Name: Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor het bereiden van single-cell suspensies uit de darm van Nijltilapia (Oreochromis niloticus) met enzymatische dissociatie. Deze methode verbetert single-cell sequencing in aquacultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de steun erkennen van de Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) en het Research Fund Program van Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Alle dierprotocollen tijdens deze studie zijn goedgekeurd door de Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protocolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Goedkeuringsdatum: 2022-03-03). Een lijst van de apparatuur en benodigdheden die in dit experiment zijn gebruikt, is te vinden in de Materiaaltabel. Een samenvatting van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Visbereiding
<ol><li>Verkrijg 6 maanden oude Nijltilapia met een gemiddeld lichaamsgewicht van 100 g uit een betrouwbare bron. Selecteer vissen die vrij zijn van tekenen van ziekte.</li>
	<li>Stop met het voeren van de vis 24 uur voordat u doorgaat naar de volgende stap. OPMERKING: Visvasten vermindert het volume van de darminhoud en vergemakkelijkt de bereiding van darmsegmenten.</li>
	<li>Spoel de vis gedurende 15 minuten in goed belucht steriel water om losjes gebonden bacteriën op het lichaamsoppervlak af te wassen.</li>
	<li>Euthanaseer de vis met 300 mg/L tricaïnemethaansulfonaat (MS-222) gedurende ongeveer 10 minuten totdat alle beweging stopt.</li>
</ol>2. Reagenspreparaat
<ol><li>Bereid 0,08% BSA-Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (BSA-DPBS, voor celspoeling en resuspensie). Los 0,08 g BSA (0,8% m/v) op in 100 ml 1x DPBS. Bewaren bij 4 °C en bij gebruik voorkoelen op ijs. OPMERKING: De toevoeging van BSA is gunstig voor het minimaliseren van celklontering. De BSA-ratio kan worden verhoogd van 0,04% naar 1%, afhankelijk van de celklontercondities.</li>
	<li>Bereid het enzymatische celdissociatiereagens.<ol><li>Verdun het collagenase/dispase met 1x PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/ml (0,1 U/ml collagenase en 0,8 U/ml dispase). Zorg ervoor dat PBS en niet DPBS wordt gebruikt. OPMERKING: PBS levert de calciumionen die nodig zijn om het enzym goed te laten functioneren. DPBS mag niet worden gebruikt in deze stap omdat het Ca 2+/Mg2+ vrij is. Daarnaast wordt collagenase type I gebruikt in het huidige protocol.</li>
		<li>Filtreer de verdunning door een steriel membraanfilter van 0,22 μm.</li>
		<li>Bereid een celdissociatiereagens dat bestaat uit een 95% volume collagenase/dispase oplossing en een 5% volume foetaal runderserum (FBS). OPMERKING: Het dissociatiereagens moet telkens wanneer het wordt gebruikt vers worden gemaakt. Het gebruik van 5% FBS helpt de levensvatbaarheid van de cel tijdens de spijsvertering te behouden.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid trypan blauwe oplossing.<ol><li>Neem de trypan blue oplossing uit de koelkast van 4 °C en houd deze voor gebruik een paar minuten op 15-20 °C om neerslag te voorkomen.</li>
		<li>Filtreer de oplossing door een steriel membraan van 0,22 μm.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Voorbereiding van apparatuur
<ol><li>Koel de gekoelde centrifuge voor gebruik voor tot 4 °C.</li>
	<li>Verkrijg steriele RNase-vrije centrifugebuizen van 1,5 ml, conische buizen van 50 ml, glazen pipetten en uiteinden met brede boring, membraanfilters, celzeven en alle buizen en uiteinden met een lage retentie.</li>
	<li>Autoclaaf glazen pipetten en dissectiegereedschappen, waaronder tangen, scharen en scalpels, en behandel ze voor met de RNase-verwijderingsoplossing om de nadelige effecten van RNase voor eencellige RNA-seq te voorkomen.</li>
</ol>4. Weefseldissectie en celdissociatie
<ol><li>Leg de geëuthanaseerde vis op ijs voor dissectie. Verzamel aseptisch 3-4 cm van het middengedeelte van de darm en snijd zoveel mogelijk vet en mesenterium weg. Verwijder voorzichtig het vet dat aan het darmoppervlak is bevestigd en de laag elastisch en kneedbaar helder slijmvlies met een tang. OPMERKING: Het vet en mesenterium zijn bevestigd aan het buitenoppervlak van de darm.</li>
	<li>Verwijder zoveel mogelijk vet om de nadelige effecten op het dissociatieprotocol te voorkomen. Spoel met behulp van een spuit de fragmenten meerdere keren voorzichtig af met steriel ijskoud PBS om de darminhoud en het slijm af te spoelen. Vermijd ruwe behandeling.</li>
