Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Transgene zebravissen zijn van cruciaal belang gebleken voor ons begrip van de ontwikkeling van embryo's. Het Tol2-systeem is een veelzijdig hulpmiddel waarmee onderzoekers snel en systematisch meerdere transgene zebravissen kunnen genereren voor FASD-studies. Het modulaire ontwerp en het gemak van het genereren van nieuwe kitcomponenten maken het Tol2-systeem een veelzijdig hulpmiddel voor het genereren van nieuwe transgenen zonder dat componenten van de kit opnieuw hoeven te worden ontworpen.

Mijn advies aan onderzoekers die deze techniek voor het eerst uitvoeren, is om verschillende proefritten te maken om te trainen op de precisie van het genereren en injecteren van transgene constructies. Om te beginnen, lineariseer het Tol2-kitplasmide met transposase met een nulrestrictie-endonuclease door 10 microliter transposaseplasmide, 1,5 microliter restrictie-endonucleasereactiebuffer en 0,3 microliter nought one endonuclease in een microcentrifugebuis van 500 microliter te combineren. Vul de reactie tot 20 microliter met RNAse-vrij water.

Meng en verteer 's nachts bij 37 graden Celsius. Stop de volgende dag de spijsvertering door één microliter 0,5 molaire EDTA, twee microliter vijf molair ammoniumacetaat en 80 microliter 100% ethanol aan het reactiemengsel toe te voegen. Mix en koel een nacht af bij min 20 graden Celsius.

Centrifugeer en zuig de volgende dag het supernatant op voordat u de DNA-pellet opnieuw in RNAse-vrij water suspenseert. Bepaal vervolgens de lineaire plasmideconcentratie in nanogram per microliter op een fluorometer door twee microliter van het monster uit te voeren. Stel de SP6-mRNA-productie in door 10 microliter 2X NTP / CAP, twee microliter 10X reactiebuffer, 0,1 tot één microgram lineaire DNA-sjabloon in twee microliter SP6-enzymmengsel in een buis van 500 microliter te combineren.

Vul de reactie tot 20 microliter met RNAse-vrij water en meng voordat je het incubeert bij 37 graden Celsius. Voeg na twee uur een microliter DNAse toe, meng goed en incubeer nog eens 15 minuten. Stop de reactie door 30 microliter lithiumchloride precipitatieoplossing toe te voegen.

Mix en koel een nacht af bij min 20 graden Celsius. Centrifugeer de volgende dag de oplossing om het mRNA te pelleteren en het supernatant op te zuigen voordat u de pellet wast met één milliliter 80% ethanol. Droog de pellet aan de lucht en resuspensie in 20 microliter RNAse-vrij water.

Bepaal de mRNA-concentratie met behulp van een fluorometer, aliquoteer vervolgens 100 nanogram mRNA per buis voor eenmalig gebruik en bewaar bij min 80 graden Celsius. Om de reactie uit te voeren, verzamelt u 10 femtomole elk van P5E, PME en P3E en 20 femtomole van de bestemmingsvector PDEST. Identificeer de grootte van alle vier de vectoren en basenparen van de plasmidebron.

Na het bepalen van de concentratie van alle vier de vectoren, met behulp van het gewicht van DNA als 660 gram per mol en plasmidegrootte en basenparen, berekent u de totale nanogram plasmide die nodig is om 10 femtomole voor invoervectoren of 20 femtomole voor bestemmingsvector te bereiken. Genereer vervolgens de construct sox17:EGFP-CAAX met behulp van de componenten die in het manuscript worden beschreven. Bereken met behulp van de plasmideconcentratie de totale microliter van elk plasmide die nodig is om 10 femtomol of 20 femtomole te bereiken en deel dit vervolgens door twee voor het gebruik in de vijf microliter halve LR-reacties.

Genereer 10 femtomole van P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A)en 20 femtomole van bestemmingsvector. Stel vijf microliter halve LR-reactie in door de volumes van de P5E, PME, P3E en PDEST te combineren in een buis van 500 microliter. Voeg vervolgens steriel water toe om het volume vier microliter te maken.

Vortex het LR-enzym meng twee keer gedurende één minuut elk voordat u een microliter aan de reactie toevoegt en meng grondig voordat u incubeert bij 25 graden Celsius. Stop de volgende dag de LR-reactie door 0,5 microliter proteïnase K.Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius toe te voegen en vervolgens af te koelen tot kamertemperatuur. Transformeer vervolgens drie tot vier microliter van het plasmide in ontdooide chemisch competente cellen door het plasmide toe te voegen en de cellen 25 tot 30 minuten op ijs te laten zitten.

