Name: Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Leer hoe je humane leversferoïden genereert uit perifeer bloed voor toxicologie en geneesmiddelonderzoek. Deze niet-genetische methode biedt een alternatief voor schaarse primaire hepatocyten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn vooral dankbaar voor de technische assistentie van Oksana en John Greenacre. Dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.

Ethische goedkeuring werd verkregen (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) voor het uitvoeren van deze experimenten en geïnformeerde toestemming werd ondertekend door alle donoren vóór bloedextractie in overeenstemming met institutionele richtlijnen.
1. Bereiding van mononucleaire cellen (MNC's) uit menselijk perifeer bloed (PB)
<ol><li>Extraheer 30 ml bloed van gezonde donoren met behulp van getraind medisch personeel volgens het standaardprotocol.</li>
	<li>Isoleer PBMNC's met behulp van dichtheidsgradiëntmedia volgens het protocol gepubliceerd door Becker-Kojić et al.13. Isoleer, door pipetteren, de interfaselaag tussen plasma en dichtheidsgradiëntmedia en gebruik steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) om de geïsoleerde cellen te wassen.</li>
	<li>Gebruik een telkamer en tel het aantal cellen met behulp van standaardmethoden.</li>
</ol>2. Dedifferentiatie van MNC's bij activering met humaan GPI-verankerd glycoproteïne
<ol><li>Plaats 6 x 106 mononucleaire cellen in PBS/1% runderserumalbumine (BSA) in een polystyreenbuis (15 ml) en incubeer met het specifieke antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 °C volgens Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 300 x g bij kamertemperatuur en vervang PBS/BSA door Iscove's gemodificeerde Dulbecco's medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).</li>
	<li>Kweek de cellen in polystyreenbuizen van 15 ml in een 5% CO 2-incubator bij 37 °C gedurende 8-10 dagen zoals beschreven in Becker-Kojić et al.13. Voeg op dag 5 (D5) 1-2 ml Iscove's medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke buis van 15 ml.</li>
</ol>3. Sorteren van nieuw gegenereerde gededifferentieerde cellen
<ol><li>Centrifugeer gekweekte celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 300 x g en zuig met een steriele pipet het resulterende supernatant volgens Becker-Kojić et al.13.</li>
	<li>Resuspendeerde pellet verkregen door centrifugeren in 90 μL koude PBS-buffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA en 2 mM EDTA) en voeg 10 μL CD45-positieve magnetische nanokorrels toe en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.</li>
	<li>Was de celsuspensie met 2 ml PBS-buffer, centrifugeer deze gedurende 10 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur en voeg 500 μL PBS-buffer toe aan de cellen en resuspensie grondig.</li>
	<li>Pipetteer 500 μL voorgekoelde PBS-buffer in de kolom om deze te wassen en plaats deze in het magnetisch veld met behulp van een magnetische standaard.</li>
	<li>Was de cellen die op de kolom zijn geplaatst, tweemaal met 500 μL PBS-buffer en verzamel doorstroom met CD45-negatieve cellen in het medium van Iscove, aangevuld met 10% FBS.</li>
	<li>Gebruik een telkamer om het aantal geherprogrammeerde cellen te bepalen.</li>
</ol>4. Voorbereiding van glazen dekplaten voor het genereren van menselijke hepatocyten
<ol><li>Scheid glazen afdekplaten (14 mm) en incubeer ze gedurende 10 minuten in niet-ionisch reinigingsmiddel. Was glazen afdekkingen in gedeïoniseerd water totdat er geen belletjes overblijven en incubeer ze in 1M HCl gedurende 30 minuten (aangepast van Marchenko et al.14).</li>
	<li>Was glazen afdekplaten minimaal 3x met gedeïoniseerd water en droog ze een nacht op kamertemperatuur. Autoclaaf gedroogde glazen afdekplaten in een geschikte container.</li>
</ol>5. Celkweekplaten coaten met biolaminine voor 2D hepatische differentiatie van BD-PSC's
<ol><li>Plaats geautoclaveerde glazen afdekkingen met een steriel pincet in 4 putplaten en schakel UV-lampen gedurende 30 minuten in om steriele omstandigheden te garanderen.</li>
	<li>Ontdooi aliquots biolaminine en voeg 120 μL van 5 μg/ml biolaminine toe aan elke glazen afdeklaag. Laat de gecoate glazen afdekplaten een nacht op 4 °C staan.</li>
	<li>Verwijder het teveel aan biolaminine en voeg 200 μL hepatocytendifferentiatiemedium toe zoals hieronder beschreven.</li>
</ol>6. Bereiding van hepatocytendifferentiatiemedia
<ol><li>Maak 500 ml hepatoblast knockout serum replacement (KSR)/dimethylsulfoxide (DMSO) medium bestaande uit 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamine, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,1% β-mercaptoethanol, 1% DMSO en 1% penicilline-streptomycine (Pen/Strep).</li>
	<li>Bereid 500 ml hepatocytenrijpingsmedium met 1% L-glutamine, 10 μM hydrocortison, 21-hemisuccinaatnatriumzout (HCC) en 1% Pen/Strep.</li>