	<li>Ontleed het darmsegment in kleine stukjes en breng ze over in een buis van 1,5 ml gevuld met 1 ml ijskoude PBS.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig en vervang door 1 ml ijskoud 0,08% BSA-DPBS. Resuspensie van de weefselfragmenten door zachte aspiratie met behulp van een glazen pipet. Herhaal deze stap twee keer.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en verteer de weefselfragmenten met 1 ml van het enzymatische dissociatiereagens (950 μL collagenase/dispase-oplossing en 50 μL FBS) in een waterbad van 37 °C gedurende 30-60 minuten.<ol><li>Voeg bovendien 5 μL RNaseremmer (40 E/μL in de stamoplossing) toe aan het dissociatiereagens als de monsters zijn voorbereid voor eencellige RNA-sequencing. OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de collagenase/dispase-mix is 1 mg/ml, inclusief collagenase bij 0,1 U/ml en dispase bij 0,8 U/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Keer de buis handmatig om met intervallen van 5 minuten tijdens het waterbad van 30-60 minuten. OPMERKING: De exacte incubatietijd varieert afhankelijk van de gebruikte weefsels. Controleer de voortgang van dissociatie onder een microscoop totdat er geen bulkweefsel wordt gezien. Plaats 10 μL van de celsuspensie op een glasplaat met een pipet en onderzoek deze onder de microscoop. Verhoog de verteringstijd als de cellen niet volledig gedissocieerd zijn.</li>
	<li>Draai de buisjes gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 300 × g naar beneden en verwijder het enzymatische celdissociatiereagens voorzichtig met behulp van uiteinden met brede boring. Voeg 1 ml ijskoud 0,08% BSA-DPBS toe en pipetteer de cellen voorzichtig op en neer met behulp van een glazen pipet met brede boring gedurende 1 minuut.<ol><li>Herhaal deze stap twee keer. OPMERKING: Pipetteren op en neer moet met zorg worden uitgevoerd met behulp van tips met een brede boring en een lage retentie om celverstoring te voorkomen.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak een celzeef van 40 μm voor met 0,08% BSA-DPBS en plaats deze in een conische buis van 50 ml. Haal de celsuspensie door de zeef. Tik en spoel af met nog eens 200 μL DPBS en verzamel de suspensie aan de onderkant van de buis.</li>
	<li>Breng de suspensie over in een buis van 1,5 ml. Voeg 5 μL DNase I (1 E/μL) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 15-20 °C. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in 400 μL ijskoud DPBS (Ca 2+/Mg2+ vrij). Pipetteer voorzichtig op en neer met brede uiteinden om de cellen te mengen. Herhaal deze stap twee keer.</li>
</ol>5. Kleuring en microscopisch onderzoek
<ol><li>Voor kleuring mengt u de celsuspensie met 0,4% trypanblauwe oplossing in een verhouding van 1:1. Incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 5-10 μL van het mengsel toe aan een hemocytometer en onderzoek onder de microscoop. OPMERKING: Levensvatbare cellen hebben een ongekleurd cytoplasma, terwijl dode cellen een blauw cytoplasma hebben (figuur 2).</li>
	<li>Tel de levensvatbare en dode cellen in drie verschillende velden onder de microscoop. Bereken het levensvatbaarheidspercentage van de cel door het aantal levensvatbare cellen te delen door het totale aantal cellen in een veld. OPMERKING: De levensvatbaarheid van de cel moet meer dan 85% zijn en de celconcentratie mag niet lager zijn dan 1 x 105-1 x 107 / ml. De achtergrond van de celsuspensie moet schoon zijn, zonder klonten, fragmenten of onzuiverheden.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+sequencing%3A+new+developments+and+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The single-cell sequencing: new developments and medical applications.</a> Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+human+skin+identifies+novel+fibroblast+subpopulation+and+enrichment+of+immune+subsets+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Wen, L., Tang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+epigenome+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell epigenome sequencing technologies.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+coupled+with+bioinformatics+reveals+PHYH+as+a+potential+biomarker+in+kidney+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).</li>
<li>Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+for+the+study+of+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease.</a> Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).</li>
<li>Andrews, T. S., Hemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cell+populations+with+scRNASeq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identifying cell populations with scRNASeq.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+new+gill+cell+line+from+the+striped+catfish%2C+Pangasianodon+hypophthalmus+%28Sauvage%2C+1878%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878).</a> Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+high-quality+primary+cell+culture+from+fish+pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+caudal+fin-derived+cell+line%2C+AOF%2C+from+the+Oscar%2C+Astronotus+ocellatus%5BTitle%5D)+AND+%22FishPhysiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus.</a> FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).</li>
<li>Schnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+reconstruction%2C+primary+culture+and+experimental+use+of+rainbow+trout+gill+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia.</a> Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).</li>
<li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li>
