Differentiatie van functionele osteoclasten van humaan perifeer bloed CD14⁺ monocyten

0.Ons protocol beschrijft een geoptimaliseerde en reproduceerbare methode om osteoclast in vitro te genereren die kan worden gebruikt om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan hun differentiatieproces en functionaliteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het vermogen om binnen slechts een week grote aantallen functioneel actieve osteoclasten te genereren. Een hoge differentiatieopbrengst wordt bereikt door gezuiverde monocyten te gebruiken en cytokines op tijd toe te voegen.

Osteoclasten zijn verantwoordelijk voor botvernietiging bij elke vorm van artritis, en deze methode biedt de hulpmiddelen om nieuwe therapeutische verbindingen te screenen die hun differentiatie en / of functies kunnen moduleren. De procedure wordt gedemonstreerd door Patricia Riedlova, een promovenda van ons laboratorium. Isoleer om te beginnen de PBMC's door het bloed over te brengen in een nieuwe buis van 50 milliliter.

Verdun het met steriele PBS in een gelijk volume voor vers bloed, of een verhouding van 1:3 voor leukocytenkegels en buffy coats. Meng het bloed voorzichtig door inversie. Bereid buizen van 15 milliliter met drie milliliter dichtheidsgradiëntmedium voor en leg langzaam acht tot 10 milliliter verdund bloed op de bovenkant van het dichtheidsgradiëntmedium, vermijd mengen.

Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur zonder rem. Gooi vervolgens de bovenste laag voorzichtig weg met een Pasteurpipet. Verzamel de onderliggende interfaselaag met de PBMC's en breng deze laag over in een nieuwe buis van 50 milliliter.

Suspensie de cellen tot 50 milliliter met steriele PBS en was het resterende dichtheidsgradiëntmedium af door gedurende 10 minuten bij 300 x g bij kamertemperatuur met volle rem te centrifugeren. Om resterende bloedplaatjes te verwijderen, herhaalt u het centrifugatieproces zoals beschreven in het manuscript, resuspensie van de geïsoleerde en gezuiverde PBMC's in 20 milliliter PBS en telt u ze met behulp van een hemacytometer volgens de standaardmethode. Om CD14+monocyten te verrijken, brengt u 1 x 10 over naar de zevende PBMC's in een geschikte polystyreen buis met ronde bodem en pellet u de cellen gedurende vijf minuten op 300 x g.

Na het weggooien van het supernatant en het opnieuw suspuskeren van de celpellet in de celscheidingsbuffer, incubeer je de cellen gedurende 10 minuten met 10 microliter antilichaamcocktail per 100 microliter met het deksel erop. Voeg aan het einde van de incubatie 10 microliter van de magnetische nanodeeltjesparels per 100 microliter toe en incuber gedurende drie minuten met het deksel erop. Vul het volume aan tot 2,5 milliliter met de celscheidingsbuffer.

Plaats de buis in een magneet en incubeer gedurende drie minuten met het deksel eraf. Gooi nu de negatieve-celpopulatie weg met één continue beweging door inversie terwijl de buis nog in de magneet zit. Verwijder de buis van de magneet, was de verrijkte CD14+monocyten die aan de magnetische kralen zijn bevestigd door ze opnieuw in 2,5 milliliter van de celsuspensiebuffer te plaatsen en plaats de buis terug in de magneet.

Tel de geïsoleerde cellen zoals eerder aangetoond. Centrifugeer de verzamelde cellen gedurende vijf minuten op 300 x g. Na het weggooien van het supernatant, resuspendien de cellen met 1 miljoen-cellen-per-milliliter in volledig alfa minimaal essentieel medium met 10% FBS.

Om de osteoclast te differentiëren, voegt u M-CSF in een eindconcentratie van 25 nanogram per milliliter toe aan de celsuspensie en mengt u door grondig te pipetteren om de celsuspensie te homogeniseren. Plaat 100-microliter van de suspensie-per-put in een vlakke bodem 96-well plaat. Voeg vervolgens 200 microliter steriel gedestilleerd water per put toe rond de vergulde cellen om mediumverdamping en randeffecten in het kweeksysteem te voorkomen.

Incubeer de cellen 's nachts gedurende ongeveer 18 tot 20 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Bereid verse media voor aangevuld met M-CSF en RANK ligand. Verwijder na de incubatie voorzichtig de helft van het medium door aspiratie met behulp van een P200-pipet en vervang het door vers, warm compleet medium aangevuld met M-CSF en RANK-ligand in een eindconcentratie van 25 nanogram per milliliter.