	<li>Aliquote medium uit de stam en voeg verse hepatocytengroeifactor (HGF) en oncostatine M (OSM) toe in eindconcentraties van 10 ng/ml en/of 20 ng/ml voor elke mediumverandering. OPMERKING: Oncostatine M is een cytokine dat behoort tot de interleukine 6-groep van cytokines, belangrijk voor hematopoiese en voor de ontwikkeling van de lever.</li>
</ol>7. Het kweken van levercellen gedifferentieerd van BD-PSC's
<ol><li>Plaats 3 x 105 BD-PSCS-cellen in elke put van een 4-well plaat bedekt met biolaminine.</li>
	<li>Plaats de 4-putplaten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Kweek de cellen gedurende 5 dagen in KSR / DMSO hepatoblastmedium dat endodermale differentiatie ondersteunt en verander het medium elke tweede dag.</li>
	<li>Schakel op dag 5 over op hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen nog eens 7-10 dagen in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium elke 48 uur.</li>
</ol>8.3D sferoïde leverdifferentiatie
<ol><li>Tel cellen met behulp van een telkamer.</li>
	<li>Centrifugeer BD-gededifferentieerde celsuspensie bij 300 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatant en resuspendien BD-gededifferentieerde cellen in KSR/DMSO-medium bij 2 x 106 cellen/ml.</li>
	<li>Haal de cellen door een celzeef van 40 μm om een eencellige suspensie te garanderen en om extra vuil te verwijderen.</li>
	<li>Tel cellen met behulp van een telkamer en bereid een voldoende volume voor elke celzaaidichtheid voor om het vereiste volume per put af te geven. Bereid een gradiënt voor met topzaaien van 1 x 106 cellen tot een lage zaaidichtheid van 4000 cellen.</li>
	<li>Doseer 100 μL KSR/DMSO-medium in 96 goed lage bevestigingsplaten en voeg 100 μL celzaaiverdunning toe.</li>
	<li>Plaats een lage bevestigingsplaat in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2 en kweek ze gedurende 5 dagen.</li>
	<li>Verander 50% van het medium vanaf dag 3-4 na het zaaien wanneer de sferoïden voldoende compact zijn.</li>
	<li>Verander op dag 5 het medium in hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen gedurende nog eens 7-10 dagen voor verdere rijping. Verander het medium om de twee dagen.</li>
</ol>9. Immunofluorescentieanalyse van nieuw gegenereerde 2D-levercelculturen
<ol><li>Kweek de cellen volgens de hierboven beschreven differentiatiemethode gedurende 4, 8, 15 en 24 dagen en verwijder media.</li>
	<li>Incubeer cellen met een voorverwarmd fixatief bestaande uit 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten. Gooi het fixeermiddel weg en was de cellen 2x met PBS gedurende 5 min elk. Voeg onmiddellijk 0,1% triton X-100-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten. Was 2x met PBS.</li>
	<li>Voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5% BSA toe en plaats deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een wipplaat.</li>
	<li>Verdun primaire antilichamen in verdunningsbuffer 1% BSA/PBS als volgt: albumine (ALB) 1:50, alfa-1 foetoproteïne (AFP) 1:250, cytokeratine 18 (CK18) 1:50, hepatocyten nucleaire factor 4 alfa (HNF4α) 1:1000 en transthyretine (TTR) 1:50. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put.</li>
	<li>Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Gooi vervolgens de antilichaamoplossing weg, was de cellen gedurende 5 minuten en herhaal de wasstap 3x.</li>
	<li>Bereid de volgende secundaire antilichamen in verdunningsbuffer: konijn anti-kip IgG (Texas rood) 1:1000, geit anti-muis IgG (488) 1:1000 en geit anti-konijn (488) 1:500. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was de cellen 3x met PBS gedurende 5 minuten elk en monteer de coverslips met montagemedia die DAPI bevatten voor microscopische analyse.</li>
</ol>10. Levende kleuring van nieuw gevormde leversferoïden
<ol><li>Gooi kweekmedia voorzichtig weg zonder de sferoïden aan te raken, voeg vers gemaakte PBS toe met 0,1% triton X-100-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten om de cellen te permeabiliseren.</li>
	<li>Was de sferoïden met het medium door langzaam te pipetteren gedurende 5 minuten, herhaal 2x.</li>
	<li>Incubeer de sferoïden met de primaire antilichamen ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) en CYP3A4 (1:200) bereid in PBS met 1% BSA gedurende 1 uur in 5% CO 2-incubator bij 37 °C. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de overtollige antilichaamoplossing en was de sferoïden met medium 3x.</li>
	<li>Bereid de overeenkomstige secundaire antilichamen geiten anti-muis IgG (Cy3), geit anti-muis IgG (488) en konijn anti-kip IgG (Texas rood) in een verdunning van 1:1000 en 1:500 voor geit anti-konijn (488) in PBS in 1% BSA. Gebruik 50 μL antilichaamverdunning per put en incubeer gedurende 20 minuten in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	<li>Was voorzichtig 3x met medium en laat de plaat 30 minuten in de couveuse staan bij 37 °C en 5% CO2 voordat u fluorescentiemicroscopie uitvoert.</li>
