Onderzoek naar interacties tussen histonmodificerende enzymen en transcriptiefactoren in vivo door fluorescentieresonantie-energieoverdracht
14 oktober 2022
Fluorescentieresonantie-energieoverdracht (FRET) is een beeldvormingstechniek voor het detecteren van eiwitinteracties in levende cellen. Hier wordt een FRET-protocol gepresenteerd om de associatie van histonmodificerende enzymen met transcriptiefactoren te bestuderen die ze rekruteren voor de doelpromotors voor epigenetische regulatie van genexpressie in plantenweefsels.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van de vragen in eiwit-eiwitinteractie, stelt ons in staat om direct twee eiwitten te detecteren die zich binnen 10 nanometer van elkaar in levende cellen bevinden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het eenvoudig en gemakkelijk te reproduceren is. Het vereist ook eenvoudige materialen die beschikbaar zijn in veel moderne laboratoria.
Deze maatregel kan worden gebruikt met elk levend weefsel of kweekcel die zich tijdelijk verspreidt op basis van een eiwit van belang. Als u deze techniek voor de eerste keer gebruikt, is het raadzaam om eerst de positieve controle en negatieve controle te gebruiken om het systeem te testen. Om te beginnen, zaai Nicotiana benthamiana zaden in een pot met natte grond met een hoge dichtheid.
Bewaar de geplante zaden in een groeikamer op 23 graden Celsius. Wanneer de diameter van de eufyl 0,3 tot 0,5 centimeter bereikt, breng de zaailingen over naar grotere potten en laat ze in dezelfde kamer met dezelfde parameters groeien. Bereid vervolgens bacteriële cellen voor agro-infiltratie voor door elke agrobacteriekolonie die de FRET-constructies bevat, in te enten in vijf milliliter LB-medium aangevuld met antibiotica en 150 micromolaire acetosyringon.
Incubeer de cultuur 's nachts bij 28 graden Celsius. Na incubatie centrifugeer je de cellen op 3.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspensie van de cellen in agro-infiltratiebuffer tot een OD 600 van 0,5.
Voor agro-infiltratie met dubbele constructie combineert u de geresuspendeerde cellen in een één-op-één volumeverhouding met cellen die de juiste constructies bevatten. Incubeer de cellen bij 28 graden Celsius gedurende 30 minuten tot een uur. Om agro-infiltratie uit te voeren, laadt u de bacteriecultuur in een naaldloze spuit van één milliliter.
Druk het mondstuk van de spuit voorzichtig maar stevig tegen de abaxiale kant van de volledig geëxpandeerde Nicotiana benthamiana bladeren terwijl u het blad met een gehandschoende vinger aan de adaxiale kant vasthoudt. Infiltreer tot vier vlekken op een blad, drie bladeren per plant en twee of drie planten voor elke bacteriecultuur. Onderhoud de agro-geïnfiltreerde planten in dezelfde groeikamer onder dezelfde omstandigheden als eerder beschreven gedurende 24 tot 36 uur.
Gebruik na 24 tot 36 uur infiltratie een scheermesje om elk agro-geïnfiltreerd blad in kleine stukjes van twee bij vier millimeter tussen de aderen te snijden. Leg de bladstukken op een glazen glijbaan met het abaxiale bladoppervlak naar boven gericht. Leg een druppel water op de bladstukken en bedek ze met het afdekglas.
Tik lichtjes op het afdekglas om luchtbellen te verwijderen. Schakel vervolgens de microscoop en laser in. Plaats de dia in de microscooptraphouder.
Als u de parameters voor SE-FRET wilt instellen, opent u de multidimensionale acquisitietool. Stel vervolgens het donorkanaal in voor excitatie en emissie van de donorfluorchroom GFP op een excitatielaser van 405 nanometer en het emissiefilter op 400 tot 597 nanometer. Stel het acceptorkanaal voor excitatie en emissie van de acceptor fluorochrome mRFP en een excitatielaser van 561 nanometer en emissiefilter in op 400 tot 597 nanometer.