Differentieer de cellen in osteoclasten gedurende zeven tot 14 dagen met een volledige vervanging van het medium om de drie dagen. Na het verwijderen van het medium, fixeert u de gedifferentieerde aanhangende osteoclasten met 100 microliter per put van de bereide fixatieve oplossing en incubeert u gedurende één minuut. Raak de bodem van de putjes niet aan om krassen op de aanhangende cellen te voorkomen.

Zodra de putten drie keer zijn gewassen met 300 microliter steriel gedestilleerd water, tikt u de platen droog en voegt u 100 microliter vers bereide kleuringsoplossing toe aan elke put. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius in het donker gedurende 20 minuten. Verwijder na incubatie de kleuringsoplossing door inversie en was de plaat drie keer met 300 microliter per put gedestilleerd water.

Verwijder het overtollige water door op de platen op keukenpapier te tikken en laat de platen open en beschermd tegen licht tot aan de lucht drogen 's nachts. Maak met behulp van een brightfield-microscoop met een tegeloptie foto's van 10x of 20x om het hele putoppervlak vast te leggen. Tel handmatig de osteoclasten die zijn geïdentificeerd als TRAP + paars gekleurde cellen met meer dan drie kernen met behulp van een beeldanalysesoftware met een celtellerplug-in.

Plaat 100-microliter van de geïsoleerde CD14+monocyten-per-put in een 18-well kamer schuift bij een celdichtheid van 1 x 10 tot de vijfde cellen-per-put. Differentieer de osteoclasten in aanwezigheid van M-CSF en RANK ligand zoals eerder aangetoond met een volledige verandering van medium om de drie dagen. Verwijder op het eindtijdpunt voorzichtig het medium en was elke put twee keer met 200 microliter voorverwarmde PBS bij pH 7,4.

Laat de putten niet tussen de treden door drogen. Bevestig het monster met 100 microliter per put van 4% formaldehyde-oplossing in PBS en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale schudder met zacht schudden. Na incubatie, was de cellen twee keer met 200-microliter-per-put van PBS.

Permeabiliseer de cellen met 100-microliter-per-well van 0,1% Triton x-100-oplossing verdund in PBS en incubeer gedurende 10 minuten zoals eerder getoond. Was twee keer met 200 microliter PBS per put. Om niet-specifieke binding te blokkeren en het signaal te verhogen, voegt u 100 microliter blokkerende oplossing toe die is gemaakt met 2% runderserumalbumine en PBS-oplossing.

Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker met zacht schudden. Voeg na het verwijderen van de blokkerende oplossing 100 microliter fluorescerend geconjugeerde falloïdine-oplossing verdund in 2% BSA / PBS-oplossing toe aan elk putje. Was twee keer met 200 microliter PBS per put.

Bevlek de kernen met 100 microliter per put van een oplossing van PBS die 300 nanomolaire DAPI bevat. Verwijder na 10 tot 15 minuten de DAPI-oplossing en vervang deze door PBS van 100 microliter per put. Visualiseer de kleuring met behulp van geschikte immunofluorescentie of confocale microscopen op vier tot 40x.

De rijpe osteoclasten worden gedefinieerd als TRAP+multiple nucleate cellen. De toevoeging van RANK-ligand produceerde steeds meer grote TRAP+multi-nucleated osteoclasten op een dosisafhankelijke manier. De kinetiek van osteoclastische differentiatie van monocyten werd onderzocht gedurende een kweekperiode van twee tot 14 dagen.

Multinucleaire osteoclasten waren zichtbaar vanaf dag vijf en optimale differentiatie werd bereikt op dag zeven. De differentiatie van osteoclasten op gemineraliseerde oppervlakken maakt het mogelijk om hun resorptieactiviteit te beoordelen door de vorming van ronde gaten of resorptieputten te analyseren. Het resorptiepercentage neemt significant toe in de aanwezigheid van M-CSF en RANK ligand in vergelijking met M-CSF alleen.

Verder remde behandeling met rotenon dosisafhankelijk de resorptie van het gemineraliseerde oppervlak in vergelijking met de onbehandelde controleput. De rotenonafhankelijke remming van osteoclastresorptie was geassocieerd met de remming van ATP-productie. De fragmentatie van de RANK ligand-afgeleide actine ring van de volwassen OCS werd waargenomen in aanwezigheid van rotenon.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de verrijkte monocyten geen bloedplaatjes bevatten, dat de cellen op de juiste dichtheid zijn geplateerd en dat de omliggende putten met water zijn gevuld om het randeffect te voorkomen. Dit protocol is vooral nuttig om mechanistisch te onderzoeken hoe osteoclasten zich vormen en wat hun functionaliteit beïnvloedt, zowel in de basis- als in de translationele wetenschap. Bijvoorbeeld door verbindingen of eiwitten te gebruiken die deze processen kunnen moduleren.