Name: Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Leer het modulaire Tol2-transgenesesysteem voor transgene zebrafish met gateway-gebaseerde klonering. Deze methode maakt efficiënte generatie van meerdere constructen mogelijk voor FASD-onderzoek en ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 aan C.B.L.

Alle zebravisembryo's die in deze procedure werden gebruikt, werden grootgebracht en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen12. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Louisville.
OPMERKING: De wild-type zebravis stam, AB, en de bmp4st72;smad5b1100 dubbele mutant lijn werden gebruikt in deze studie. Al het water dat bij deze procedure werd gebruikt, was steriel omgekeerde osmosewater. Confocale beelden werden gemaakt onder een laser-scanning confocale microscoop. De endodermmetingen zijn gedaan met behulp van de meettool in ImageJ. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software.
1. Het maken van de oplossingen en media
<ol><li>Bacteriële media: Los LB-bouillon of agar op volgens de instructies van de fabrikant en autoclaaf. Voordat u de media in petrischalen van 100 mm giet, voegt u ampicilline (50 μg / ml), kanamycine (50 μg / ml) of een ampicilline / chlooramfenicolcombinatie (respectievelijk 50 μg / ml en 30 μg / ml) toe.</li>
	<li>Om 20x embryo mediamateriaal te maken, lost u het volgende op in 1 L water: 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl 2, 0,41 g K 2 HPO 4, 0,142 g Na 2 HPO 4 en 4,9 g MgSO 4·7H 2O. Filtersteriliseer de stamoplossing met behulp van een vacuümfiltratiesysteem van 0,22 μm, en bewaren bij 4 °C. OPMERKING: Negeer het witte neerslag dat zich vormt; Dit heeft geen invloed op de media.</li>
	<li>Los in 19 L water 1,2 g NaHCO3 op en voeg 1 L van de 20x embryo media stock toe om de werkende embryo media-oplossing te genereren en houd deze oplossing op 28 °C.</li>
	<li>Los voor 2% fenolrode oplossing 20 mg fenolrood natriumzout op in 1 ml RNase-vrij water en bewaar bij kamertemperatuur.</li>
</ol>2. Embryo spuitgietmatrijzen
<ol><li>Om de agarose-injectieplaat te maken, lost u agarose op in de embryomedia tot een uiteindelijke concentratie van 3% door verhitting tot een kookpunt.</li>
	<li>Giet 50 ml agarose in petrischalen van 100 mm en terwijl de agarose nog vloeibaar is, plaatst u de spuitgietmatrijs voorzichtig in de agarose om bubbelvorming onder de mal te voorkomen.</li>
	<li>Laat de agarose borden afkoelen. Zodra de agarose stevig is, verwijdert u de spuitgietmatrijs en bewaart u deze bij 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik.</li>
</ol>3. Injectiepipetten
<ol><li>Trek capillairen van 1,0 mm (OD) met een gloeidraad in naalden met behulp van een verticale pipettrekker met de solenoïde ingesteld op 2,5 en het verwarmingselement op 14,6. OPMERKING: Elke verwarmde trekker zal werken als het de haarvaten schoon en gelijkmatig in twee naalden trekt, maar de injectienaalden moeten binnen 1 week na het injecteren van de zebravisembryo's worden getrokken voor consistente injectieresultaten.<ol><li>Plaats het capillair in de trekker, draai de klem aan elk uiteinde vast en activeer vervolgens het verwarmingselement.</li>
		<li>Trek aan de haarvaten om twee injectienaalden te maken.</li>
		<li>Verwijder de haarvaten uit de trekker en bewaar ze in een lege petrischaal met een strook boetseerklei die als naaldhouder fungeert.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Transposase mRNA-preparaat
<ol><li>Lineariseer het Tol2Kit-plasmide dat transposase bevat met een NotI-restrictie-endonuclease door het volgende te combineren in een microcentrifugebuis van 0,5 ml: 10 μl transposaseplasmide (150 ng / μl), 1,5 μl restrictie-endonucleasereactiebuffer, 0,3 μl NotI-endonuclease.</li>
	<li>Vul de reactie tot 20 μL met RNase-vrij water en meng en verteer vervolgens een nacht bij 37 °C.</li>
	<li>Stop de transposasevertering door 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH4OAc en 80 μL 100% EtOH toe te voegen aan de verteringsreactie en vervolgens 's nachts te mengen en af te koelen bij −20 °C.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing gedurende 20 minuten bij 4 °C bij 14.000x g en zuig vervolgens het supernatant op en resuspensie de DNA-pellet in RNase-vrij water.</li>
	<li>Bepaal de lineaire plasmideconcentratie in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer door eerst 2 μL van een RNase-vrij water blanco te laten lopen en vervolgens 2 μL van het gelineariseerde plasmide. OPMERKING: De plasmideconcentraties variëren meestal tussen 100-200 ng / μL</li>
	<li>Stel de SP6-mRNA-productie in door de volgende componenten in volgorde te combineren in een microcentrifugebuis van 0,5 ml: 10 μl 2x NTP / CAP, 2 μl 10x reactiebuffer, 0,1-1 μg lineaire DNA-sjabloon en 2 μl SP6-enzymmix.</li>
	<li>Vul de reactie tot 20 μL met RNase-vrij water en meng en incubeer vervolgens bij 37 °C gedurende 2 uur.</li>
