentificeerde cultuur met 0,3 ml glycerol en bewaar bij -80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Agro-infiltratie
<ol><li>Kweek Nicotiana benthamiana planten. OPMERKING: Gedurende het hele experiment moeten alle planten gezond zijn.<ol><li>Zaai en kweek N. benthamiana zaden in een pot met natte grond met een hoge dichtheid.</li>
		<li>Bewaar de geplante zaden in een groeikamer van 23 °C met 16 uur licht en 8 uur donkere cyclus met 150-170 μmol/m2s lichtintensiteit totdat de diameter van de eufyl 0,5 cm bereikt.</li>
		<li>Breng de zaailingen over naar grotere potten en laat ze in dezelfde kamer groeien met dezelfde parameters. OPMERKING: Planten zijn klaar voor agro-infiltratie wanneer hun grootste bladeren 5-7 cm in diameter zijn, meestal binnen 4-5 weken. Bij kleinere planten die te jong zijn, zullen de effecten van agro-infiltratie te ernstig zijn voor de FRET-analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid bacteriële cellen voor op agro-infiltratie.<ol><li>Kweek elke Agrobacterium-kolonie die de FRET-constructen bevat 's nachts in 5 ml LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica (stap 1.3.3) en 150 μM acetosyringon bij 28 °C (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 3.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Resuspensie van de cellen in agro-infiltratiebuffer (10 mM MgCl2, 10 mM MES pH 5,6, 150 μM acetosyringon) tot OD600 = 0,5.</li>
		<li>Combineer de geresuspendeerde cellen in een verhouding van 1:1 v/v tussen cellen met de juiste constructies (stap 2.2.5).</li>
		<li>Meng voor de agro-integraties met dubbele constructie de aliquots van twee culturen en meng voor agro-filtraties met één constructie de aliquots van dezelfde cultuur:<ol><li>Geteste eiwitten: OTLD1-mRFP + LSH10-GFP (bacteriën die de p35S::OTLD1-mRFP en p35S::LSH10-GFP constructen herbergen).</li>
			<li>Negatieve controle: OTLD1-mRFP + LSH4-GFP (bacteriën die de p35S::OTLD1-mRFP en p35S::LSH4-GFP constructen herbergen).</li>
			<li>Negatieve controle: LSH10-GFP + vrije mRFP (bacteriën die de p35S::LSH10-GFP en pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 constructen herbergen).</li>
			<li>Positieve controle: mRFP-GFP (bacteriën die het p35S::mRFP-GFP-GFP-construct herbergen).</li>
		</ol></li>
		<li>Incubeer de cellen bij 28 °C gedurende 0,5-1 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Voer agro-infiltratie uit.<ol><li>Laad de bacteriecultuur in een naaldloze spuit van 1 ml.</li>
		<li>Druk het mondstuk van de spuit zachtjes maar stevig tegen de abaxiale kant van de volledig geëxpandeerde N. benthamiana bladeren terwijl u het blad met een gehandschoende vinger aan de adaxiale kant vasthoudt.</li>
		<li>Infiltreer tot vier vlekken op een blad, drie bladeren per plant, twee of drie planten voor elke bacteriecultuur. Wissel handschoenen tussen monsters om kruisbesmetting te voorkomen.</li>
		<li>Houd de agro-geïnfiltreerde planten in dezelfde groeikamer onder dezelfde omstandigheden, zoals beschreven in stap 2.1.2, gedurende 24 uur tot 36 uur. Bewaar de agro-geïnfiltreerde planten niet langer dan 36 uur, omdat dit het fluorescentiesignaal zal verminderen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Confocale microscopie
<ol><li>Bereid microscoopglaasjes voor fluorescentievisualisatie voor.<ol><li>Gebruik na 24-36 uur van de infiltratie een scheermesje om elk agro-geïnfiltreerd blad in kleine stukjes (2 mm x 4 mm) tussen de aderen te snijden.</li>
		<li>Leg de bladstukken op een glazen glijbaan met het abaxiale bladoppervlak naar boven gericht. Leg een druppel water op de bladstukken en bedek ze met het afdekglas. Tik lichtjes op het afdekglas om luchtbellen te verwijderen.</li>
		<li>Zet de microscoop en laser aan (zie Materiaaltabel). Plaats de dia in de microscooptraphouder voor beeldvorming onder de specifieke FRET-parameters (stappen 3.2 en 3.3).</li>
		<li>Begin de waarnemingen met een 10x objectieflens om cellen te identificeren die zowel de GFP- als de mRFP-signalen vertonen en gebruik vervolgens een 40x-objectieflens voor daaropvolgende gedetailleerde waarnemingen. OPMERKING: Belangrijk is dat SE-FRET en AB-FRET meestal op hetzelfde weefselmonster worden uitgevoerd, waardoor dezelfde kanaalinstellingen (stap 3.2) kunnen worden gebruikt, behalve het FRET-kanaal, dat is in- en uitgeschakeld voor respectievelijk de SE-FRET- en AB-FRET-waarnemingen (stappen 3.2.2.3 en 3.3.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de parameters voor SE-FRET in (figuur 1A).<ol><li>Open het hulpprogramma Multi-Dimensional Acquisition (MDA).</li>