Stel het FRET-kanaal in voor excitatie van de donor en emissie van de acceptorfluorchromen met een excitatielaser van 405 nanometer en een emissiefilter van 597 tot 617 nanometer. Stel de intensiteit van de donorexcitatie in op een minimumniveau om FRET te observeren en tegelijkertijd fotobleaching te voorkomen. Prikkel de donor en scan naar cellen die het verwachte fluorescentiesignaal van de acceptor bevatten.
Selecteer het gebied dat het fluorescentiesignaal van belang bevat. Verkrijg een SE-FRET-beeldreeks door op de drukknop te drukken. Als u parameters voor AB-FRET wilt instellen, gebruikt u de donor- en acceptorkanaalparameters die zijn ingesteld voor SE-FRET, maar schakelt u het FRET-kanaal uit.
Bereid u vervolgens voor om de parameters voor fotobleaching van de acceptor mRFP in te stellen. Zorg ervoor dat het bleken begint na vijf afbeeldingen. Sta 200 iteraties toe voor elk bleekmiddel.
Houd 100% laserintensiteit op 561 nanometer. Houd een bleekduur van 45 seconden aan. Zorg voor een scansnelheid van 512 bij 512 pixels bij 400 hertz.
Zoek en teken het gebied van de cel dat moet worden gebleekt en activeer bleken door op de startexperimentknop te drukken. In het geval van de positieve controle begint na vijf beelden het bleken en wordt het interessegebied groen. Controleer de gemiddelde ROI om te bevestigen dat de intensiteit van mRFP afneemt terwijl die van GFP toeneemt.
U kunt ook de lay-out controleren, waaruit blijkt dat mRFP bleek en GFP toenam. Om SE-FRET-gegevens te analyseren, gebruikt u de ImageJ-software. Open de afbeeldingen en maak alleen een stapel donoren.
Sla de afbeeldingen in acht bits op als TIF-bestand. Maak op dezelfde manier de stapel alleen voor acceptor en maak vervolgens een gecombineerde stack van donor en acceptor. Gebruik vervolgens de PixFRET-plug-in om afbeeldingen van de SE-FRET-efficiëntie te genereren.
Open de gemaakte stapels en genereer de gecorrigeerde FRET-afbeeldingen na aftrek van de spectrale afloop. Presenteer de afbeelding als pseudokleurafbeelding. Om de AB-FRET-gegevens te analyseren, berekent u het percentage AB-FRET als de procentuele toename van de GFP-emissie na mRFP-fotobleaching met behulp van deze formule.
Specifieke eiwit-eiwit interactie van de histon deubiquitinase OTLD1 met een transcriptiefactor LSH10 werd bestudeerd door SE-FRET. De celkernen werden tegelijkertijd opgenomen in drie kanalen en er werd een pseudokleurschaal gegenereerd om de SE-FRET-efficiëntie weer te geven. De overgang van blauw naar rood komt overeen met een toename van de FRET-efficiëntie en de nabijheid van eiwitten en eiwitten.
De SE-FRET-intensiteit na de co-expressie van LSH10 en OTLD1 was vergelijkbaar met die waargenomen voor de positieve controle mRFP-GFP. Er werd geen SE-FRET waargenomen bij negatieve controles zoals co-expressie van OTLD1, mRFP en LSH4-GFP, of vrije mRFP en LSH10-GFP. AB-FRET-beelden toonden aan dat de co-expressie van LSH10-GFP en OTLD1-mRFP resulteerde in een verhoogde GFP-donorfluorescentie nadat de RFP-acceptor was gefotobleacheerd.
Een vergelijkbare toename van donorfluorescentie werd waargenomen in de positieve controle, maar niet in de negatieve controles wanneer de acceptorfluorescentie werd geïnactiveerd. Kwantitatieve analyse van de AB-FRET-gegevens toonde een statistisch significante toename van donorfluorescentie na co-expressie van LSH10 en OTLD1. De positieve controle produceerde een percentage AB-FRET van ongeveer 30%, terwijl de negatieve controles er geen produceerden.