<li>Ayyaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+the+regenerating+intestine+reveal+a+revival+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell.</a> Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).</li>
<li>Pan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+neuroepithelial+cells+and+other+cell+types+of+the+gills+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+exposed+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia.</a> Scientific Reports. 12, 10144(2022).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36(2010).</li>
<li>Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+changes+in+cell+shape+and+chromatin+structure+result+in+radiosensitization+of+monolayer+Chinese+hamster+V79+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).</li>
<li>Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+trypsinization+and+alternative+procedures+for+cell+preparation+before+RNA+extraction+on+RNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity.</a> Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+activity+of+smooth+muscle+L-type+Ca2%2B+channels+and+its+reversal+by+NF-kappaB+inhibitors+in+Crohn%27s+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).</li>
<li>Chung, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequences+and+domain+structures+of+mammalian%2C+avian%2C+amphibian+and+teleost+tropoelastins%3A+Clues+to+the+evolutionary+history+of+elastins%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins.</a> Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Merlos-Suárez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+signature+identifies+colorectal+cancer+stem+cells+and+predicts+disease+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).</li>
<li>Glass, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+distinct+population+of+proglucagon-expressing+cells+specific+to+the+mouse+upper+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine.</a> Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
<li>Gu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+size-dependent+effects+of+polystyrene+microplastics+on+immune+and+secretory+cell+populations+from+zebrafish+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines.</a> Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+reveals+a+hepatic+stellate+cell-activation+roadmap+and+myofibroblast+origin+during+liver+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice.</a> Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).</li>
<li>Howard, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Pezoldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+splenic+fibroblasts+reveals+subset-specific+innate+immune+signatures+in+homeostasis+and+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection.</a> Communications Biology. 4 (1), 1355(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Barriga, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mex3a+Marks+a+slowly+dividing+subpopulation+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 30(2016).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+arsenic+and+2%2C2-dichloroacetamide+on+different+cell+populations+of+zebrafish+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver.</a> Science of the Total Environment. 821, 152961(2022).</li>
<li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+world+fisheries+and+aquaculture+2022.+Towards+blue+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agriculture+Organization+of+the+United+Nations+%28FAO%29%22%5BJournal%5D)">The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation.</a> Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).</li>
<li>Beck, B. H., Peatman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeck%2C+BH+%22Mucosal+Health+in+Aquaculture%22">Mucosal Health in Aquaculture</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Lee, H., Engin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+highly+viable+single-cell+suspensions+from+mouse+pancreatic+islets+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100144(2020).</li>
<li>Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+dissociation+protocol+for+generation+of+single+cell+suspension+from+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae.</a> MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Avey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+uncovers+a+robust+transcriptional+response+to+morphine+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia.</a> Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de nile tilapia darm. Vóór dissociatie is de verwijdering van vet en mesenterium uit de darm noodzakelijk, vooral voor vleesetende visdarmen met veel vet. Het gebruik van een spuit in plaats van hard schrapen om de darminhoud af te wassen, vermindert de mechanische schade aan de cellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te garanderen, is het ook essentieel om de temperatuur op 20 °C of lager te houden voor de weefseldissectie- en spoel...

