Name: Malachiet Green Assay voor de ontdekking van heat-shock eiwit 90-remmers (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Leer de malachietgroen-assay voor de ontdekking van Hsp90-remmers in kankeronderzoek. Deze eenvoudige, gevoelige methode detecteert anorganisch fosfaat en ondersteunt high-throughput screening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door het Korea Research Fellowship (KRF) -programma, postdoctoraal fellow van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). De auteurs zijn KIST intramurale subsidie en ministerie van Oceanen en Visserij subsidienummer 2MRB130 dankbaar voor het verstrekken van financiële steun voor dit project.

1. Malachiet groene test op laboratoriumschaal
<ol><li>Voorbereiding van de testbuffer<ol><li>Bereid de testbuffer voor, volgens de samenstelling en het preparaat in tabel 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Opstellen van fosfaatnormen<ol><li>Gebruik de fosfaatstandaard van 1 mM, geleverd in de alachietgroene testfosfaattestkit (bewaard bij 4 °C).</li>
		<li>Pipetteer 40 μL van 1 mM fosfaatstandaard in 960 μL ultrazuiver water om 40 μM fosfaatoplossing (premixoplossing) te verkrijgen. Voeg de premixoplossing toe met ultrazuiver water, volgens de instructies van de fabrikant, om een seriële verdunning van fosfaat van 0 tot 40 μM te vormen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van gist Hsp90<ol><li>Gebruik gist Hsp90 met een glycerolvoorraadconcentratie van 0,66 mg/ml. Ontdooi op ijs vlak voor gebruik.</li>
		<li>Gebruik 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gist Hsp90 voor meetbare ATPase-activiteit. Controleer of het optische dichtheidsverschil na toevoeging van malachietgroen reagens tussen de blanco en positieve controle ten minste 0,5 en minder dan 1,0 bedraagt. Hier bleek het absorptieverschil tussen de blanco (zonder Hsp90) en positieve controle (met Hsp90) 0,510 te zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van ATP<ol><li>Breng 1 mg ATP over in een injectieflacon met 453,39 μl ultrazuiver water om 4 mM stamoplossing te verkrijgen. Voer gewichtsberekeningen uit op basis van watervrije ATP (molecuulgewicht [m.w.] = 551,14). Bereid ATP vers, omdat het na verloop van tijd spontaan kan hydrolyseren.</li>
		<li>Voeg 4 μL ATP-stamoplossing toe aan elke put om een uiteindelijke putconcentratie van 0,2 mM te verkrijgen (uiteindelijk totaal testputvolume van 80 μL). Voeg ATP als laatste component toe aan de reactie, met behulp van een meerkanaalspipet, zodat alle reacties tegelijkertijd beginnen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van geldanamycine (GA)<ol><li>Bereid een voorraad GA van 10 mM door 1 mg op te lossen in 178,37 μL DMSO (m.w. = 560,64). Bereid met behulp van de stamoplossing 4 mM, 0,8 mM, 0,16 mM, 0,032 mM, 0,0064 mM en 0,00128 mM-oplossing in DMSO door seriële verdunning.</li>
		<li>Voeg 2 μL van deze stamoplossingen toe aan elke put om een uiteindelijke putconcentratie van respectievelijk 0,1 mM, 0,02 mM, 0,004 mM, 0,0008 mM, 0,00016 mM en 0,000032 mM te verkrijgen.</li>
		<li>Bereid de putten voor zoals beschreven in tabel 2 en tabel 3, met de putten die de blanco (buffer + water + DMSO) en negatieve controle (Hsp90 in buffer + water + DMSO) bevatten. De putten met GA (Hsp90 in buffer + water + GA) dienen als positieve controle.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van putplaten en volgorde van toevoeging<ol><li>Bereid borden met 96 putten voor met de lay-out in tabel 2. Voor verbindingen die absorptie vertonen bij 620 nm, bereidt u een aparte put voor voor het registreren van de absorptie op deze golflengte. Bereid geen aparte put voor GA, omdat GA geen absorptie vertoont bij 620 nm voor de concentratie die in de test wordt gebruikt.</li>
		<li>Bereid elk bestanddeel met het totale volume van elk bestanddeel, zoals weergegeven in tabel 3.</li>
		<li>Stel testputten in door ultrazuiver water aan elke put toe te voegen. Voeg hierna de vereiste hoeveelheid testbuffer en een samengestelde oplossing (bijvoorbeeld GA-oplossing) toe.</li>