</ol>11. Onderzoek van sferoïden met behulp van een fluorescentiemicroscoop
<ol><li>Schakel de fluorescentielichtbron 10 minuten voor gebruik in, schakel de computer in en open de beeldbewerkingssoftware.</li>
	<li>Gebruik een objectief met 4x vergroting, klik op knop 4x in de werkbalk om de juiste schaalbalk te selecteren en plaats vervolgens de 96-well plaat op de middenplaat van het podium.</li>
	<li>Schakel de LED-lichtbron in, gebruik het brightfield-filter en plaats de plaat in de put van belang met behulp van de x-y-as trapinstelknop.</li>
	<li>Ga naar het lichtpad van de camera, klik op de knop Live in imaging-software om het beeld op het scherm te visualiseren en zorg ervoor dat de sferoïde is gecentreerd met behulp van de x-y-asknoppen en focus met behulp van de grove / fijne scherpstelknop. OPMERKING: De vorm van de sferoïden blijft constant na het aanbrengen van levende kleuring.</li>
	<li>Kies de Brightfield Observation-methode in de werkbalk, zet de belichtingsinstellingen op automatisch en klik op de knop Snapshot in het bedieningspaneel van de camera om een foto te maken. Sla de afbeelding vervolgens op als .vsi-bestand met de juiste naam in de gewenste map.</li>
	<li>Plaats de afschermingsplaat van het omgevingslicht om LED-licht uit te schakelen, verander naar filter voor B-excitatie, kies 488 Observation-methode in de werkbalk, open de sluiter, maak een foto door op de knop Snapshot te klikken, sluit de sluiter en sla het bestand op zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Herhaal dit met een filter voor G-excitatie met behulp van de juiste observatiemethode (Texas rood of CY3). Herhaal vervolgens de hele procedure voor elke bron van belang.</li>
	<li>Breng de plaat terug naar de 5% CO 2-incubator bij 37 °C en kweek deze zoals hierboven beschreven. </li>
</ol>

<ol><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li>
<li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1620(2019).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+liver+disease+-+A+practical+approach+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Animal models for liver disease - A practical approach for translational research.</a> Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).</li>
<li>Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+human+liver+spheroids+for+translational+pharmacology+and+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).</li>
<li>Nelson, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+extracellular+matrix%2C+scaffolds%2C+and+signalling%3A+tissue+architecture+regulates+development%2C+homeostasis%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer.</a> Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).</li>
<li>Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhanna%2C+S+%22Animal+Biotechnology+%28Second+Edition%29%22">Animal Biotechnology (Second Edition)</a>. , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).</li>
<li>Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+potential+in+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress and potential in organoid research.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).</li>
<li>Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+human+hepatocyte+spheroids+as+an+in+vitro+tool+for+investigating+drug+compounds+with+low+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+metabolism+and+disposition%3A+The+Biological+Fate+of+Chemicals%22%5BJournal%5D)">Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance.</a> Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).</li>
<li>Soto-Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+stem+cells+into+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%26+Genetic+Engineering+Reviews%22%5BJournal%5D)">Differentiating stem cells into liver.</a> Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).</li>
<li>Hurrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+liver+spheroids+as+a+model+to+study+aetiology+and+treatment+of+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis.</a> Cells. 9 (4), 964(2020).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+spheroids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+bio-artificial+liver+rescue+porcine+acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure.</a> Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).</li>
<li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+enzymes+and+drug+metabolism+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808(2021).</li>
<li>Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-Free+generation+of+blood-derived+neuronal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">GM-Free generation of blood-derived neuronal cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (168), e61634(2021).</li>
<li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry%3A+Human+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry: Human neural stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e267(2007).</li>