Cellen zijn de fundamentele eenheden van organismen. In vergelijking met bulkweefselstudies kunnen studies op eencellig niveau de heterogeniteit van cellen weerspiegelen en informatie met een hogere resolutie opleveren1. In de afgelopen jaren hebben onderzoekers single-cell sequencing-technologieën toegepast voor genoom-, transcriptoom-, epigenoom- of multi-omic-studies op eencellig niveau bij zoogdieren, zebravissen en andere modelorganismen en rapporteerden grote doorbraken 2,3,4,5,6,7 . Hoewel de meeste studies zich hebben gericht op modelorganismen, zijn er weinig referentieprotocollen of commerciële dissociatiekits voor single-cell sequencing in economische vissoorten, wat de toepassing van single-cell sequencing in aquacultuuronderzoek beperkt. Daarom is het ontwikkelen van weefseldissociatieprotocollen die hoogwaardige eencellige suspensies produceren met een hoge levensvatbaarheid van cellen en nucleïnezuurintegriteit cruciaal.
Het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol met de juiste enzym- of enzymcombinatie om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, is essentieel. Het meest effectieve enzym voor weefseldissociatie varieert afhankelijk van het weefseltype. Bij zoogdieren zijn verschillende enzymen gebruikt om eencellige suspensies te bereiden voor vaste weefsels van zoogdieren, waaronder collagenase, dispase, trypsine, papaïne, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase en trypLE 8,9. Trypsinevertering in combinatie met mechanische verstoring is vaak gebruikt om weefsels te dissociëren voor celkweek in vissen 10,11,12,13,14. Trypsine is ook gebruikt of toegevoegd aan de verteringscocktail voor weefseldissociatie in de rattendarm15 en zebraviskieuwweefsel16. Om verschillende redenen is trypsine echter niet de beste optie voor single-cell sequencing. Trypsine alleen is meestal niet effectief voor weefseldissociatie. Bovendien induceert trypsine DNA-strengbreuken 17,18 en RNA-afbraak19.
Papaïne breekt de eiwitten af die de tight junctions tussen cellen vormen. In zenuw- en gladde spiercellen van zoogdieren is papaïne efficiënter en minder destructief dan andere proteasen20,21. Net als trypsine resulteert papaïne echter in de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van de cellysis die optreedt tijdens enzymatische spijsvertering9. Elastase breekt elastine af, dat meestal wordt aangetroffen in de huid, longen, ligamenten, pezen en vasculaire weefsels22. Het wordt vaak gebruikt in combinatie met collagenase, dispase of trypsine voor het dissociëren van longweefsel8. Hyaluronidase splitst de glycosidische bindingen van hyaluronaat en draagt bij aan de vertering van de extracellulaire matrix in verschillende bindweefsels en huid 9,23.
Over het algemeen zijn collagenase en dispase goede opties voor extracellulaire matrixafbraak. Ze zijn gebruikt bij de dissociatie van menselijke, muis- en zebravisdarmen24,25,26,27. Collagenase vernietigt de peptidebinding in collageen, bevordert de vertering van de extracellulaire matrix en geeft de cellen vrij in suspensie, en dus wordt collagenase vaak gebruikt voor dissociatie van vast weefsel van mens en muis, inclusief voor de lever 28,29, milt30, pancreas31 en darm 25. Dispase is een protease dat de N-terminale peptidebindingen van niet-polaire aminozuurresiduen hydrolyseert en milder is dan collagenase. Het splitst de extracellulaire matrixcomponenten, zoals fibronectine, type IV-collageen en in mindere mate type I-collageen, zonder cel-celverbindingen te beïnvloeden. Dispase wordt afzonderlijk of met andere enzymen gebruikt voor weefseldissociatie, zoals voor darm25,32, hersenen33, lever 34, enz. Bovendien zijn in de handel verkrijgbare digestiecocktails, waaronder liberase, accutase en trypLE, ook goede alternatieven voor dissociatie van vast weefsel, vooral voor de huid, lever en nieren 8,9.
Nijltilapia (Oreochromis niloticus) behoort tot de familie Cichlidae van de orde Perciformes. Het is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten in tropische en subtropische gebieden, met een jaarlijkse productie van 4,5 miljoen ton in 202235. Het is een van de best bestudeerde aquacultuurvissoorten met een goed geannoteerd genoom. Nijltilapia is een ideaal onderzoeksmodel voor aquacultuurvissoorten vanwege de korte generatietijd, het gemak van kweken en het aanpassingsvermogen aan een breed scala aan kweekomgevingen. De darm is van groot onderzoeksbelang omdat het het orgaan is van voedingsvertering en -absorptie, metabolisme en mucosale immuniteit. De darm is de habitat van microbiële populaties en is een essentieel immuunweefsel36. Het is immunologisch actief vanwege de aanwezigheid van talrijke immuunceltypen, waaronder macrofagen, B-cellen, granulocyten en T-cellen.
In de huidige studie hebben we een protocol ontwikkeld voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. Volgens de kenmerken van deze weefselspecifieke enzymen en voorwerk is collagenase/dispase geschikt voor het dissociëren van tilapia-darmweefsel. Het laatste enzymtype waarmee rekening moet worden gehouden bij het bereiden van eencellige suspensies is DNase-I, dat celaggregatie voorkomt door vrij DNA af te breken dat vrijkomt door dode cellyse tijdens enzymatische spijsvertering zonder apoptotische routes te initiëren9 en verhoogt de levende celopbrengst36. Bovendien wordt runderserumalbumine (BSA) aan de wasbuffer toegevoegd om celklontering te verminderen en de levensvatbaarheid van cellen te verbeteren. Verschillende reagensbedrijven beschrijven BSA als een enzymstabilisator. De toevoeging van 0,04%-1% BSA aan PBS (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) is gebruikt om een wasoplossing te ontwikkelen voor het bereiden van eencellige sequencing-suspensies zonder nadelige effecten38. De toevoeging van een lage verhouding BSA kan helpen de levensvatbaarheid van cellen te behouden en de vrije DNA-geïnduceerde aggregatie van cellen als gevolg van cellyse te voorkomen. Dit protocol kan ook een waardevolle referentie zijn voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen uit de darmen van andere aquacultuurvissoorten.