		<li>Voeg vervolgens Hsp90 toe aan de juiste putten en schud de platen gedurende 2 minuten op een plaatschudder bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Voeg 4 μL ATP-oplossing toe met behulp van een meerkanaals pipet. Wikkel de plaat in aluminiumfolie en schud gedurende 2 minuten op een plaatschudder (200 rpm) bij kamertemperatuur. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 3 uur.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding en toevoeging van malachietgroen reagens<ol><li>Het malachietgroene reagens bestaat uit reagentia A (ammoniummolybdaat in 3M HCl) en B (malachietgroen en polyvinylalcohol). Breng het reagens voor gebruik op kamertemperatuur. Meng reagentia A en B in een verhouding van 100:1 (1.000 μL:10 μL). Bereid dit binnen 3 uur voor gebruik voor, omdat het onstabiel is en na 3 uur begint te ontbinden.</li>
		<li>Stop na 3 uur van stap 1.6.5 de reactie door 20 μL malachietgroen reagens toe te voegen, toegevoegd in dezelfde volgorde als ATP, met behulp van een meerkanaalspipet.</li>
		<li>Meet na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur de absorptie van de plaat bij 620 nm in een plaatlezer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. High-throughput screening van Hsp90-remmers door malachiet groene assay
OPMERKING: Het protocol voor screening met hoge doorvoer is vergelijkbaar met de methodologie op laboratoriumschaal. Het uiteindelijke putvolume is in elk geval 80 μL. Er is echter een klein verschil in de volgorde van de toevoeging van reagentia. In de op laboratoriumschaal gebaseerde methode zijn er vijf stadia van toevoeging van de oplossing (34 μL water, 32 μL buffer, 2 μL-verbinding in DMSO, 8 μL Hsp90 en ten slotte 4 μL ATP-oplossing). Bij HTS daarentegen zijn er drie stadia van toevoeging (40 μL bufferoplossing met gist Hsp90, 2 μL DMSO in 18 μL water dat de verbindingen bevat, en ten slotte 20 μL ATP opgelost in water). De minimale hoeveelheid oplossing die nauwkeurig kan worden gepipetteerd in de HTS-opstelling is 20 μL. Vandaar dat een verschil in pipetteren tussen laboratorium- en HTS-schalen wordt waargenomen.
<ol><li>Bereiding van de testbuffer (pH 7,4)<ol><li>Gebruik dezelfde buffer in HTS als voor de malachietgroene test op laboratoriumschaal (tabel 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van gist Hsp90<ol><li>Gebruik eiwit met een glycerolvoorraadconcentratie van 0,66 mg / ml. Ontdooi op ijs vlak voor gebruik.</li>
		<li>Gebruik 8 μL (5,98 μg, 0,80 μM) gist Hsp90 in elk putje, wat meetbare ATPase-activiteit oplevert.</li>
		<li>Verdun het eiwit (8 μL) in buffer (32 μL) voor elk putje. Het uiteindelijke totale werkvolume voor elke put is 40 μL bij een totaal testvolume van 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van 0,8 mM ATP<ol><li>Los 1 mg ATP op in 2.267 μL gedestilleerd water om een oplossing van 0,8 mM te verkrijgen. Het totale werkvolume voor elke put is 20 μL bij een totaal testvolume van 80 μL.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van geldanamycine (GA)/teststoffen<ol><li>Bereid een voorraad GA van 0,8 mM voor in DMSO, zoals in stap 1.5. Verdun 10 μL van de GA-bouillon met 90 μL water tot een eindconcentratie van 80 μM.</li>
		<li>Gebruik 20 μL van de 80 μM GA-oplossing in geschikte testputten (eindtotaal testputvolume = 80 μL), wat een uiteindelijke putconcentratie van 20 μM oplevert. Dit dient als een positieve controle.</li>
		<li>Bereid voor teststoffen oplossingen in DMSO volgens de gewenste concentratie voor evaluatie.</li>
		<li>Bereid 10 μL DMSO voor in 90 μL water voor toevoeging aan blanco (buffer + water + DMSO) en negatieve controleputten (Hsp90 in buffer + water + DMSO). Bereid de teststoffen op vergelijkbare wijze bij een uiteindelijke putconcentratie van 100 μM.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontwerp van de testplaten en volgorde van toevoeging<ol><li>Gebruik vier hoofdplaten, één samengestelde plaat en vier additieplaten met voorraden reagentia om de bepaling op te zetten (figuur 2 en tabel 4).</li>
		<li>Voeg bovendien op plaat A 90 μL testbuffer toe in elk put; voeg bovendien plaat B 90 μL buffer met Hsp90 toe in elk putje; voeg bovendien in de platen C en D respectievelijk 90 μl ATP en 90 μl malachietgroen reagens toe in elk putje (tabel 5 en tabel 6).</li>
		<li>Breng vanaf additieplaat A en plaat B 40 μL oplossing over van elke put naar hoofdplaat 1 en 2, respectievelijk 3 en 4, met behulp van een geautomatiseerd meerkanaals doseersysteem. Hier is gebruik gemaakt van het Biomek(R) FXP laboratoriumautomatiseringswerkstation (figuur 2 en tabel 6).</li>