	<li>Voeg na 2 uur broeden 1 μL DNase toe, meng goed en incubeer nog eens 15 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Om de SP6-reactie te stoppen, voegt u 30 μL LiCl-precipitatieoplossing toe aan de reactiebuis en mengt en koelt u vervolgens een nacht bij −20 °C.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing op 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het mRNA te pelleteren, en zuig vervolgens het supernatant op en was de mRNA-pellet met 1 ml 80% EtOH (verdund met RNase-vrij water).</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing bij 14.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C om het mRNA te pelleteren en zuig vervolgens het supernatant op. Laat de pellet aan de lucht drogen.</li>
	<li>Resuspensie van de mRNA-pellet in 20 μL RNase-vrij water, bepaal de mRNA-concentratie in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer zoals beschreven in stap 4.5 (moet ten minste 100 ng/μL zijn), aliquot 100 ng mRNA per buis voor eenmalig gebruik, en bewaren bij −80 °C. OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het mRNA niet wordt afgebroken, kan 2 μL mRNA snel worden uitgevoerd op een DNA-elektroforesegel om een enkele band bij 1.950 bps te bevestigen.</li>
</ol>5. Multisite Gateway klonen om invoervectoren voor transgenese te maken
OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van Kwan et al.10, waarbij de LR-reactie wordt geschreven als een half-LR-reactie en met een totaal volume van 5 μL. Om nieuwe invoerelementen te genereren, moeten BP-reacties met behulp van 5', middelste en 3'-donorvectoren10,13 worden gebruikt.
<ol><li>Om de reactie uit te voeren, verzamelt u 10 fmol elk van p5E, pME en p3E en 20 fmol van de bestemmingsvector (pDest). OPMERKING: Multisite LR-recombinatie maakt gebruik van vier verschillende plasmidevectoren: een 5'-ingangsvector (p5E), een middelste ingangsvector (pME), een 3'-invoervector (p3E) en een bestemmingsvector (pDest), om een unieke transgene constructie te genereren geflankeerd door Tol2-herhalingen die klaar zijn om te worden geïnjecteerd in zebravisembryo's.<ol><li>Identificeer de grootte van alle vier vectoren in basenparen uit de plasmidebron (Tabel 1, Tol2Kit Wiki pagina14 of Addgene11; zie de Tabel met materialen). OPMERKING: Voor nieuwe vectoren kan volledige plasmide-sequencing via commerciële sequencingbedrijven de exacte plasmidegrootte in bps bieden.</li>
		<li>Bepaal de concentratie van alle vier de vectoren in nanogram per microliter (ng/μL) met behulp van een fluorometer, zoals beschreven in stap 4.5.</li>
		<li>Met behulp van het gewicht van DNA als 660 g / mol en de plasmidegrootte (in bps), berekent u de totale nanogram (ng) plasmide die nodig is om 10 fmol (invoervectoren) of 20 fmol (bestemmingsvector) te bereiken. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq01.jpg" style="margin: auto;"> OPMERKING: Het Mosimann-laboratorium aan de Universiteit van Colorado, Anschutz Medical Campus, heeft een vrij beschikbare spreadsheet gegenereerd om de benodigde hoeveelheid plasmide (in ng) en het volume (in μL) van de vectoren die nodig zijn in de LR-reactie15 te berekenen.</li>
	</ol></li>
	<li>Om de hieronder beschreven constructie, sox17: EGFPCAAX, te genereren, gebruikt u de volgende vectoren: een p5E-vector met de zebravis sox17-promotor , die 6.918 bp is in grootte16; een pME-vector die de geprenyleerde EGFP bevat, die 3,345 bp is in maat10; een p3E-vector met de SV40 late poly A-signaalreeks, die 2.838 bp is in grootte10; en de pDest, die 5.883 bp is in maat10.</li>
	<li>Bereken met behulp van de plasmideconcentratie bepaald in stap 5.1.2 en de hoeveelheid in nanogram (ng) voor elke vector (stap 5.1.3) de totale microliter (μL) van elk plasmide die nodig is om 10 fmol (invoervectoren) of 20 fmol (bestemmingsvector) te bereiken en deel dit vervolgens door twee voor gebruik in de 5 μL half-LR-reacties (alle onderstaande waarden zijn vermeld in tabel 2). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64679/64679eq02v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li>Om 10 fmol p5E-sox17 te genereren, gebruikt u 45,66 ng (in een concentratie van 140,3 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 4 om 0,65 μL te krijgen.</li>
		<li>Om 10 fmol pME-EGFPCAAX te genereren, gebruikt u 22,08 ng (in een concentratie van 213,5 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 10 om 0,52 μL te krijgen.</li>
		<li>Om 10 fmol p3E-poly A te genereren, gebruikt u 15,73 ng (in een concentratie van 276,1 ng / μL) en verdunt u met steriel water met een factor 20 om 0,57 μL te krijgen.</li>
		<li>Gebruik voor 20 fmol van de bestemmingsvector 77,66 ng pDest (in een concentratie van 307,3 ng/μL) en verdun met steriel water met een factor 5 om 1,63 μL te krijgen.</li>
	</ol></li>
	<li>Om een 5 μL half-LR-reactie op te zetten, combineert u de volumes van de p5E, pME, p3E en pDest bepaald in stap 5.3 in een microcentrifugebuis van 0,5 ml en voegt u vervolgens steriel water toe om een totaal reactievolume van 4 μL te bereiken.</li>
	<li>Draai de LR-enzymmix 2x gedurende 1 minuut krachtig om een goede menging te garanderen en voeg vervolgens 1 μL toe aan de reactie en meng grondig.</li>
	<li>Incubeer bij 25 °C gedurende een nacht (16+ uur).</li>
	<li>Stop de LR-reactie door 0,5 μl proteïnase K (2 μg/μl) toe te voegen, gedurende 10 minuten bij 37 °C te incuberen en vervolgens af te koelen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Transformeer 3-4 μL plasmide in ontdooide, chemisch competente cellen door het plasmide toe te voegen en de cellen 25-30 minuten op ijs te laten zitten.</li>
