Analyse en beeldvorming van osteocyten

Vloeistofstroomschuifspanning wordt verondersteld een mechanositimulator van osteocyten te zijn. Aangezien directe meting geen optie is, zijn confocale beeldafgeleide modellen van osteocyten een waardevol hulpmiddel voor het uitvoeren van computationele vloeistofdynamica-analyse om de enorme spanningen van de vloeistofstroom op de dendritische membranen van de osteocyten te evalueren. Een deel van het werk dat in ons laboratorium wordt gedaan, komt overeen met de recente ontwikkelingen in het veld waar de werkelijke morfologie van lacunes in osteocyten, inclusief de kronkeligheid en dichtheid van dendrieten, samen met het bot en het lacunair-canaliculaire netwerk worden gebruikt om de schuifspanning van de vloeistofstroom en locaties in de dendritische structuur van de osteocyt waar de spanning hoog is, numeriek te bepalen.

De huidige technologieën omvatten verschillende computationele modelleringen, zoals analyse van eindelementen, computationele vloeistofdynamica, interactie met vloeistofstructuur, op afbeeldingen gebaseerde modellering, inclusief röntgen- of confocale microscoop voor nauwkeurige 3D-modellen en door mechanische testsystemen om de modellen te valideren door botreacties te meten, zoals spanningen onder gecontroleerde belastingsomstandigheden. Onze bevindingen geven aan dat verlies van dendrieten als gevolg van veroudering of botziekte een factor is bij het minder reageren op botten voor fysieke activiteit. We voorspelden dat osteocyten mechanische belastingen detecteren door gebieden met hoge vloeistofstroomschuifspanning die dendrieten zijn.

En schuifspanning van de vloeistofstroom is gecorreleerd met de lacunaire morfologie, met name het oppervlak. Met de opstelling van dit protocol werken we nu aan een NIH-project om de schuifspanning van de vloeistofstroming in de osteocytendendrieten van muizenbotten van twee verschillende leeftijden en geslachten te bestuderen. Deze studie zal helpen bepalen hoe veroudering en geslachtsverschillen de mechano-transductie in het bot beïnvloeden als gevolg van belasting.

Fixeer om te beginnen het dijbeen dat van de muis is verzameld in koud 4% paraformaldehyde in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 24 uur bij vier graden Celsius met zacht schommelen. Spoel de volgende dag de met bot en fosfaat gebufferde zoutoplossing af en veranker deze snel in een snel polymeriserend acrylaat. Snijd dikke dwarse plakjes van 300 micrometer boven de derde trochanter.

Polijst de botsecties met schuurpapier tot een uiteindelijke dikte van 90 tot 100 micrometer. Spoel vervolgens de gepolijste secties elk vijf minuten in 70% 95% en 100% ethanol. Kleur de coupes in 1%fit C in 100%ethanol gedurende vier uur in het donker met matig schudden.

Was de secties vervolgens grondig in 100% ethanol. En laat ze een nacht aan de lucht drogen voordat u ze in een druppel montagemedia op een glazen dia plaatst. Monteer een dekglaasje op het preparaat.

Stel op een confocale microscoop een laser van 488 nanometer in voor excitatie en een emissieverzamelingsvenster van 496 tot 596 nanometer. Maak eerst een beeld met een laag vermogen van het hele botgedeelte met behulp van het 5x-objectief. Maak vervolgens foto's van de drie interessegebieden met behulp van het 20x-objectief.

Gebruik een 100x 1,44 numeriek diafragma olieobjectief met een digitale zoom van 1,7 en een stapgrootte van 0,126 micrometer om gedetailleerde Z-stapels van 400 Z-vlakken te verzamelen met 1024 bij 1024 pixels en een pixelresolutie van 0,089 micrometer. Voor computermodellering van osteocyten van muizen, opent u de ImageJ-software na het importeren van verzamelde Z-stackafbeeldingen van het dijbeen van de muis in TIFF-indeling, past u de drempel in het sectiemenu aan om de limieten voor pixelintensiteit voor opname in een masker te wijzigen. Gebruik de bewerking voor het bijsnijden van het bijsnijdmasker om één lacune met zijn canaliculi bij te snijden als het interessegebied.