		<li>Breng vanuit elk putje van de samengestelde plaat 20 μL van de oplossing over naar de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2). Schud de platen gedurende 1 minuut in een shaker (200 rpm).</li>
		<li>Breng vanuit elk putje van de additieplaat C (ATP) 20 μL oplossing over op de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2). Schud de platen gedurende 1 minuut in een shaker (200 rpm).</li>
		<li>Incubeer de platen gedurende 3 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Bereid het malachietgroene reagens volgens stap 1.7. Breng na 3 uur 20 μL malachietgroen reagens van additieplaat D over in de putjes van de hoofdplaten 1, 2, 3 en 4 (figuur 2).</li>
		<li>Meet na een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur de absorptie van de plaat bij 620 nm in een plaatlezer.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Workman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+attack+on+multistep+oncogenesis+by+inhibiting+the+Hsp90+molecular+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone.</a> Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).</li>
<li>Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90+at+the+hub+of+protein+homeostasis%3A+emerging+mechanistic+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).</li>
<li>Mahalingam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+HSP90+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting HSP90 for cancer therapy.</a> British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).</li>
<li>Dutta Gupta, S., Pan, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+update+on+discovery+and+development+of+Hsp90+inhibitors+as+senolytic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+HSP90+inhibitors+as+a+novel+class+of+senolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics.</a> Nature Communications. 8 (1), 422(2017).</li>
<li>Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp90+inhibitors+as+senolytic+drugs+to+extend+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging.</a> Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).</li>
<li>Pearl, L. H., Prodromou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).</li>
<li>Park, H. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unleashing+the+full+potential+of+Hsp90+inhibitors+as+cancer+therapeutics+through+simultaneous+inactivation+of+Hsp90%2C+Grp94%2C+and+TRAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1.</a> Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).</li>
<li>Hoy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pimitespib%3A+first+approval%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Pimitespib: first approval.</a> Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).</li>
<li>Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+heat+shock+protein+HSP90-pp60v-src+heteroprotein+complex+formation+by+benzoquinone+ansamycins%3A+essential+role+for+stress+proteins+in+oncogenic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).</li>
<li>Rowlands, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+assay+for+inhibitors+of+heat-shock+protein+90+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity.</a> Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).</li>
<li>Sheikha, G. A., Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+sulfonamide+drugs+inhibit+ATPase+activity+of+heat+shock+protein+90%3A+investigation+by+docking+simulation+and+experimental+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Docking+and+pharmacophore+mapping+of+halogenated+pyridinium+derivatives+on+heat+shock+protein+90%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+and+Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90.</a> Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elaborate+ligand-based+modeling+reveals+new+nanomolar+heat+shock+protein+90%CE%B1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+exploration+of+new+pyridinium-based+HSP90%CE%B1+inhibitors+tailored+to+thiamine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Chemistry+Research%22%5BJournal%5D)">Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure.</a> Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).</li>