SE-FRET en AB-FRET vertoonden een signaal in de celkern dat consistent is met de subcellulaire lokalisatie van de transcriptiefactor histonmodificerende enzymcomplexen en de nucleocytoplasmatische aard van de GFP-MRFP-eiwitten. Het belangrijkste om te onthouden voordat u het protocol volgt, is om te testen in het juiste donoracceptorexpresspaar, afhankelijk van het confocale nanoscopiemodel. Na het uitvoeren en het doen van onze iteratie, is het slechts 24 tot 36 uur om de resultaten te ontvangen.
Na het bekijken van deze video, moet men een goed begrip hebben van hoe fret-techniek te gebruiken om eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een FRET-protocol om eiwitinteracties binnen levende plantencellen te onderzoeken, met specifieke aandacht voor de associatie tussen histon-modificerende enzymen en transcriptiefactoren die betrokken zijn bij genregulatie. Met behulp van Nicotiana benthamiana als modelsysteem, benadrukken de resultaten het potentieel van deze beeldvormingstechniek om eiwit-eiwitinteracties en -dynamica te analyseren.
Belangrijke onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Eiwit-eiwitinteracties
- Regulering van genexpressie
- Epigenetische modificatie in planten
Achtergrond
- Het begrijpen van de associatie van histon-modificerende enzymen met transcriptiefactoren is essentieel voor het verduidelijken van genregulatie.
- De FRET-techniek maakt detectie van interacties binnen nanometerafstand in levende cellen mogelijk.
- Deze methode kan worden gestandaardiseerd voor verschillende biologische toepassingen in plantenonderzoek.
Gebruikte methoden
- Fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET) beeldvorming
- Nicotiana benthamiana als biologisch systeem
- Gebruik van agroinfiltratie voor eiwitexpressie en analyse
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisering van de interactie tussen OTLD1 en LSH10 met behulp van SE-FRET.
- Controle-experimenten bevestigden de specificiteit van de waargenomen interacties.
- Kwantitatieve analyse ondersteunde de conclusies over eiwitproximiteit en interactiedynamica.
Conclusies
- De studie toont het nut van FRET voor het analyseren van eiwitinteracties in plantensystemen.
- Dit onderzoek draagt bij aan het begrip van epigenetische regulatiemechanismen in genexpressie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Directly quantifying interactions between histone modifying enzymes and transcription factors in living cells addresses a critical challenge in target validation for epigenetic drug discovery. FRET-based detection of protein proximity within 10 nm enables mechanistic de-risking and increases predictive confidence in early discovery. This capability supports portfolio decisions by clarifying functional protein complexes relevant to gene regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of protein-protein interactions in native cellular environments.
- Supports functional validation of epigenetic targets by confirming complex formation in vivo.
- Reduces mechanistic ambiguity in pathway analysis for gene regulation.
- Improves predictive confidence for advancing targets into screening pipelines.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated biological systems for downstream compound screening.
- Provides quantitative, reproducible readouts of protein interaction efficiency.
- Enables assay standardization using positive and negative controls for robust data.
- Supports scalability and platform reuse across diverse protein pairs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanistic findings with disease-relevant chromatin regulation pathways.
- Ensures continuity from discovery-stage interaction mapping to preclinical model validation.
- De-risks translational advancement by confirming in vivo relevance of protein complexes.
Pipeline & Workflow Integration
This FRET-based method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing a bridge from hypothesis-driven target validation to quantitative screening workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing direct protein interactions in living tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative FRET efficiency measurements for assay readiness.
- Analytics: Enables statistical comparison of interaction strength across experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic insights to disease-relevant chromatin regulation when supported by biological context.
- Enterprise Reuse: Adaptable to diverse protein pairs and model systems for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in target validation.
- Operational Value: Offers standardized, reproducible protocols compatible with common laboratory infrastructure.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through early mechanistic clarity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of epigenetic targets and complexes for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and protein labeling strategies.
- Needs access to confocal nanoscopy and compatible FRET imaging platforms.
- Demands rigorous use of positive and negative controls for assay standardization.
- Adaptable across plant and potentially mammalian systems with appropriate construct design.
- Dependent on spectral compatibility of donor-acceptor fluorophore pairs and imaging system.