	<li>Terwijl de cellen op ijs zitten, verwarm je twee LB-ampicilline agarplaten tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Hitteschok de cellen in een waterbad van 42 °C gedurende precies 30 s.</li>
	<li>Voeg na de hitteschok 250 μL antibioticavrije, rijke vloeibare media toe aan de cellen en incubeer met schudden bij 37 °C gedurende 1,5 uur.</li>
	<li>Verdeel 300 μL bacteriën op één ampicillineplaat en incubeer 's nachts bij 37°C.</li>
	<li>De volgende ochtend screent u de kolonies op de aanwezigheid van twee fenotypen, helder en ondoorzichtig, plukt u de heldere kolonies (zoals beschreven in Kwan et al.10) één voor één, ent u de vloeibare cultuur en schudt u vervolgens 's nachts bij 37 °C. OPMERKING: Heldere kolonies bevatten bijna altijd de juiste LR-kolonie (>85% van de tijd).</li>
	<li>Gebruik een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant, voer een plasmidevoorbereiding uit op elke vloeibare cultuur en verteer diagnostisch elk plasmide om de juiste grootte van het transgene construct te bevestigen, wat aangeeft dat de LR-gatewayreactie goed heeft gewerkt.</li>
	<li>Transformeer de juiste transgene constructen opnieuw met behulp van het standaard bacteriële transformatieprotocol zoals beschreven in stap 5.4-5.12 met 0,5-1 μL van het plasmide en incubeer slechts bij 37 °C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Streep de kolonies opnieuw en bevestig dat elk de LR-transgene constructie heeft zoals in stap 5.14.</li>
	<li>Bepaal de plasmideconcentratie zoals beschreven in stap 4.5 (voor de embryo-injectie is ten minste 150 ng/μl nodig).</li>
</ol>6. Injectie van het transgen in de embryo's
<ol><li>Ontdooi een transposase mRNA-monster voor eenmalig gebruik en Tol2-transgene constructie op ijs en voorspoel een agarose-injectieplaat naar kamertemperatuur.</li>
	<li>Combineer het volgende op ijs: 150 ng plasmide, 100 ng transposase-mRNA en 2% fenolrood (0,3 μL). Voeg vervolgens RNA-vrij water toe om het volume aan te vullen tot 3 μL.</li>
	<li>Breng één celstadiumembryo's met behulp van transferpipetten over naar de injectieplaat (beschreven in stap 2) gevuld met EM die de agar volledig bedekt en druk vervolgens voorzichtig ongeveer 50-75 embryo's per sleuf van de injectieplaat.</li>
	<li>Voeg het mRNA/plasmide/fenolrode mengsel toe aan het open uiteinde van een capillaire injectienaald, plaats de capillaire naald in de armatuur van de injectiebank en zet de injectiebank aan. OPMERKING:De injectiebank gebruikt gecomprimeerd gas, zoals lucht, om het gewenste volume (beschreven in stap 6.5) van het mRNA/plasmide/fenolrood mengsel in het embryo te pulseren wanneer het wordt geactiveerd.</li>
	<li>Laat de capillaire naald in de EM van de injectieplaat zakken en breek de punt met een tang om slechts een kleine hoeveelheid mRNA / plasmide / fenolrood mengsel door de injectiebank te laten wegpompen.</li>
	<li>Injecteer de embryo's met een kleine bolus van 3 nL van het mRNA/plasmide/fenolrood mengsel in het cellichaam van het embryo. OPMERKING: Een bolus van 3 nL is een volume mRNA/plasmide/fenolrood mengsel waarbij zeven bolussen theoretisch gelijkelijk over de middellijn van het embryo passen.</li>
	<li>Wanneer u klaar bent met het injecteren van de embryo's, verwijdert u ze van de injectieplaat door ze voorzichtig uit de sleuf te halen en ze over te brengen naar een petrischaal van 100 mm met verse EM (ongeveer 40 ml) en vervolgens te incuberen bij 28,5 ° C om de embryo's te laten ontwikkelen.</li>
</ol>7. Screening van embryo's op transgene inbrenging
<ol><li>Kies voor de expressie van fluorescerende eiwitten het juiste ontwikkelingsstadium waarin het fluorescerende transgen tot expressie moet worden gebracht en screen op de aanwezigheid van fluorescentie onder een fluorescerende ontleedmicroscoop. OPMERKING: Deze embryo's zullen mozaïek zijn in hun expressie en een genomische insertie van het transgene construct vertonen.</li>
	<li>Screen op niet-fluorescerende transgenen door screening op een fluorescerende transgene marker (zoals beschreven in stap 7.1), zoals GFP aangedreven door de hartspecifieke promotor voor het gen cmlc2 of mCherry aangedreven door de lensspecifieke promotor van αcyrstallin, die zich in verschillende bestemmingsvectoren bevinden.</li>
	<li>Laat de embryo's die positief zijn voor transgene inbrenging zich volledig ontwikkelen tot de volwassen zebravisstadia.</li>
	<li>Zodra potentiële transgene vissen de broedleeftijd bereiken, screent u ze individueel op zowel kiembaantransmissie als transgene expressiviteit door ze te fokken tot wildtype zebravissen.</li>
	<li>De volwassenen van wie de embryo's zich normaal ontwikkelen en de sterkste en meest geschikte transgenexpressie geven, worden bewaard als unieke transgene zebravislijnen voor toekomstig werk en analyses. OPMERKING: Als een alternatieve benadering voor screening op de genomische insertie van transgene constructen, ontwerp PCR-primers die alleen het transgene construct versterken en niet wild-type DNA.</li>
</ol>