<li>Al-Sha'er, M. A., Taha, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+docking-based+comparative+intermolecular+contacts+analysis+to+validate+Hsp90%CE%B1+docking+studies+and+subsequent+in+silico+screening+for+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Modeling%22%5BJournal%5D)">Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors.</a> Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).</li>
<li>Dutta Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%2C4-dihydroxy+benzaldehyde+derived+Schiff+bases+as+small+molecule+Hsp90+inhibitors%3A+rational+identification+of+a+new+anticancer+lead%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead.</a> Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).</li>
<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+malachite+green+assay+of+phosphate%3A+mechanism+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application.</a> Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).</li>
<li>Gupta, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking+study%2C+synthesis+and+biological+evaluation+of+Mannich+bases+as+Hsp90+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+established+drugs+as+SARS-CoV-2+PLpro+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors.</a> Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).</li>
<li>Giri, A. K., Ianevski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+drug+discovery+targeting+the+cancer+cell-microenvironment+interactions+in+hematological+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).</li>
<li>Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMahapatra%2C+DK+%22Advanced+Studies+in+Experimental+and+Clinical%22">Advanced Studies in Experimental and Clinical</a>. , Apple Academic Press. 107-122 (2021).</li>
<li>Jaeger, A. M., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP90%3A+enabler+of+cancer+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">HSP90: enabler of cancer adaptation.</a> Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).</li>
<li>Yang, S., Xiao, H., Cao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+heat+shock+proteins+in+cancer+diagnosis%2C+prognosis%2C+metabolism+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074(2021).</li>
<li>Mishra, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+Hsp90%CE%B2-selective+inhibitors+to+overcome+detriments+associated+with+pan-Hsp90+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).</li>
<li>Khandelwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-guided+design+of+an+Hsp90beta+N-terminal+isoform-selective+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor.</a> Nature Communications. 9 (1), 425(2018).</li>
<li>Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+selective+are+Hsp90+inhibitors+for+cancer+cells+over+normal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells.</a> ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).</li>
<li>Panaretou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+binding+and+hydrolysis+are+essential+to+the+function+of+the+Hsp90+molecular+chaperone+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo.</a> The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).</li>
<li>Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+design+and+development+strategies+for+finding+Hsp90+inhibitors+and+their+role+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases.</a> Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747(2021).</li>
<li>Howes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+polarization+assay+for+inhibitors+of+Hsp90%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90.</a> Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).</li>
<li>Opalińska, M., Jańska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAA+proteases%3A+guardians+of+mitochondrial+function+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis.</a> Cells. 7 (10), 163(2018).</li>
<li>Ambrose, A. J., Chapman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function%2C+therapeutic+potential%2C+and+inhibition+of+Hsp70+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).</li>
<li>Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+region+in+the+N-terminus+of+Escherichia+coli+Lon+that+affects+ATPase%2C+substrate+translocation+and+proteolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity.</a> Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).</li>
</ol>