Vervolgens worden de cellen gedurende 30 seconden in een waterbad van 42 graden Celsius door hitte geschud. Voeg na de hitteschok 250 microliter antibioticavrije rijke vloeibare media toe aan de cellen en incuber met schudden bij 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur. Verdeel 300 microliter bacteriële suspensie op één ampicilline Luria-Bertani plaat en incubeer 's nachts.

De volgende dag screent u de kolonies op de aanwezigheid van twee fenotypen: helder en ondoorzichtig. Pluk de heldere kolonies één voor één, ent de vloeibare cultuur en schud 's nachts bij 37 graden Celsius. Combineer 150 nanogram plasmide, 100 nanogram transposase mRNA en 2% fenolrood op ijs.

Voeg vervolgens RNA-vrij water toe om het volume drie microliter te maken. Breng één celstadium-embryo met behulp van transferpipetten over naar de injectieplaat gevuld met EM die de agar volledig bedekt en druk vervolgens voorzichtig ongeveer 50 tot 75 embryo's per sleuf van de injectieplaat aan. Voeg het mRNA plasmide fenolrood mengsel toe aan het open uiteinde van een capillaire injectienaald.

Plaats de capillaire naald in het armatuur van de injectiebank en zet de injectiebank aan. Laat de naald in de injectieplaat zakken en breek de punt met een tang zodat slechts een kleine hoeveelheid mengsel door de injectiebank kan worden weggepompt. Injecteer de embryo's met een bolus van drie nanoliter van het mRNA-plasmide fenolrode mengsel in het cellichaam van het embryo.

Als u klaar bent, verwijdert u de embryo's van de injectieplaat door ze voorzichtig uit de sleuf te halen en ze over te brengen naar een petrischaal van 100 millimeter met verse EM. Incubeer bij 28,5 graden Celsius. Kies het juiste ontwikkelingsstadium voor fluorescerende transgenexpressie en scherm onder een fluorescerende ontleedmicroscoop. Screen op niet-fluorescerende transgenen door screening op fluorescerende transgene markers zoals GFP aangedreven door de hartspecifieke promotor voor het gen Cmlc2.

Wanneer de embryo's die positief zijn voor transgene insertie zich ontwikkelen tot volwassenen en de broedleeftijd bereiken, screent u ze individueel op kiembaantransmissie en transgene expressiviteit door ze te fokken tot zebravissen van het wilde type. Voorbeelden van bacteriekolonies verkregen uit de transformatie van de LR-recombinatie worden getoond. Heldere kolonies bevatten meer dan 85% van de tijd een correct LR-recombinatieproduct, terwijl ondoorzichtige kolonies nooit een correct recombinatieproduct bevatten.

Diagnostische vertering van de drie kolonies door de transformatie van de LR-recombinatieproducten toonde aan dat de enkele ondoorzichtige kolonie geen plasmide bevatte, terwijl de twee heldere kolonies een enkele band bevatten op 9.544 basenpaar. Transposase mRNA op 1.950 basenpaar wordt hier getoond. Mozaïek endoderm EGFP-CAAX expressie werd waargenomen in 75% van de geïnjecteerde embryo's.

Transgene markerexpressie van Cmlc2 EGFP in het zich ontwikkelende hart werd 24 uur na de bevruchting waargenomen. Volwassen zebravissen hadden kiembaantransmissie van sox17:EGFP-CAAX gegenereerde fluorescerende embryo's met het endoderm volledig gelabeld met EGFP-CAAX. Zowel de voorste-achterste lengte van het endoderm als de dorsale-ventrale lengte van elk zakje van zakjes één tot vijf werd gemeten in controle- en ethanolbehandelde wildtype BMP-mutante embryo's.

De totale lengte van het endoderm werd niet beïnvloed door het genotype of de behandeling. Zakjes één en drie vertoonden echter een significante toename van de buidellengte tussen onbehandelde en met ethanol behandelde wilde embryo's, maar significante afnames in lengte tussen onbehandelde en met ethanol behandelde BMP-mutanten. Pouch twee vertoonde significante toenames in buidelgrootte tussen respectievelijk de onbehandelde en met ethanol behandelde wildtype- en BMP-mutantgroepen.

Bij het proberen van deze procedure is het van cruciaal belang om nauwkeurig te zijn in het pipetteren en verdunnen van het Tol2-systeem, evenals het raken van het cellichaam tijdens embryo-injectie.