<ol><li>Denny, L., Coles, S., Blitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+and+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders.</a> American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).</li>
<li>Popova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comorbidity+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%3A+A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).</li>
<li>Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders%3A+Characteristics%2C+complications%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Mental+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment.</a> Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).</li>
<li>Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+presentation%2C+diagnosis%2C+and+management+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder.</a> The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+gene-alcohol+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research%22%5BJournal%5D)">Animal models of gene-alcohol interactions.</a> Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).</li>
<li>Fernandes, Y., Lovely, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Genesis. 59 (11), 23460(2021).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>Choe, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+fluorescent+zebrafish+lines+that+have+revolutionized+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research.</a> Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+A+multisite+gateway-based+construction+kit+forTol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs.</a> Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).</li>
<li>Don, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tol2+gateway-compatible+toolbox+for+the+study+of+the+nervous+system+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease.</a> Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).</li>
<li>Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols">https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols</a> (2017).</li>
<li>The Tol2Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page">http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</a> (2007).</li>
<li>Mosimann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisite+gateway+calculations%3A+Excel+spreadsheet%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet.</a> protocols.io. , (2022).</li>
<li>Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-endodermal+interactions+are+required+for+pancreatic+%CE%B2+cell+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction.</a> Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).</li>
<li>Grevellec, A., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pharyngeal+pouches+and+clefts%3A+Development%2C+evolution%2C+structure+and+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).</li>
<li>Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmp+signaling+mediates+endoderm+pouch+morphogenesis+by+regulating+Fgf+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish.</a> Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).</li>
<li>Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+an+emerging+model+system+in+ecotoxicology+and+toxicology%3A+Historical+review%2C+recent+advances%2C+and+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends.</a> Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).</li>
<li>Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+the+toxicant+screening+model%3A+Transgenic+and+omics+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches.</a> Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+lines+of+transgenic+zebrafish+exhibit+reproducible+patterns+of+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression.</a> Development. 109 (3), 577-584 (1988).</li>
<li>Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication%2C+integration+and+stable+germ-line+transmission+of+foreign+sequences+injected+into+early+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos.</a> Development. 103 (2), 403-412 (1990).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li>
<li>Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2-mediated+transgenesis%2C+gene+trapping%2C+enhancer+trapping%2C+and+Gal4-UAS+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system.</a> Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zebravissen zijn bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de impact van blootstelling aan ethanol op ontwikkeling en ziektetoestanden 7,8. Zebravissen produceren grote aantallen doorschijnende, extern bevruchte, genetisch verhandelbare embryo's, waardoor verschillende transgen-gelabelde weefsels en celtypen tegelijkertijd in meerdere omgevingscontexten live kunnen worden afgebeeld19,20. Deze sterke pu...