<table><tbody><tr><td>0.22-&mu;m Sterile Filter</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>SLGV033RB</td><td>Het wordt gebruikt om de enzymoplossing te filteren en te steriliseren.</td></tr><tr><td>40-&mu;m Cell Strainer</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>F8200</td><td>Cell Strainer wordt toegepast om onverteerbare weefselstukjes te elimineren.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0098</td><td>Poeder; verdun 0,04 g BSA met 100 ml 1&times; DPBS om 0,04% BSA-DPBS wasbuffer te bereiden. Bewaar bij 2 - 8 &deg;C.</td></tr><tr><td>Collageenase II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>Collageenase/dispase</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/mL.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNase I helpt celklontering te verminderen.</td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS), Ca2+/Mg2+-vrij</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600438</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 0,5 mg/mL.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>Serum, gebruikt in een volume van 5% in de verteringsoplossing.</td></tr><tr><td>Inverteer microscoop</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>Het wordt gebruikt om de celviabiliteit te onderzoeken.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 0,25 mg/mL.</td></tr><tr><td>Nile tilpia (Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td><td>NA</td><td>Gezonde vissen zonder ziektetekens (Gemiddeld lichaamsgewicht: 100 g).&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Gekoelde centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Het wordt gebruikt om het weefsel en celpetje te centrifugeren.</td></tr><tr><td>RNase-remmer</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>RNase-activiteit remmen</td></tr><tr><td>Solid-phase RNase-Be-Gone-reagens</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>Het wordt gebruikt om de RNase uit gereedschappen zoals dissectieschaartjes en glaspipetten te verwijderen. Bewaar bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Voor euthanasie van vissen.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blauw</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>Het wordt gebruikt voor het kleuren van dode cellen.</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607001</td><td>Verdun met PBS tot een eindconcentratie van 1 mg/mL.</td></tr></tbody></table>