		<li>Stel een set van drie confocale kanalen in hetzelfde gezichtsveld vast (aanvullende figuur 1).<ol><li>Stel het donorkanaal (het GFP-kanaal) in voor excitatie en emissie van het donorfluorchroom met de 405 nm excitatielaser en het 400-597 nm emissiefilter.</li>
			<li>Stel het acceptorkanaal (het mRFP-kanaal) in voor excitatie en emissie van het acceptorfluorchroom met de 561 nm excitatielaser en het 400-597 nm emissiefilter. OPMERKING: Het emissiefilter voor mRFP is ingesteld op 400-597 nm om het mRFP-signaal te scheiden van het FRET-signaal bij 597-617 nm (stap 3.2.2.3) en zo de FRET-onafhankelijke mRFP-emissie te verminderen.</li>
			<li>Stel het FRET-kanaal in voor excitatie van de donor en emissie van de acceptorfluorchromen met de 405 nm excitatielaser en het 597-617 nm emissiefilter.</li>
		</ol></li>
		<li>Stel de intensiteit van de donorexcitatie in op een minimumniveau om FRET te observeren en tegelijkertijd fotobleaching te vermijden, waardoor de SE-FRET-efficiëntie wordt verminderd. OPMERKING: Deze excitatie-intensiteit wordt experimenteel geselecteerd voordat de FRET-procedure wordt uitgevoerd om fotobleaching te voorkomen. Het varieert afhankelijk van bladdikte, leeftijd en tijd na overexpressie.</li>
		<li>Prikkel de donor en scan naar cellen die het verwachte fluorescentiesignaal van de acceptor bevatten.</li>
		<li>Selecteer het gebied dat het fluorescentiesignaal van belang bevat.</li>
		<li>Verkrijg een SE-FRET-beeldreeks door op de Snap-knop te drukken.<ol><li>Afbeelding 10-15 cellen die eerst het mRFP-GFP-construct (positieve controle) tot expressie brengen; pas de parameters voor focus, zoom en slimme versterking aan om scherp te stellen op het interessegebied dat moet worden vastgelegd (aanvullende figuur 2).</li>
			<li>Met dezelfde instellingen kunt u 10-15 cellen weergeven, die elk AFZONDERLIJK OTLD1-mRFP, vrije mRFP, LSH10-GFP of LSH4-GFP tot expressie brengen. OPMERKING: Deze beelden worden verkregen door de "PixFRET" plug-in van ImageJ (zie Materiaaltabel), die werd gebruikt voor de FRET-gegevensanalyses (stap 3.4.1) om de spectrale doorbloedingswaarden (SBT) voor de acceptanten en de donoren te bepalen; deze beelden worden door de software gebruikt om de SE-FRET-beelden te genereren voor de OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP en LSH10-GFP + vrije mRFP-eiwitparen (stap 3.2.6.3).</li>
			<li>Met dezelfde instellingen kunt u ook 10-15 cellen weergeven die OTLD1-mRFP + LSH10-GFP, OTLD1-mRFP + LSH4-GFP en LSH10-GFP + vrije mRFP-eiwitparen co-expressie geven.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Stel parameters in voor AB-FRET (figuur 1B).<ol><li>Gebruik de donor- en acceptorkanaalparameters die zijn ingesteld voor SE-FRET (stap 3.2.2), maar schakel het FRET-kanaal uit.</li>
		<li>Stel de parameters in voor fotobleaching van de acceptor (mRFP) (aanvullende figuur 3).<ol><li>Zorg ervoor dat het bleken begint na vijf afbeeldingen. Sta 200 iteraties toe voor elk bleekmiddel. Houd 100% laserintensiteit op 561 nm.</li>
			<li>Houd een bleekduur van 45 s aan. Zorg voor een scansnelheid van 512 x 512 pixels bij 400 Hz.</li>
		</ol></li>
		<li>Teken het gebied van de cel dat moet worden gebleekt; voor nucleaire interacties worden bijvoorbeeld interessegebieden getekend rond het hele gebied van de celkern39.</li>
		<li>Activeer bleken door op de knop Start experiment te drukken; het activeren van deze functie zal de fotobleaching uitvoeren en de AB-FRET-beeldreeks verkrijgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyseer de FRET-gegevens.<ol><li>Gebruik voor het analyseren van SE-FRET-gegevens de plug-in "PixFRET" voor de ImageJ-software om gecorrigeerde afbeeldingen van de SE-FRET-efficiëntie te genereren na aftrek van SBT40 (stap 3.2.6.2).</li>
		<li>Bereken voor het analyseren van de AB-FRET-gegevens %AB-FRET als de procentuele toename van de GFP-emissie na mRFP-fotobleaching met behulp van de volgende formule41: %AB-FRET = [(GFPpost - GFPpre) / GFPpre] x 100, waarbij GFPpost GFP-emissie is na mRFP-fotobleaching en GFPpre GFP-emissie vóór mRFP-fotobleaching.</li>
		<li>Let bij het bekijken van de FRET-beelden op de subcellulaire lokalisatie van het FRET-signaal. OPMERKING: In veel gevallen kunnen deze cellulaire compartimenten (bijv. Kern, chloroplasten, ER, enz.) gemakkelijk worden geïdentificeerd en, als bijkomend voordeel van de FRET-techniek, belangrijke aanwijzingen geven voor de biologische functie van de interagerende eiwitten.</li>
	</ol></li>
</ol>