Prenatale blootstelling aan ethanol geeft aanleiding tot een continuüm van structurele tekorten en cognitieve stoornissen die foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden genoemd1,2,3,4. De complexe relaties tussen meerdere factoren maken het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD bij mensen een uitdaging. Om deze uitdaging op te lossen, is een grote verscheidenheid aan diermodellen gebruikt. De biologische en experimentele hulpmiddelen die beschikbaar zijn in deze modellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniciteit, en de resultaten van deze modelsystemen zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in humane ethanolstudies 5,6. Onder deze zijn zebravissen naar voren gekomen als een krachtig model om ethanolteratogenese7,8 te bestuderen, deels vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische tractie en doorschijnende embryo's. Deze sterke punten combineren om zebravissen ideaal te maken voor real-time live beeldvormingsstudies van FASD met behulp van transgene zebravislijnen.
Transgene zebravissen zijn op grote schaal gebruikt om meerdere aspecten van de embryonale ontwikkeling te bestuderen9. Het creëren van transgene constructies en daaropvolgende transgene lijnen kan echter buitengewoon moeilijk zijn. Een standaard transgen vereist een actief promotorelement om het transgen en een poly A-signaal of "staart" aan te sturen, allemaal in een stabiele bacteriële vector voor algemeen vectoronderhoud. De traditionele generatie van een multi-component transgeen construct vereist meerdere tijdrovende sub-klonenstappen 10. PCR-gebaseerde benaderingen, zoals Gibson-assemblage, kunnen enkele van de problemen in verband met subklonen omzeilen. Unieke primers moeten echter worden ontworpen en getest voor het genereren van elke unieke transgene constructie10. Naast transgenconstructie zijn genomische integratie, kiembaantransmissie en screening op een goede transgenintegratie ook moeilijk geweest. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van het transposon-gebaseerde Tol2-transgenesesysteem (Tol2Kit)10,11. Dit modulaire systeem maakt gebruik van multisite Gateway-klonen om snel meerdere transgene constructies te genereren uit een steeds groter wordende bibliotheek van "entry" en "destination" vectoren. Geïntegreerde Tol2 transponeerbare elementen verhogen de snelheid van transgenese aanzienlijk, waardoor de snelle constructie en genomische integratie van meerdere transgenen mogelijk is. Met behulp van dit systeem laten we zien hoe de generatie van een endoderm transgene zebravislijn kan worden gebruikt om de weefselspecifieke structurele defecten die ten grondslag liggen aan FASD te bestuderen. Uiteindelijk laten we in dit protocol zien dat de modulaire opzet en de constructie van transgene constructies het op zebravissen gebaseerde FASD-onderzoek enorm zal helpen.