Er zijn geen concurrerende financiële belangen.

Hsp90 is een belangrijk doelwit voor de ontdekking van nieuwe moleculen tegen kanker. Sinds de druggability werd vastgesteld in 199410, 18 moleculen hebben klinische proeven bereikt. Op dit moment bevinden zeven moleculen zich in verschillende fasen van klinische onderzoeken, alleen of in combinatie22. Al deze kleine moleculen zijn N-terminale ATP-bindingsremmers. De andere middelen om de chaperonne te remmen (C-terminale remmers, middendomeinremmers) zijn niet zo snel gega...

Heat shock protein 90 (Hsp90) is een moleculaire chaperonne die de stabiliteit van eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en progressie van kanker handhaaft. Daarnaast zijn eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van resistentie tegen antineoplastische middelen ook klanten van Hsp901. Hsp90 wordt alomtegenwoordig overexpressie gegeven in alle soorten kankercellen (>90% van de cellulaire eiwitten), vergeleken met normale cellen waar het minder dan 2% van de totale eiwitten kan vormen. Bovendien bevindt de Hsp90 van kankercellen zich in een complex met co-chaperones, terwijl het in een normale cel voornamelijk aanwezig is in een vrije, niet-gecomplexeerde toestand 2,3. In de afgelopen jaren is aangetoond dat verschillende Hsp90-remmers senolytische effecten hebben in in vitro en in vivo studies, waar ze de levensduur van muizen aanzienlijk hebben verbeterd 4,5,6. Alle bovengenoemde bevindingen onderbouwen het feit dat Hsp90-remmers effectief kunnen zijn bij meerdere soorten kanker, met minder bijwerkingen en verminderde kans op het ontwikkelen van resistentie. De chaperoningfunctie van Hsp90 wordt bereikt door ATP te binden aan het N-terminale domein van Hsp90 en het te hydrolyseren tot ADP en vrij fosfaat7. Kleine moleculen die competitief binden aan de ATP-bindingspocket van Hsp90 bleken met succes het chaperoning-effect van het eiwit te onderdrukken. Tot op heden blijft dit de beste strategie voor Hsp90-remming, wat wordt ondersteund door het feit dat dergelijke remmers klinische onderzoeken hebben bereikt8. Een daarvan, Pimitespib, werd in juni 2022 in Japan goedgekeurd voor de behandeling van gastro-intestinale stromale tumor (GIST)9. Dit is de eerste Hsp90-remmer die is goedgekeurd sinds de druggability van de chaperonne werd vastgesteld in 199410.
De malachietgroene test is een eenvoudige, gevoelige, snelle en goedkope procedure voor de detectie van anorganisch fosfaat, geschikt voor automatisering en high-throughput screening (HTS) van verbindingen tegen het gewenste doel11. De test is met succes gebruikt voor de screening van Hsp90-remmers in kleine laboratoriumopstellingen, evenals in een HTS 12,13,14,15,16,17. De test maakt gebruik van een colorimetrische methode die het vrije anorganische fosfaat bepaalt dat wordt gevormd door de ATPase-activiteit van Hsp90. De basis van deze kwantificering is de vorming van een fosfolybdaatcomplex tussen vrij fosfaat en molybdeen, dat vervolgens reageert met malachietgroen om een groene kleur te genereren (figuur 1). Deze snelle kleurvorming wordt gemeten op een spectrofotometer, of op een plaatlezer, tussen 600-660 nm18,19.
In dit protocol wordt de procedure beschreven voor het uitvoeren van een malachietgroene test met gist Hsp90 en de daaropvolgende identificatie van remmers tegen de chaperonne. Het natuurlijke productmolecuul, geldanamycine (GA), waarmee de druggability van Hsp90 voor het eerst werd vastgesteld, werd als een authentieke remmer10 genomen. HTS is een integraal onderdeel geworden van het huidige programma voor het ontdekken van geneesmiddelen, vanwege de beschikbaarheid van een groot aantal moleculen voor testen. Deze techniek heeft de afgelopen 2 jaar meer betekenis gekregen vanwege de dringende behoefte aan herbestemming van geneesmiddelen voor de behandeling van Covid-19-infectie20,21. Daarom wordt een gedetailleerd overzicht gepresenteerd voor de HTS van moleculen tegen gist Hsp90-eiwit door de malachietgroene testmethode toe te passen.

<table><tbody><tr><td>1M Magnesium chloride solution in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069-100ml</td><td></td></tr><tr><td>1M Potassium chloride solution in water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142-100ml</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>SPL Life Sciences</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-trifosfaat dinatriumzouthydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biomek FX laboratoriumautomatiseringswerkstation</td><td>Beckman Coulter</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Verbindingen 3-96</td><td>Niet van toepassing</td><td>Niet van toepassing</td><td>Histidine-gelabelde gist Hsp90 werd verkregen van Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Verenigd Koninkrijk, en het eiwit werd geëxpresseerd in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details kunnen niet worden vrijgegeven vanwege octrooi-inbreuk.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycine, 99% (HPLC), poeder</td><td>AK Scientific, Inc.</td><td>V2064</td><td></td></tr><tr><td>Invitroge UltraPure DNase/RNase-vrij gedistilleerd water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Malachitoen Groen Fosfaat Assay  Assay kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAK307-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Multi-detectie microplaatlezer Synergy HT</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HT multi-plaatlezer</td><td>Biotek Instruments, Inc.</td><td>Niet van toepassing</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-hydrochloridebufferoplossing, pH7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93313-1L</td><td></td></tr><tr><td>Gist Hsp90</td><td>Niet van toepassing</td><td>Niet van toepassing</td><td>School of Life Sciences, University of Sussex, Verenigd Koninkrijk en het eiwit werd geëxpresseerd in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primair toegangsnummer: P02829</td></tr></tbody></table>