Er werden geen belangenconflicten gemeld.

Dit FRET-protocol is eenvoudig en gemakkelijk te reproduceren; het vereist ook minimale leveringsinvesteringen en maakt gebruik van standaarduitrusting voor veel moderne laboratoria. In het bijzonder onderscheiden vijf belangrijke technische kenmerken de veelzijdigheid van deze procedure. Ten eerste worden de FRET-constructies gegenereerd met behulp van locatiespecifieke recombinatie, een kloonbenadering die gemakkelijk te gebruiken is, nauwkeurige resultaten oplevert en tijd bespaart in vergelijking met traditioneel klo...

Plant histon deubiquitinasen spelen een belangrijke rol bij het beheersen van genexpressie door post-translationele modificatie van histonen, met name door het wissen van hun monoubiquityleringsmarkeringen1. Tot nu toe is OTLD1 een van de weinige plantaardige histondeubiquitinasen die op moleculair niveau worden gekarakteriseerd in Arabidopsis 2,3. OTLD1 verwijdert monoubiquitinegroepen uit de H2B-histonmoleculen, waardoor de verwijdering of toevoeging van euchromatische acetylering en methylatiemodificaties van H3-histonen in het doelgenchromatine 4,5 wordt bevorderd. Bovendien interageert OTLD1 met een ander chromatine-modificerend enzym, het histon lysine demethylase KDM1C, om transcriptionele onderdrukking van de doelgenen te beïnvloeden 6,7.
De meeste histonmodificerende enzymen missen DNA-bindingsmogelijkheden en kunnen daarom hun doelgenen niet direct herkennen. Een mogelijkheid is dat ze samenwerken met DNA-bindende transcriptiefactoreiwitten die deze enzymen binden en naar hun chromatinedoelen leiden. Met name in planten is bekend dat verschillende belangrijke histonmodificerende enzymen (d.w.z. histonmethyltransferasen 8,9, histonacetyltransferases10, histondemethylases11 en Polycomb-repressieve complexen 12,13,14) worden gerekruteerd door transcriptiefactoren. In overeenstemming met dit idee werd onlangs een mogelijk mechanisme voor OTLD1-rekrutering voor de doelpromotors voorgesteld dat is gebaseerd op specifieke eiwit-eiwitinteracties van OTLD1 met een transcriptiefactor LSH1015.
LSH10 behoort tot een familie van de plantaardige ALOG (Arabidopsis LSH1 en Oryza G1) eiwitten die functioneren als centrale ontwikkelingsregulatoren 16,17,18,19,20,21,22. Het feit dat de leden van de ALOG-eiwitfamilie DNA-bindingsmotieven23 bevatten en de capaciteiten voor transcriptionele regulatie22, nucleaire lokalisatie19 en homodimerisatie24 vertonen, geeft verdere ondersteuning aan het idee dat deze eiwitten, waaronder LSH10, kunnen fungeren als specifieke transcriptiefactoren tijdens epigenetische regulatie van transcriptie. Een van de belangrijkste experimentele technieken die worden gebruikt om de LSH10-OTLD1-interactie in vivo te karakteriseren, is fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET)15.
FRET is een beeldvormingstechniek voor het direct detecteren van interacties op korte afstand tussen eiwitten binnen <10 nm van elkaar25 in levende cellen. Er zijn twee belangrijke varianten van de FRET-benadering26: sensibiliseerde emissie (SE-FRET) (figuur 1A) en acceptorbleking (AB-FRET) (figuur 1B). In SE-FRET dragen de interagerende eiwitten - waarvan er één is gelabeld met een donorfluorchroom (bijv. Groen fluorescerend eiwit, GFP) en de andere met een acceptorfluorchroom (bijv. Monomeer rood fluorescerend eiwit, mRFP27,28) - niet-radiatief de geëxciteerde toestandsenergie van de donor naar de acceptor over. Omdat er tijdens deze overdracht geen fotonen worden uitgezonden, wordt een fluorescerend signaal geproduceerd dat een stralingsemissiespectrum heeft dat vergelijkbaar is met dat van de acceptor. In AB-FRET worden eiwitinteracties gedetecteerd en gekwantificeerd op basis van verhoogde stralingsemissie van de donor wanneer de acceptor permanent wordt geïnactiveerd door fotobleaching en dus niet in staat is om de niet-stralingsenergie te ontvangen die van de donor wordt overgedragen (figuur 1). Belangrijk is dat de subcellulaire locatie van de FRET-fluorescentie indicatief is voor de lokalisatie van de interagerende eiwitten in de cel.