<table><tbody><tr><td>Addgene Tol2 toolbox</td><td>https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Air</td><td></td><td></td><td>Wordt rechtstreeks door de universiteit geleverd</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>BioVision</td><td>2486</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Dissecting Microscope</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Lawson Lab Donor Plasmid Prep</td><td>https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9724</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonase II Plus Enzyme</td><td>Fisher Scientific</td><td>12538200</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Pipette holder</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MIMPH-M-PIP</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 0.5 mL</td><td>VWR</td><td>10025-724</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td><td>VWR</td><td>10025-716</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips 10 μL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips 1000 μL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips 200 μL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet</td><td>https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrophotometer</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>NEB</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red sodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4758-5G</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Micropipette</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pressure Injector</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Stericup.22 μm vacuum filtration system</td><td>Millipore</td><td>SCGPU11RE</td><td></td></tr><tr><td>Tol2 Wiki Page</td><td>http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Top10 Chemically Competent E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Vertical Pipetter Puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish microinjection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>i34</td><td></td></tr></tbody></table>

het zebrafish tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach

Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden gekenmerkt door een zeer variabele reeks structurele defecten en cognitieve stoornissen die optreden als gevolg van prenatale blootstelling aan ethanol. Vanwege de complexe pathologie van FASD zijn diermodellen van cruciaal belang gebleken voor ons huidige begrip van door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten. Zebravissen hebben bewezen een krachtig model te zijn om door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten te onderzoeken vanwege de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling tussen zebravissen en mensen. Als modelsysteem bezitten zebravissen veel eigenschappen die ze ideaal maken voor ontwikkelingsstudies, waaronder grote aantallen uitwendig bevruchte embryo's die genetisch traceerbaar en doorschijnend zijn. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te regelen. Een belangrijk genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is bij zebravissen is transgenese. Het genereren van transgene constructies en het vaststellen van transgene lijnen kan echter complex en moeilijk zijn. Om dit probleem aan te pakken, hebben zebravisonderzoekers het op transposon gebaseerde Tol2-transgenesesysteem opgezet. Dit modulaire systeem maakt gebruik van een multisite Gateway-kloonbenadering voor de snelle assemblage van complete Tol2 transposon-gebaseerde transgene constructies. Hier beschrijven we de flexibele Tol2-systeemtoolbox en een protocol voor het genereren van transgene constructies die klaar zijn voor zebravistransgenese en hun gebruik in ethanolstudies.

Om de transgene constructen te genereren, gebruikten we het Tol2-transgenesesysteem. Drie ingangsvectoren, waaronder p5E, dat de genpromotor/enhancer-elementen bevat, pME, dat het gen bevat dat tot expressie moet worden gebracht door de promotor/enhancer-elementen, en p3E, dat minimaal de polyA-staart bevat, werden gebruikt om het transgene construct te genereren via multisite gateway LR-klonen. De bestemmingsvector, pDest, levert de Tol2-herhalingen voor de genomische insertie van het transgene construct in zeb...

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo's te creëren en te injecteren.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Fetal alcohol spectrum disorders (FASD) are characterized by a highly variable set of structural defects and cognitive impairments that arise due to ...

