HPLC in combinatie met chemische vingerafdrukken voor multi-patroonherkenning voor het identificeren van de authenticiteit van Clematidis Armandii Caulis

Dit protocol kan een nieuwe strategie bieden voor het effectief identificeren van de echte materialen van Clematidis armandii caulis en zijn overspeligen. Deze methode kan worden gebruikt in onderzoek naar de kwaliteit van medicinale materialen en biedt een referentie voor het bestuderen van de kwaliteitsnormen van andere Chinese medicinale materialen. Om de monstervoorbereiding te beginnen, maalt u de grondstof tot een uniforme deeltjesgrootte door ze door een nylon gaas met een geschikte binnendiameter te laten gaan.

Breng nauwkeurig twee gram van de gemalen grondstof in een gestopte erlenmeyer van 50 milliliter voordat 50 milliliter methanol aan de kolf werd toegevoegd. Plaats de stop op de kolf in ultrasoon verwarmd op 600 watt en 40 kilohertz gedurende 30 minuten. Zeef aan het einde van de incubatie de medicinale extractoplossing door het filterpapier.

Breng na het persen vier milliliter van de methanoloplossing met de medicinale extracten over in een maatkolf van 10 milliliter. Voeg er vervolgens zes milliliter water aan toe en meng de oplossing. Laat de oplossing 10 minuten bezinken.

Voor HPLC-analyse van de monsters. Begin met het voorbereiden van de mobiele fasen en stel het HPLC-verloopprogramma in zoals beschreven in het manuscript. Filtreer het monster door een 0,45 micro poreus filtermembraan en onderwerp het aan HPLC-analyse.

Voer voor elk monster zes keer per dag een analyse uit. Om de stabiliteit van de monsteroplossing te evalueren, analyseert u dezelfde monsteroplossing die gedurende 0, 2, 4, 6, 8, 12 en 24 uur na bereiding bij kamertemperatuur is opgeslagen. Neem zes replica's van hetzelfde monster en detecteer de vingerafdruk in HPLC.

Importeer de relevante gegevens in de software met de naam Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine of SESCF TCM versie 2012. Importeer de retentietijd en het piekgebied voor alle 10 batches authentieke Chuanmutong-monsters en vijf partijen overspelige stoffen in SESCF TCM voor analyse. Klik in het hoofdmenu op het ingestelde referentiespectrum en ga naar het venster met parameterinstellingen om de referentiechromatografische vingerafdruk van de authentieke soort Chuanmutong als referentie in te stellen.

Stel vervolgens de methode voor het genereren van besturingsspectrum in als de mediane methode met de tijdvensterbreedte van 0,5. Klik vervolgens op meerpuntskalibratie in het hoofdmenu, selecteer de pieken en selecteer vervolgens de optie piekovereenkomst als gemarkeerde pieken. Klik ten slotte op Gelijkenis berekenen om een gelijkenisanalyse van de monsters uit te voeren op basis van de referentiechromatogramafdrukken van Chuanmutong.

Om systemische clusteranalyse uit te voeren, opent u relevante statistische analysesoftware en klikt u op bestand om de gegevens van 10 batches authentieke monsters en vijf batches overspelige stoffen in de software te importeren. Ga in het menu onder het tabblad Classificatie naar Analyse en systeemclustering. Selecteer de gemeenschappelijke piekgebieden van 10 partijen authentieke monsters en vijf partijen overspelige stoffen als variabelen.

Stel het aantal clusters in op vier. Klik vervolgens op Methode om de clustermethode als intergroepverbinding te selecteren. Kies het meetinterval als Pearson-correlatie en gebruik het tabblad OK om de clusteranalysekaart te tekenen.

Voor principecomponentenanalyse of PCA opent u de software voor gegevensanalyse. Klik op bestand in het menu en maak een nieuw regulier project. Importeer het piekgebied van 12 veelvoorkomende pieken in een Excel of vergelijkbare spreadsheet uit het HPLC-systeem.

Druk op de knop Voltooien om de gegevensimport te voltooien. Om het modeltype met PCA in te stellen, klikt u op Nieuw om een nieuw model te maken en vervolgens de gegevens te passen met behulp van autofit en tabbladen toe te voegen. Ga naar scores om de PCA-scorekaart te krijgen.

Om de Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis of OPLSDA te gebruiken. Genereer de PCA-scorekaart zoals eerder gedemonstreerd. Stel het modeltype in met de OPLSDA door te klikken op Nieuw en Nieuw als model één Voordat u gaat schalen in het selecteren van par voor iedereen, drukt u vervolgens op AutoFit in scores om de OPLSDA-scorekaart te genereren.

Om het variabele belang en de projectie te schatten, gaat u naar het softwaremenu voor gegevensanalyse en gaat u naar Analyseren, gevolgd door het aantal in te stellen op 200 onder per mutaties. Verkrijg de R-kwadraat- en Q-kwadraatwaarden uit de OPLSDA-score en klik op VIP- en VIP-voorspellend om de VIP-kaart te krijgen. HPLC-vingerafdrukken van de 10 authentieke Chuanmutong-monsters toonden 12 verschillende gemeenschappelijke pieken waarvan de relatief grote en goed opgeloste.

Piek nummer 10 werd gebruikt als referentiepiek om de relatieve retentietijden van de rustpieken te schatten. De authentieke monsters vertoonden gelijkenisgraden die zeer dicht bij een van de overeenkomsten in goede consistentie impliceren. De gelijkenisgraden tussen de vijf partijen overspeligen en de controle-Chuanmutong waren echter vrij laag.

De HPLC-vingerafdrukken van de vijf overspeligen bleken af te wijken van de authentieke monsters, voornamelijk in de regio met bewaartijden variërend van 28 tot 55 minuten. PCA toonde een duidelijke overeenkomst tussen de authentieke rassen en hun verschil met de overspelige stoffen, behalve voor de overspelige CC.Vergelijkbare resultaten werden ook verkregen uit clusteranalyse wanneer de classificatieafstand 20 was. De scorematrix gegenereerd op basis van OPLSDA gaf geen kruising aan tussen de monsterpunten van authentieke monsters en de overspeligen.

Nogmaals, overspelige CC leek meer op de authentieke variëteiten dan de andere overspelige stoffen. Volgens de VIP-kaart werden de pieken met waarden groter dan één geïdentificeerd als de belangrijkste markercomponenten die het verschil veroorzaken tussen authentieke monsters en de overspeligen. Het gehalte aan bèta-sitosterol, een actief bestanddeel in Chuanmutong, werd gedetecteerd in alle vijf partijen overspelige stoffen, maar de inhoud varieerde sterk.

Dit protocol stelt verschillende analysemethoden vast om alle informatie over medicinale materialen vanuit meerdere hoeken weer te geven en overal de authenticiteit van Chuanmutong medicinale materialen te schatten.