Verhul de lacune in een denkbeeldige grotere kubus met zijlengtes van 21, 14 en 19 micrometer. Voer een bewerking uit om de verbonden pixelgebieden te selecteren om een uniform lacunair-canaliculair netwerk of LCN te genereren. Zet vervolgens met behulp van de bewerking voor het berekende onderdeel het lacunair-canaliculaire masker om in een object.

Verminder het LCN-volume met behulp van de afvlakkingsbewerking om de osteocyt- en dendritische membranen op te bouwen. Exporteer vervolgens de objecten. Combineer twee oppervlakken van de LDN- en osteocyt-dendritische membranen tot één oppervlak.

Gebruik nu de remesh-bewerking om een volumetrisch model van de lacunaire canaliculaire ruimte te maken. Exporteer het model als een STL-bestand en pas de objectschaal aan naar micrometers. Kies in een driedimensionale beeldgebaseerde verwerkingssoftware het volumetrische model van de lacunaire-canaliculaire ruimte van de muis als basismodel om verschillende osteocytmodellen te bouwen.

Selecteer een lagere drempel om de lichtintensiteit van het beeld te verminderen en een lacune met minder canaliculi te verkrijgen. Ontwikkel vervolgens osteocytmodellen met verschillende lacunair-canaliculaire ruimtediktes of dendrietkanaaldiameters. Bouw grotere of kleinere osteocytenmodellen met behulp van respectievelijk wikkel- of gladstrijkoperaties.

Om een vloeistofstroom in de simulatiesoftware te creëren, importeert u de ontwikkelde confocale beeldgebaseerde geometrieën in de CFX-software. Stel de afmetingen van de eenheid in op nanometer. Klik vervolgens op aftrekken om een enkel lichaam van lacunaire caniculaire ruimte te krijgen.

Klik met de rechtermuisknop op het gegenereerde facet en converteer het van facetten naar een solide domein zonder gezichten samen te voegen. Klik op mesh en selecteer lineaire tetraëdrische elementen met een elementgrootte van 0,06 micrometer. Verfijn het net met een onderzoek naar de convergentie van het net.

Selecteer nu het oppervlak en kies de canaliculi aan de bovenzijde van de denkbeeldige kubus als vloeistofinlaten. Gebruik de doos en kies de canaliculi op de andere vijf vlakken als vloeistofuitlaten. Exporteer vervolgens het net.

Nadat u een andere vloeistofstroom hebt gemaakt, importeert u de vloeiende mesh in het installatiegedeelte van CFX. Definieer met behulp van de optie voor het invoegen van grenzen twee randvoorwaarden van inlaten en uitlaten voor de vlakken. Oefen een vloeistofinlaatdruk van respectievelijk 300 en nul pascal uit op de inlaten en uitlaten.

Behandel de overige oppervlakken als muren met een antislip toestand. Behandel uit de materiaalbibliotheek de interstitiële laminaire vloeistof als water. Stel de secties voor warmteoverdracht, verbranding en thermische straling in op geen.

Selecteer turbulentie als de vloeistofkarakteristiek in de LCN. Voer vervolgens de software uit met dubbele precisie en directe start als het inzendingstype. Voeg een nieuwe contour toe in het resultatengedeelte van de CFD-software.

Creëer een vloeistofstroomschuifspanning of FFSS-contour door de wandafschuiving op de dendritische membranen van de osteocyt te kiezen als de variabele op het domein. Voeg vervolgens een snelheid toe die de contour stroomlijnt binnen het lacunair-canaliculaire domein, beginnend bij de inlaten. De gemiddelde FFSS op osteocyten en dendritische membranen in het jonge osteocytenmodel was 0,42 Pascal, wat significant hoger was dan 0,13 Pascal in het verouderde osteocytenmodel.

FFSS nam toe in osteocyten met een grotere lacunaire kanaalruimte, zoals te zien is in model zeven en model acht, waar model acht de hoogste FFSS vertoonde. De laagste FFSS-waarden van 0,19 Pascal en 0,13 Pascal werden waargenomen in respectievelijk model twee en model vier met de laagste canaliculaire dichtheid. Er werd geen significante verandering in FFSS waargenomen bij een grotere dendrietdiameter zoals waargenomen in modellen vijf en zes.