Transgene zebravissen zijn van cruciaal belang gebleken voor ons begrip van de ontwikkeling van embryo's. Het Tol2-systeem is een veelzijdig hulpmiddel waarmee onderzoekers snel en systematisch meerdere transgene zebravissen kunnen genereren voor FASD-studies. Het modulaire ontwerp en het gemak van het genereren van nieuwe kitcomponenten maken het Tol2-systeem een veelzijdig hulpmiddel voor het genereren van nieuwe transgenen zonder dat componenten van de kit opnieuw hoeven te worden ontworpen.Mijn advies aan onderzoekers die deze techniek voor het eerst uitvoeren, is om verschillende proefritten te maken om te trainen op de precisie van het genereren en injecteren van transgene constructies. Om te beginnen, lineariseer het Tol2-kitplasmide met transposase met een nulrestrictie-endonuclease door 10 microliter transposaseplasmide, 1,5 microliter restrictie-endonucleasereactiebuffer en 0,3 microliter nought one endonuclease in een microcentrifugebuis van 500 microliter te combineren. Vul de reactie tot 20 microliter met RNAse-vrij water.Meng en verteer 's nachts bij 37 graden Celsius. Stop de volgende dag de spijsvertering door één microliter 0,5 molaire EDTA, twee microliter vijf molair ammoniumacetaat en 80 microliter 100% ethanol aan het reactiemengsel toe te voegen. Mix en koel een nacht af bij min 20 graden Celsius.Centrifugeer en zuig de volgende dag het supernatant op voordat u de DNA-pellet opnieuw in RNAse-vrij water suspenseert. Bepaal vervolgens de lineaire plasmideconcentratie in nanogram per microliter op een fluorometer door twee microliter van het monster uit te voeren. Stel de SP6-mRNA-productie in door 10 microliter 2X NTP / CAP, twee microliter 10X reactiebuffer, 0,1 tot één microgram lineaire DNA-sjabloon in twee microliter SP6-enzymmengsel in een buis van 500 microliter te combineren.Vul de reactie tot 20 microliter met RNAse-vrij water en meng voordat je het incubeert bij 37 graden Celsius. Voeg na twee uur een microliter DNAse toe, meng goed en incubeer nog eens 15 minuten. Stop de reactie door 30 microliter lithiumchloride precipitatieoplossing toe te voegen.Mix en koel een nacht af bij min 20 graden Celsius. Centrifugeer de volgende dag de oplossing om het mRNA te pelleteren en het supernatant op te zuigen voordat u de pellet wast met één milliliter 80% ethanol. Droog de pellet aan de lucht en resuspensie in 20 microliter RNAse-vrij water.Bepaal de mRNA-concentratie met behulp van een fluorometer, aliquoteer vervolgens 100 nanogram mRNA per buis voor eenmalig gebruik en bewaar bij min 80 graden Celsius. Om de reactie uit te voeren, verzamelt u 10 femtomole elk van P5E, PME en P3E en 20 femtomole van de bestemmingsvector PDEST. Identificeer de grootte van alle vier de vectoren en basenparen van de plasmidebron.Na het bepalen van de concentratie van alle vier de vectoren, met behulp van het gewicht van DNA als 660 gram per mol en plasmidegrootte en basenparen, berekent u de totale nanogram plasmide die nodig is om 10 femtomole voor invoervectoren of 20 femtomole voor bestemmingsvector te bereiken. Genereer vervolgens de construct sox17:EGFP-CAAX met behulp van de componenten die in het manuscript worden beschreven. Bereken met behulp van de plasmideconcentratie de totale microliter van elk plasmide die nodig is om 10 femtomol of 20 femtomole te bereiken en deel dit vervolgens door twee voor het gebruik in de vijf microliter halve LR-reacties.Genereer 10 femtomole van P5E sox17, PME EGFP-CAAX, P3E Poly(A)en 20 femtomole van bestemmingsvector. Stel vijf microliter halve LR-reactie in door de volumes van de P5E, PME, P3E en PDEST te combineren in een buis van 500 microliter. Voeg vervolgens steriel water toe om het volume vier microliter te maken.Vortex het LR-enzym meng twee keer gedurende één minuut elk voordat u een microliter aan de reactie toevoegt en meng grondig voordat u incubeert bij 25 graden Celsius. Stop de volgende dag de LR-reactie door 0,5 microliter proteïnase K.Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius toe te voegen en vervolgens af te koelen tot kamertemperatuur. Transformeer vervolgens drie tot vier microliter van het plasmide in ontdooide chemisch competente cellen door het plasmide toe te voegen en de cellen 25 tot 30 minuten op ijs te laten zitten.Vervolgens worden de cellen gedurende 30 seconden in een waterbad van 42 graden Celsius door hitte geschud. Voeg na de hitteschok 250 microliter antibioticavrije rijke vloeibare media toe aan de cellen en incuber met schudden bij 37 graden Celsius gedurende 1,5 uur. Verdeel 300 microliter bacteriële suspensie op één ampicilline Luria-Bertani plaat en incubeer 's nachts.De volgende dag screent u de kolonies op de aanwezigheid van twee fenotypen: helder en ondoorzichtig. Pluk de heldere kolonies één voor één, ent de vloeibare cultuur en schud 's nachts bij 37 graden Celsius. Combineer 150 nanogram plasmide, 100 nanogram transposase mRNA en 2% fenolrood op ijs.Voeg vervolgens RNA-vrij water toe om het volume drie microliter te maken. Breng één celstadium-embryo met behulp van transferpipetten over naar de injectieplaat gevuld met EM die de agar volledig bedekt en druk vervolgens voorzichtig ongeveer 50 tot 75 embryo's per sleuf van de injectieplaat aan. Voeg het mRNA plasmide fenolrood mengsel toe aan het open uiteinde van een capillaire injectienaald.Plaats de capillaire naald in het armatuur van de injectiebank en zet de injectiebank aan. Laat de naald in de injectieplaat zakken en breek de punt met een tang zodat slechts een kleine hoeveelheid mengsel door de injectiebank kan worden weggepompt. Injecteer de embryo's met een bolus van drie nanoliter van het mRNA-plasmide fenolrode mengsel in het cellichaam van het embryo.Als u klaar bent, verwijdert u de embryo's van de injectieplaat door ze voorzichtig uit de sleuf te halen en ze over te brengen naar een petrischaal van 100 millimeter met verse EM. Incubeer bij 28,5 graden Celsius. Kies het juiste ontwikkelingsstadium voor fluorescerende transgenexpressie en scherm onder een fluorescerende ontleedmicroscoop. Screen op niet-fluorescerende transgenen door screening op fluorescerende transgene markers zoals GFP aangedreven door de hartspecifieke promotor voor het gen Cmlc2.Wanneer de embryo's die positief zijn voor transgene insertie zich ontwikkelen tot volwassenen en de broedleeftijd bereiken, screent u ze individueel op kiembaantransmissie en transgene expressiviteit door ze te fokken tot zebravissen van het wilde type. Voorbeelden van bacteriekolonies verkregen uit de transformatie van de LR-recombinatie worden getoond. Heldere kolonies bevatten meer dan 85% van de tijd een correct LR-recombinatieproduct, terwijl ondoorzichtige kolonies nooit een correct recombinatieproduct bevatten.Diagnostische vertering van de drie kolonies door de transformatie van de LR-recombinatieproducten toonde aan dat de enkele ondoorzichtige kolonie geen plasmide bevatte, terwijl de twee heldere kolonies een enkele band bevatten op 9.544 basenpaar. Transposase mRNA op 1.950 basenpaar wordt hier getoond. Mozaïek endoderm EGFP-CAAX expressie werd waargenomen in 75% van de geïnjecteerde embryo's.Transgene markerexpressie van Cmlc2 EGFP in het zich ontwikkelende hart werd 24 uur na de bevruchting waargenomen. Volwassen zebravissen hadden kiembaantransmissie van sox17:EGFP-CAAX gegenereerde fluorescerende embryo's met het endoderm volledig gelabeld met EGFP-CAAX. Zowel de voorste-achterste lengte van het endoderm als de dorsale-ventrale lengte van elk zakje van zakjes één tot vijf werd gemeten in controle- en ethanolbehandelde wildtype BMP-mutante embryo's.De totale lengte van het endoderm werd niet beïnvloed door het genotype of de behandeling. Zakjes één en drie vertoonden echter een significante toename van de buidellengte tussen onbehandelde en met ethanol behandelde wilde embryo's, maar significante afnames in lengte tussen onbehandelde en met ethanol behandelde BMP-mutanten. Pouch twee vertoonde significante toenames in buidelgrootte tussen respectievelijk de onbehandelde en met ethanol behandelde wildtype- en BMP-mutantgroepen.Bij het proberen van deze procedure is het van cruciaal belang om nauwkeurig te zijn in het pipetteren en verdunnen van het Tol2-systeem, evenals het raken van het cellichaam tijdens embryo-injectie.