malachiet green assay voor de ontdekking van heat-shock eiwit 90-remmers

Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors

Heat shock protein 90 (Hsp90) is een veelbelovend doelwit tegen kanker vanwege het chaperonerende effect op meerdere oncogene eiwitten. De activiteit van Hsp90 is afhankelijk van het vermogen om adenosinetrifosfaat (ATP) te hydrolyseren tot adenosinedifosfaat (ADP) en vrij fosfaat. De ATPase-activiteit van Hsp90 is gekoppeld aan zijn chaperoningfunctie; ATP bindt aan het N-terminale domein van de Hsp90 en het verstoren van de binding bleek de meest succesvolle strategie te zijn in het onderdrukken van de Hsp90-functie. De ATPase-activiteit kan worden gemeten met een colorimetrische malachietgroene assay, die de hoeveelheid vrij fosfaat bepaalt die wordt gevormd door ATP-hydrolyse. Hier wordt een procedure beschreven voor het bepalen van de ATPase-activiteit van gist Hsp90 met behulp van de malachietgroene fosfaattestkit. Verder worden gedetailleerde instructies gegeven voor de ontdekking van Hsp90-remmers door geldanamycine als een authentieke remmer te nemen. Tot slot wordt de toepassing van dit assay protocol door middel van de high-throughput screening (HTS) van remmermoleculen tegen gist Hsp90 besproken.

De resultaten van de test worden geïnterpreteerd in termen van absorptie als gevolg van vrije fosfaationenconcentratie. De absorptie door vrij fosfaat als gevolg van ATP-hydrolyse door de gist Hsp90 bij 620 nm wordt beschouwd als 100% ATPase-activiteit, of nul percentage eiwitremming. De remming van eiwit leidt tot het stoppen van ATP-hydrolyse (minder vrij fosfaat). wat tot uiting komt in een verminderde absorptie bij 620 nm.
Resultaten van malachiet groene assay op laboratoriumschaal...

Het malachiet green assay protocol is een eenvoudige en kosteneffectieve methode om heat shock protein 90 (Hsp90) suppressors te ontdekken, evenals andere remmers tegen ATP-afhankelijke enzymen.

Malachiet Green Assay voor de ontdekking van heat-shock eiwit 90-remmers

Heat shock protein 90 (Hsp90) is a promising anticancer target because of its chaperoning effect on multiple oncogenic proteins. The activity of Hsp90 is ...

Dit protocol zal helpen bij het bepalen van de activiteit voor ATPase-eiwitten door het meten van het vrije fosfaat dat het gevolg is van ATP-hydrolyse door de eiwitten. De malachietgroene test is een eenvoudige, gevoelige, snelle en goedkope procedure voor de detectie van anorganisch fosfaat. Het is geschikt voor automatisering en high-throughput screening van verbindingen tegen zijn doel.Deze techniek zal een belangrijke rol spelen bij de snelle ontdekking van remmers tegen het Hsp90-eiwit, dat een belangrijk doelwit is tegen kanker. Om te beginnen, pipetteer 40 microliter één-millimolair fosfaatstandaard in 960 microliter ultrapuur water om 40-micromolaire fosfaatoplossing te verkrijgen. Voeg deze oplossing toe volgens de instructies van de fabrikant om een seriële verdunning van fosfaat van 0 tot 40 micromolar te vormen.Gebruik vervolgens acht microliter gist Hsp90 voor meetbare ATPase-activiteit. Voeg malachietgroen reagens toe aan de blanco en de positieve controle en controleer of het optische dichtheidsverschil tussen de blanco en de positieve controle na de toevoeging ten minste 0,5 en minder dan 1 is. Om ATP te bereiden, brengt u één milligram ATP over in een injectieflac

malachite-green-assay-for-discovery-heat-shock-protein-90

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit protocol een methode om intracellulair eiwit hervouwing te meten na de heat shock wordt beschreven. Deze methode kan gebruikt worden om foldases zoals moleculaire chaperonnes en hun co-factoren of verbindingen in staat om hun activiteiten van invloed te bestuderen. Vuurvlieg luciferase activiteit wordt gebruikt als reporter voor chaperonne hervouwing activiteit te meten.