Het vermogen om FRET in levende weefsels in te zetten en de subcellulaire lokalisatie van de interagerende eiwitten tegelijkertijd te bepalen met het detecteren van deze interactie op zich, maakt FRET de voorkeurstechniek voor studies en initiële karakterisering van eiwit-eiwitinteracties in vivo. Een vergelijkbare in vivo fluorescentiebeeldvormingsmethodologie, bimoleculaire fluorescentiecomplementatie (BiFC)29,30,31,32, is een goede alternatieve benadering, hoewel BiFC, in tegenstelling tot FRET, valse positieven kan produceren als gevolg van spontane assemblage van de autofluorescente BiFC-verslaggevers33, en de kwantificering van de gegevens is minder nauwkeurig.
Dit artikel deelt de succesvolle ervaring met het implementeren van zowel SE-FRET- als AB-FRET-technieken en presenteert een protocol voor hun inzet om de interacties tussen OTLD1 en LSH10 in plantencellen te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>Acetosyringone (3&prime;,5&prime;-Dimethoxy-4&prime;-hydroxyacetofenon)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>#214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD Biosciences</td><td>#211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto gistextract</td><td>BD Biosciences</td><td>#212750&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Confocal laserscanningmicroscoop (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM900</td><td>Elke CLSM met vergelijkbare mogelijkheden is geschikt</td></tr><tr><td>EHA105</td><td>VWR</td><td>104013-310</td><td>We gebruiken het stock in de Citovsky bacteriënlab stock collectie</td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>#11789100</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II</td><td>Invitrogen</td><td>#11791020</td><td></td></tr><tr><td>GV3101</td><td>VWR</td><td>104013-296</td><td>We gebruiken het stock in de Citovsky bacteriënlab stock collectie</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#69889-10G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#63068-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana zaden</td><td>Herbalistics Pty</td><td>RA4 of LAB</td><td>We gebruiken het stock in de Citovsky zadenlab stock collectie</td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>Refs. 15, 28</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1</td><td>N/A</td><td></td><td>Gemaakt op basis van de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 construct (zie refs. 15, 28)</td></tr><tr><td>pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td><td>Gemaakt op basis van de pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 construct</td></tr><tr><td>Rifampicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#R7382-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4014-5G</td><td></td></tr><tr><td>Spuiten zonder naalden</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Zen software voor CLSM beeldvorming</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 3.0 versie</td><td>De software moet compatibel zijn met de gebruikte CLSM</td></tr></tbody></table>

onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Investigating Interactions Between Histone Modifying Enzymes and Transcription Factors in vivo by Fluorescence Resonance Energy Transfer

Epigenetische regulatie van genexpressie wordt vaak beïnvloed door histonmodificerende enzymen (HME's) die heterochromatische of euchromatische histonmarkeringen genereren voor respectievelijk transcriptionele repressie of activering. HME's worden gerekruteerd voor hun doelchromatine door transcriptiefactoren (TF's). Het detecteren en karakteriseren van directe interacties tussen HME's en TF's is dus van cruciaal belang om hun functie en specificiteit beter te begrijpen. Deze studies zouden biologisch relevanter zijn als ze in vivo worden uitgevoerd in levende weefsels. Hier wordt een protocol beschreven voor het visualiseren van interacties in plantenbladeren tussen een plant histon deubiquitinase en een plant transcriptiefactor met behulp van fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET), die de detectie van complexen tussen eiwitmoleculen die zich binnen <10 nm van elkaar bevinden. Twee varianten van de FRET-techniek worden gepresenteerd: SE-FRET (sensitized emission) en AB-FRET (acceptor bleaching), waarbij de energie niet-radiatief van de donor naar de acceptor wordt overgebracht of stralingsbestraling door de donor wordt uitgezonden bij fotobleaching van de acceptor. Zowel SE-FRET- als AB-FRET-benaderingen kunnen eenvoudig worden aangepast om andere interacties tussen andere eiwitten in planta te ontdekken.

Figuur 2 illustreert de typische resultaten van een SE-FRET-experiment, waarbij de celkernen tegelijkertijd werden geregistreerd in drie kanalen (d.w.z. donor-GFP, acceptor mRFP en SE-FRET). Deze gegevens werden gebruikt om afbeeldingen van SE-FRET-efficiëntie te genereren die gecodeerd zijn in een pseudo-kleurenschaal. Op deze schaal komt de overgang van blauw naar rood overeen met een toename van de FRET-efficiëntie, een maat voor de nabijheid van eiwitten en eiwitten van 0% tot 100%. In d...

Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Epigenetic regulation of gene expression is commonly affected by histone modifying enzymes (HMEs) that generate heterochromatic or euchromatic histone ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de vragen in eiwit-eiwitinteractie, stelt ons in staat om direct twee eiwitten te detecteren die zich binnen 10 nanometer van elkaar in levende cellen bevinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en gemakkelijk te reproduceren is. Het vereist ook eenvoudige materialen die beschikbaar zijn in veel moderne laboratoria.Deze maatregel kan worden gebruikt met elk levend weefsel of kweekcel die zich tijdelijk verspreidt op basis van een eiwit van belang. Als u deze techniek voor de eerste keer gebruikt, is het raadzaam om eerst de positieve controle en negatieve controle te gebruiken om het systeem te testen. Om te beginnen, zaai Nicotiana benthamiana zaden in een pot met natte grond met een hoge dichtheid.Bewaar de geplante zaden in een groeikamer op 23 graden Celsius. Wanneer de diameter van de eufyl 0,3 tot 0,5 centimeter bereikt, breng de zaailingen over naar grotere potten en laat ze in dezelfde kamer met dezelfde parameters groeien. Bereid vervolgens bacteriële cellen voor agro-infiltratie voor door elke agrobacteriekolonie die de FRET-constructies bevat, in te enten in vijf milliliter LB-medium aangevuld met antibiotica en 150 micromolaire acetosyringon.Incubeer de cultuur 's nachts bij 28 graden Celsius. Na incubatie centrifugeer je de cellen op 3.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspensie van de cellen in agro-infiltratiebuffer tot een OD 600 van 0,5.Voor agro-infiltratie met dubbele constructie combineert u de geresuspendeerde cellen in een één-op-één volumeverhouding met cellen die de juiste constructies bevatten. Incubeer de cellen bij 28 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een uur. Om agro-infiltratie uit te voeren, laadt u de bacteriecultuur in een naaldloze spuit van één milliliter.Druk het mondstuk van de spuit voorzichtig maar stevig tegen de abaxiale kant van de volledig geëxpandeerde Nicotiana benthamiana bladeren terwijl u het blad met een gehandschoende vinger aan de adaxiale kant vasthoudt. Infiltreer tot vier vlekken op een blad, drie bladeren per plant en twee of drie planten voor elke bacteriecultuur. Onderhoud de agro-geïnfiltreerde planten in dezelfde groeikamer onder dezelfde omstandigheden als eerder beschreven gedurende 24 tot 36 uur.Gebruik na 24 tot 36 uur infiltratie een scheermesje om elk agro-geïnfiltreerd blad in kleine stukjes van twee bij vier millimeter tussen de aderen te snijden. Leg de bladstukken op een glazen glijbaan met het abaxiale bladoppervlak naar boven gericht. Leg een druppel water op de bladstukken en bedek ze met het afdekglas.Tik lichtjes op het afdekglas om luchtbellen te verwijderen. Schakel vervolgens de microscoop en laser in. Plaats de dia in de microscooptraphouder.Als u de parameters voor SE-FRET wilt instellen, opent u de multidimensionale acquisitietool. Stel vervolgens het donorkanaal in voor excitatie en emissie van de donorfluorchroom GFP op een excitatielaser van 405 nanometer en het emissiefilter op 400 tot 597 nanometer. Stel het acceptorkanaal voor excitatie en emissie van de acceptor fluorochrome mRFP en een excitatielaser van 561 nanometer en emissiefilter in op 400 tot 597 nanometer.Stel het FRET-kanaal in voor excitatie van de donor en emissie van de acceptorfluorchromen met een excitatielaser van 405 nanometer en een emissiefilter van 597 tot 617 nanometer. Stel de intensiteit van de donorexcitatie in op een minimumniveau om FRET te observeren en tegelijkertijd fotobleaching te voorkomen. Prikkel de donor en scan naar cellen die het verwachte