the-zebrafish-tol2-system-modular-flexible-gateway-based-transgenesis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We tonen onze aanpak voor het vinden van potentiële enhancer elementen uit de op ontwikkelingsgebied gereguleerde genen en evalueren van hun functie door middel van mozaïek zebravis transgenese.

Mozaïek zebravis Transgenese voor het evalueren van Enhancer Sequences

In this video, we demonstrate a procedure to generate a stable zebrafish transgenic line constitutively expressing a fluorescent voltage indicator protein following the co-injection of the Tol2 transposon system comprising the transposase mRNA and Tol2 transposon construct encoding the fluorescent voltage indicator.

Tol2 Transposon-Mediated Zebrafish Transgenesis: A Procedure to Generate Transgenic Zebrafish Following the Coinjection of Tol2 System Into Fertilized Zebrafish Embryos

Dit protocol beschrijft de methode van de genetische val insertiemutagenese behulp Gal4-VP16 als primaire verslaggever en GFP / RFP als secundaire verslaggevers in zebravis. Ongeveer een op de tien high-uitdrukken F0 vis opbrengst gene trap nageslacht co-GFP en RFP. De screeningsprocedure kan gemakkelijk worden opgeschaald te passen aan de grootte van het laboratorium dat de insertie mutagenese scherm.

Gene Trapping behulp Gal4 in zebravis

Een Zebrafish-faciliteit die geschikt is voor fokken en in vivo onderzoek wordt op een eenvoudige en betaalbare manier gebouwd. Onderhoud is minimaal. Deze faciliteit is ideaal voor betrokkenheid van studenten en onafhankelijk onderzoek.

Bouw van een betaalbare en makkelijk te bouwen zebravis Facility

Het doel van deze studie is om aan te tonen hoe de mozaïek transgenese strategie kan worden gebruikt bij zebravissen om snel en efficiënt de relatieve bijdragen van meerdere oncogenen in tumorinitiatie en progressie in vivo te beoordelen.

Mozaïek zebravis Transgenese voor Functioneel genomische analyse van de kandidaat-coöperatieve genen in Tumor Pathogenese

Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Het in beeld brengen van het dynamisch gedrag van organellen en andere subcellulaire structuren in vivo kan licht werpen op hun functie in fysiologische en ziektecondities. Hier presenteren we methoden voor het genetisch markeren van twee organellen, centrosomen en mitochondriën, en het in beeld brengen van hun dynamiek in levende zebravis-embryo's met behulp van breedveld- en confocale microscopie.

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.

Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen

Hier, laten we het proces van het creëren van een cellulaire elektrische spanning verslaggever zebrafish lijn om te visualiseren van embryonale ontwikkeling, beweging, en vis tumor cellen in vivo.

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

We beschrijven benaderingen voor het manipuleren van genen in het evolutionair modelsysteem Astyanax mexicanus. Drie verschillende technieken worden beschreven: Tol2-gemedieerde Transgenese, gerichte manipulatie van het genoom met behulp van CRISPR/Cas9 en knockdown van meningsuiting met behulp van morpholinos. Deze hulpmiddelen moeten vergemakkelijken het directe onderzoek van genen die ten grondslag liggen aan de variatie tussen oppervlak - en grot-woning vormen.

Manipulatie van de genfunctie in Mexicaanse Cavefish

Hier presenteren we een protocol om eiwitten te labelen met een fluorescentie-eiwitlabel in zebravislarven, een nieuw ontwikkeld en aangepast in vivo systeem dat vooral nuttig is voor het visualiseren van eiwitten met een lage abundantie in zebravissen.

Fluorescentielabeling om eiwitten met een lage expressie in zebravissen te visualiseren

Leer het modulaire Tol2-transgenesesysteem voor transgene zebrafish met gateway-gebaseerde klonering. Deze methode maakt efficiënte generatie van meerdere constructen mogelijk voor FASD-onderzoek en ontwikkelingsbiologie.

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Meer video's verkennen