single-cell suspension voorbereiding van nile tilapia intestine voor single-cell sequencing

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

Nijltilapia is een van de meest gekweekte zoetwatervissoorten wereldwijd en is een veelgebruikt onderzoeksmodel voor aquacultuurvisstudies. De bereiding van hoogwaardige eencellige suspensies is essentieel voor studies op single-cell niveau, zoals single-cell RNA of genome sequencing. Er is echter geen kant-en-klaar protocol voor aquacultuurvissoorten, met name voor de darm van tilapia. De effectieve dissociatie-enzymen variëren afhankelijk van het weefseltype. Daarom is het optimaliseren van het weefseldissociatieprotocol door de juiste enzym- of enzymcombinatie te selecteren om voldoende levensvatbare cellen met minimale schade te verkrijgen, essentieel. Deze studie illustreert een geoptimaliseerd protocol om een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nile tilapia-darm te bereiden met een enzymcombinatie van collagenase / dispase. Deze combinatie is zeer effectief voor dissociatie met het gebruik van runderserumalbumine en DNase om celaggregatie na de spijsvertering te verminderen. De celoutput voldoet aan de vereisten voor single-cell sequencing, met 90% cel levensvatbaarheid en een hoge celconcentratie. Dit protocol kan ook worden aangepast om een eencellige suspensie uit de darmen van andere vissoorten te bereiden. Dit onderzoek biedt een efficiënt referentieprotocol en vermindert de behoefte aan aanvullende proeven bij de bereiding van eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten.

Dit protocol beschrijft de bereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van de Nijltilapia-darm voor eencellige sequencing (figuur 1). Uit dit onderzoek blijkt dat de collagenase/dispase mix een goed dissociatie effect heeft en mild is voor darmweefsel. De selectie van het optimale verteringsenzym is essentieel voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie. In het voorbereidende werk werden de dissociatie-efficiënties van verschillende veelgebruikte enzymen vergeleken en...

Hier demonstreren we de voorbereiding van een hoogwaardige eencellige suspensie van tilapia-darm voor single-cell sequencing.

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

Dit protocol biedt een betrouwbare referentie voor het bereiden van een hoogwaardige eencellige suspensie uit de Nijltilapia-darm om studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten te vergemakkelijken. De technologie is zeer efficiënt en kan in de meeste laboratoriumomstandigheden worden geïmplementeerd. Het vermindert de noodzaak van aanvullende proeven om eencellige suspensies voor aquacultuurvissoorten te bereiden.Begin met het spoelen van zes maanden oude Nijltilapiavis in goed belucht steriel water gedurende 15 minuten om losjes gebonden bacteriën van het oppervlak af te spoelen. Voor de bereiding van het enzymatische celdissociatiereagens verdunt u de collagenasedispase in PBS tot een eindconcentratie van één milligram per milliliter. Meng 95% volume van de bereide enzymatische oplossing en 5% volume FBS.Vervolgens de centrifuge voor gebruik voorgekoeld tot vier graden Celsius. Voor weefseldissectie plaatst u de geëuthanaseerde vis op ijs en verzamelt u drie tot vier centimeter van de darmen middensectie. Snijd het vet en mesenterium weg met een tang.Verwijder het vet dat aan het darmoppervlak is bevestigd en het elastische en kneedbare heldere slijmvlies. Spoel het darmfragment voorzichtig af met steriele ijskoude PBS met een spuit om de darminhoud en het slijm af te spoelen. Na verschillende wasbeurten ontleed je het fragment in kleine stukjes en breng je ze over in een buis van 1,5 milliliter met één milliliter ijskoude PBS.Centrifugeer het mengsel op 300 x g in vier graden Celsius gedurende vijf minuten. En vervang het supernatant door één milliliter ijskoude 0,08%BSA-DPBS. Gebruik een glazen pipet om de weefselfragmenten voorzichtig te resuspenderen.Nadat u de stukjes nog een keer hebt gewassen, verwijdert u het supernatant en voegt u één milliliter van het bereide enzymatische dissociatiereagens toe. Meng ook vijf microliter RNA-remmer met het dissociatiereagens voor eencellige RNA-sequencing. Plaats de buis op een gehard waterbad van 37 graden Celsius en keer de buis elke vijf minuten handmatig om gedurende de incubatietijd van 30 tot 60 minuten.Zodra de buizen zijn gesponnen, verwijdert u het enzymatische celdissociatiereagens met behulp van uiteinden met een brede boring. Voeg een milliliter ijskoude 0,08% BSA-DPBS toe en pipetteer de cellen voorzichtig op en neer om celverstoring te voorkomen. Na centrifusie en het opnieuw suspuskeren van de cellen nog een keer, plaatst u de 40 micrometer celzeef voorbevochtigd met 0,08% BSA-DPBS op een conische buis van 50 milliliter.Haal de celsuspensie door de zeef. Tik op de zeef, spoel deze vervolgens af met 200 microliter DPBS en verzamel de suspensie aan de onderkant van de buis. Voeg na het overbrengen van de suspensie in een buis van 1,5 milliliter vijf microliter DNA's toe en incuber de suspensie gedurende 15 minuten bij 15 tot 20 graden Celsius.Eenmaal gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de celpellet in 400 microliter ijskoude DPBS zonder calcium- en magnesiumionen. Pipetteer vervolgens voorzichtig op en neer met brede uiteinden om de cellen te mengen en herhaal dit proces nog een keer. Voor kleuring, meng de celsuspensie in 0,4% trypan blauwe oplossing in een gelijke verhouding en incubeer gedurende drie minuten bij kamertemperatuur.Voeg vervolgens 10 microliter van het mengsel toe op de glasplaat. Tel de levensvatbare en dode cellen onder de microscoop in drie velden en bereken het levensvatbaarheidspercentage van de cel. De dissociatie-efficiëntie van verschillende veelgebruikte enzymen werd vergeleken.Van de collagenase dispase-mix werd geverifieerd dat deze een beter dissociatie-effect had dan de collagenase dispase of trypsine alleen en verschillende andere enzymmengsels. Het microscopisch onderzoek toonde aan dat de darmcellen een hoge levensvatbaarheid hadden en zich als afzonderlijke cellen verspreidden. De meeste cellen waren levensvatbaar, terwijl een paar dood waren gekleurd vanwege het gepermeabliseerde celmembraan.Let op het type PBS dat wordt gebruikt. Enzymatische verteringsoplossing kan niet worden gebruikt met calcium / magnesiumvrije PBS omdat het enzym calcium / magnesiumionen nodig heeft om effectief te functioneren. De procedure vergemakkelijkt studies op eencellig niveau in aquacultuurvissoorten en biedt een waardevolle referentie voor het ontwikkelen van celdissociatieprotocollen van aquacultuurvissoorten.