fluorescentiesignaal van de acceptor bevatten.Selecteer het gebied dat het fluorescentiesignaal van belang bevat. Verkrijg een SE-FRET-beeldreeks door op de drukknop te drukken. Als u parameters voor AB-FRET wilt instellen, gebruikt u de donor- en acceptorkanaalparameters die zijn ingesteld voor SE-FRET, maar schakelt u het FRET-kanaal uit.Bereid u vervolgens voor om de parameters voor fotobleaching van de acceptor mRFP in te stellen. Zorg ervoor dat het bleken begint na vijf afbeeldingen. Sta 200 iteraties toe voor elk bleekmiddel.Houd 100% laserintensiteit op 561 nanometer. Houd een bleekduur van 45 seconden aan. Zorg voor een scansnelheid van 512 bij 512 pixels bij 400 hertz.Zoek en teken het gebied van de cel dat moet worden gebleekt en activeer bleken door op de startexperimentknop te drukken. In het geval van de positieve controle begint na vijf beelden het bleken en wordt het interessegebied groen. Controleer de gemiddelde ROI om te bevestigen dat de intensiteit van mRFP afneemt terwijl die van GFP toeneemt.U kunt ook de lay-out controleren, waaruit blijkt dat mRFP bleek en GFP toenam. Om SE-FRET-gegevens te analyseren, gebruikt u de ImageJ-software. Open de afbeeldingen en maak alleen een stapel donoren.Sla de afbeeldingen in acht bits op als TIF-bestand. Maak op dezelfde manier de stapel alleen voor acceptor en maak vervolgens een gecombineerde stack van donor en acceptor. Gebruik vervolgens de PixFRET-plug-in om afbeeldingen van de SE-FRET-efficiëntie te genereren.Open de gemaakte stapels en genereer de gecorrigeerde FRET-afbeeldingen na aftrek van de spectrale afloop. Presenteer de afbeelding als pseudokleurafbeelding. Om de AB-FRET-gegevens te analyseren, berekent u het percentage AB-FRET als de procentuele toename van de GFP-emissie na mRFP-fotobleaching met behulp van deze formule.Specifieke eiwit-eiwit interactie van de histon deubiquitinase OTLD1 met een transcriptiefactor LSH10 werd bestudeerd door SE-FRET. De celkernen werden tegelijkertijd opgenomen in drie kanalen en er werd een pseudokleurschaal gegenereerd om de SE-FRET-efficiëntie weer te geven. De overgang van blauw naar rood komt overeen met een toename van de FRET-efficiëntie en de nabijheid van eiwitten en eiwitten.De SE-FRET-intensiteit na de co-expressie van LSH10 en OTLD1 was vergelijkbaar met die waargenomen voor de positieve controle mRFP-GFP. Er werd geen SE-FRET waargenomen bij negatieve controles zoals co-expressie van OTLD1, mRFP en LSH4-GFP, of vrije mRFP en LSH10-GFP. AB-FRET-beelden toonden aan dat de co-expressie van LSH10-GFP en OTLD1-mRFP resulteerde in een verhoogde GFP-donorfluorescentie nadat de RFP-acceptor was gefotobleacheerd.Een vergelijkbare toename van donorfluorescentie werd waargenomen in de positieve controle, maar niet in de negatieve controles wanneer de acceptorfluorescentie werd geïnactiveerd. Kwantitatieve analyse van de AB-FRET-gegevens toonde een statistisch significante toename van donorfluorescentie na co-expressie van LSH10 en OTLD1. De positieve controle produceerde een percentage AB-FRET van ongeveer 30%, terwijl de negatieve controles er geen produceerden.SE-FRET en AB-FRET vertoonden een signaal in de celkern dat consistent is met de subcellulaire lokalisatie van de transcriptiefactor histonmodificerende enzymcomplexen en de nucleocytoplasmatische aard van de GFP-MRFP-eiwitten. Het belangrijkste om te onthouden voordat u het protocol volgt, is om te testen in het juiste donoracceptorexpresspaar, afhankelijk van het confocale nanoscopiemodel. Na het uitvoeren en het doen van onze iteratie, is het slechts 24 tot 36 uur om de resultaten te ontvangen.Na het bekijken van deze video, moet men een goed begrip hebben van hoe fret-techniek te gebruiken om eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.