Intracellulaire hervouwing Assay

Wij presenteren een variatie van de QUICK (kwantitatieve Immunoprecipitatie combinatie met Knockdown) benadering die eerder werd onderscheid te maken tussen echte en valse eiwit-eiwit interacties. Onze aanpak is gebaseerd...

Een protocol voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties op basis van<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabole Labeling, Immunoprecipitatie, kwantitatieve Massaspectrometrie en Affiniteit Modulatie

In this video, we demonstrate the amplified luminescent proximity homogeneous assay—a bead-based proximity assay. It utilizes homogeneously-sized acceptor and donor beads, immobilized with two proteins that tend to interact to screen potential small molecules inhibiting protein interactions.

Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay: A Bead-Based Proximity Assay to Screen Small Molecules Inhibiting Protein-Protein Interactions

Een van de meest uitdagende stress voorwaarden die organismen tijdens hun leven tegenkomen gaat de accumulatie van oxidanten. Tijdens oxidatieve stress afhankelijk cellen sterk zijn van moleculaire chaperones. Hier presenteren we methoden voor het onderzoeken van de redox-gereglementeerde anti-aggregatie activiteit, evenals het monitoren van de structurele veranderingen in het bestuur van de Chaperon-functie met behulp van HDX-MS.

Hsp33 de Redox-gereglementeerde Chaperone activiteit definiëren en in kaart brengen van de wijzigingen van de conformationele op Hsp33 met behulp van spectrometrie van de massa van de Exchange waterstof-deuterium

A Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-gekoppelde ATPase-assay is aangepast aan de semihoge doorvoer screening van kleine molecuul myosine-remmers. Deze kinetische test wordt uitgevoerd in een 384-well microplaat Format met een totaal reactievolume van slechts 20 μL per put. Het platform moet van toepassing zijn op vrijwel elk ADP-producerende enzym.

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

De mogelijkheid om doelbetrokkenheid door kandidaat-remmers in intacte cellen te beoordelen is cruciaal voor de ontdekking van geneesmiddelen. Dit protocol beschrijft een 384 goed formaat cellulaire thermische verschuiving test die betrouwbaar detecteert cellulaire doel betrokkenheid van remmers gericht op ofwel wild-type SHP2 of de oncogene varianten.

Beoordeling van Cellular Target Engagement door SHP2 (PTPN11) Phosphatase Inhibitors

SAMHD1 is een deoxynucleosidetrifosfaattrifosfohydrolase met een cruciale rol in de gezondheid en ziekte van de mens. Hier presenteren we een veelzijdige enzymgekoppelde SAMHD1-activiteitstest, ingezet in een microplaatformaat met 384 putjes, die de evaluatie van kleine moleculen en nucleotide-analogen als SAMHD1-substraten, activatoren en remmers mogelijk maakt.

Een high-throughput enzymgekoppelde activiteitstest om de interactie van kleine moleculen met het dNTPase SAMHD1 te onderzoeken

Dit protocol presenteert een techniek voor het onderzoeken van eiwit-eiwitinteracties met behulp van glutathion-gekoppelde donorkralen met GST-gefuseerde TPR-motief co-chaperones en acceptor kralen in combinatie met een Hsp90-afgeleid peptide. We hebben deze techniek gebruikt om kleine moleculen te screenen om Hsp90-FKBP51- of Hsp90-FKBP52-interacties te verstoren en hebben krachtige en selectieve Hsp90-FKBP51-interactieremmers geïdentificeerd.

Studies van Chaperone-Cochaperone Interacties met behulp van Homogene Bead-Based Assay

Dit protocol demonstreert de chaperonne-activiteit van heat shock protein 70 (Hsp70). E. coli dnaK756-cellen dienen als model voor de test omdat ze een inheemse, functioneel gehandicapte Hsp70 herbergen, waardoor ze vatbaar zijn voor hittestress. De heterologe introductie van functioneel Hsp70 redt de groeideficiëntie van de cellen.

Op Escherichia coli gebaseerde complementatietest om de chaperonnefunctie van heat shock-eiwit te bestuderen 70

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Leer de malachietgroen-assay voor de ontdekking van Hsp90-remmers in kankeronderzoek. Deze eenvoudige, gevoelige methode detecteert anorganisch fosfaat en ondersteunt high-throughput screening.

Malachiet Green Assay voor de ontdekking van heat-shock eiwit 90-remmers

Meer video's verkennen