single-cell-suspension-preparation-from-nile-tilapia-intestine-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

IL-9-tot expressie brengende T- en ILC2-cellen worden geïnduceerd tijdens N. brasiliensis-infectie , maar hun karakterisering is grotendeels over het hoofd gezien in de geïnfecteerde darm vanwege hun lage frequentie en differentiële kinetiek. Dit protocol beschrijft de isolatie van deze cellen uit verschillende doelorganen en de bevestiging van hun identiteit via flowcytometrie in verschillende infectiestadia.

Een strategie voor de studie van IL-9-producerende lymfoïde cellen in het Nippostrongylus brasiliensis infectiemodel

Hier presenteren we een protocol om kernen te isoleren uit de hersenen van het kortlevende gewervelde model Nothobranchius furzeri voor downstream toepassingen zoals single-nucleus RNA sequencing of single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-seq).

Zachte isolatie van kernen uit het hersenweefsel van volwassen Afrikaanse turquoise killivissen, een natuurlijk kortlevend model voor verouderingsonderzoek

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren van kernen uit flash-bevroren, gearchiveerde leverweefsels voor single-nucleus RNA-seq, ATAC-seq en gezamenlijke multiomics (RNA-seq en ATAC-seq).

Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Hier beschrijven we een tweestaps celverteringsprotocol voor het bereiden van een eencellige suspensie van de halsslagaders van muizen.

Bereiding van een eencellige suspensie uit halsslagaders van muizen voor eencellige sequencing

Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

Het protocol combineert menselijke darmorganoïdetechnologie met transcriptomische analyse van één cel om aanzienlijk inzicht te geven in voorheen onontgonnen darmbiologie.

Menselijke darmorganoïden gebruiken om het epitheel van de dunne darm te begrijpen op transcriptioneel niveau van één cel

Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.

Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing

Leer een betrouwbaar protocol voor het bereiden van single-cell suspensies uit de darm van Nijltilapia (Oreochromis niloticus) met enzymatische dissociatie. Deze methode verbetert single-cell sequencing in aquacultuur.

Single-Cell Suspension Voorbereiding van Nile Tilapia Intestine voor Single-Cell Sequencing

Meer video's verkennen