investigating-interactions-between-histone-modifying-enzymes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol wordt beschreven hoe u foto eiwit-eiwit interacties met behulp van een FRET-gebaseerde nabijheid assay.

Imaging eiwit-eiwit interacties In vivo</em

We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

This video describes high-performance fluorescence anisotropy that helps to monitor the interaction between transcription factors and DNA. The assay monitors the interactions of a fluorophore-labeled DNA molecule with its specific transcription factor by measuring the degree of polarization due to molecular rotation or anisotropy of the fluorophore-labeled DNA.

Fluorescence Anisotropy to Determine Transcription Factor-DNA Binding Affinity

Interacties tussen eiwitten zijn fundamenteel voor alle cellulaire processen. Met Bioluminescentie Resonance Energy Transfer, kan de interactie tussen twee eiwitten worden gecontroleerd in levende cellen en in real time. Bovendien kunnen de effecten van potentieel pathogene mutaties worden beoordeeld.

Onderzoeken eiwit-eiwit interacties in levende cellen met behulp van bioluminescentie resonantie energieoverbrenging

Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek voor de identificatie van DNA-bindingsplaatsen van Arabidopsis eiwitten in vivo. Deze procedure omvat chromatine verknoping en fragmentatie, selectieve immunoprecipitatie met antilichamen tegen het eiwit van belang en qPCR analyse van gebonden DNA. We beschrijven een eenvoudige ChIP assay geoptimaliseerd voor Arabidopsis planten.

Chromatine immunoprecipitatie assay voor de identificatie van Arabidopsis eiwit-DNA interacties<em&gt; In Vivo</em

Verordening van de chromatine-milieu is een essentieel proces nodig is voor goede genexpressie. Hier beschrijven we een methode voor het beheersen van de genexpressie door de aanwerving van chromatine-aanpassen machines gen-specifieke en omkeerbare wijze.

Onderdrukken van Gene transcriptie door cellulaire machines met chemische epigenetische Modifiers omleiden

Hier presenteren we een nieuwe methode voor de vaststelling van bindende affiniteiten bij evenwicht en in oplossing met hoge gevoeligheid op grote schaal. Dit verbetert de kwantitatieve analyse van transcriptie factor-DNA-bindende. De methode is gebaseerd op geautomatiseerde fluorescentie anisotropie metingen in een gecontroleerde levering systeem.

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Chromatin immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen van genregulatie. De methode omvat echter moeilijkheden bij het verkrijgen van reproduceerbare chromatine fragmentatie door mechanische afschuiving. Hier bieden we een verbeterd protocol voor een ChIP assay met enzymatische spijsvertering.

Chromatische immunoprecipitatie test met behulp van Micrococcal nucleasen in zoogdiercellen

Deze methode is ontworpen om de vorming van PRC2-gemedieerde chromatine-domeinen in cellijnen te volgen, en de methode kan worden aangepast aan vele andere systemen.

Een methode om de Novo vorming van Chromatin domeinen te bestuderen

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Leer FRET-imaging voor eiwit-eiwitinteracties in levende plantencellen met Nicotiana benthamiana. Deze methode maakt detectie van interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren op nanometerschaal mogelijk.

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht (Video) | JoVE Journal

Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht

Meer video's verkennen