<li>Crandall, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-fetoprotein%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Clinical+Laboratory+Sciences%22%5BJournal%5D)">Alpha-fetoprotein: a review.</a> Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 15 (2), 127-185 (1981).</li>
<li>Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+transthyretin+in+cell+biology%3A+impact+on+human+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+2021%22%5BJournal%5D)">The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology.</a> Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).</li>
<li>Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+nuclear+factor+4+alpha+activation+is+essential+for+termination+of+liver+regeneration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice.</a> Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).</li>
<li>Korver, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+cytokeratin-18+as+a+biomarker+for+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury.</a> Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).</li>
<li>Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CYP3A+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">The role of CYP3A in health and disease.</a> Biomedicines. 10 (11), 2686(2022).</li>
<li>Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+expression+of+cytochrome+P450+3A+isoforms+and+toxicological+effects%3A+endo-+and+exogenous+substances+as+regulatory+factors+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+Pharmaceutical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates.</a> Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).</li>
<li>Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CYP2D6+and+CYP3A4+involvement+in+the+primary+oxidative+metabolism+of+hydrocodone+by+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).</li>
<li>Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+liver+diseases+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Burden of liver diseases in the world.</a> Journal of Hepatology. 70 (1), 151-171 (2019).</li>
<li>Kammerer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+liver+culture+systems+to+maintain+primary+hepatic+properties+for+toxicological+analysis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214(2021).</li>
</ol>

De corresponderende auteur verklaart dat zij een octrooihouder is met betrekking tot novel human GPI-linked protein. Ze is medeoprichter van en werkt samen met ACA CELL Biotech GmbH. De andere auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

De lever is een belangrijk orgaan in het menselijk lichaam met veel essentiële biologische functies, zoals de ontgifting van metabolieten. Als gevolg van ernstig leverfalen zoals cirrose en / of virale hepatitis, zijn er wereldwijd bijna 2 miljoen sterfgevallen per jaar. Levertransplantaties staan wereldwijd op de tweede plaats in solide orgaantransplantaties, maar slechts aan ongeveer 10% van de huidige behoefte wordt voldaan22.
Primaire menselijke hepatocyten (PHH) wo...

In de afgelopen jaren zijn driedimensionale (3D) sferoïde cultuursystemen een belangrijk hulpmiddel geworden om verschillende gebieden van kankeronderzoek, medicijnontdekking en toxicologie te bestuderen. Dergelijke culturen wekken grote belangstelling omdat ze de kloof overbruggen tussen tweedimensionale (2D) celkweek monolagen en complexe organen1.
Bij afwezigheid van een kleefoppervlak, in vergelijking met de 2D-celcultuur, is de vorming van sferoïden gebaseerd op de natuurlijke affiniteit van deze cellen om in 3D-vorm te clusteren. Deze cellen organiseren zich in groepen bestaande uit een of meer soorten volwassen cellen. Vrij van vreemde materialen, deze cellen interageren met elkaar zoals in hun oorspronkelijke micro-omgeving. De cellen in 3D-cultuur zijn veel dichter bij elkaar en hebben een goede oriëntatie op elkaar, met een hogere extracellulaire matrixproductie dan 2D-culturen, en vormen een dicht bij natuurlijke omgeving 2.
Diermodellen worden al heel lang gebruikt om menselijke biologie en ziekten te bestuderen3. In dit opzicht zijn er intrinsieke verschillen tussen mens en dier, waardoor deze modellen niet helemaal geschikt zijn voor extrapolatieve studies. 3D-cultuursferoïden en organoïden vormen een veelbelovend hulpmiddel om weefselachtige architectuur, interactie en overspraak tussen verschillende celtypen te bestuderen die in vivo voorkomen en kunnen bijdragen aan het verminderen of zelfs vervangen van diermodellen. Ze zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van de pathogenese van leverziekten en voor het screenen van geneesmiddelen4.
3D-sferoïdecultuur is van bijzonder belang voor kankeronderzoek omdat het de discontinuïteit tussen de cellen en hun omgeving kan elimineren door de behoefte aan trypsinisatie of collagenasebehandeling te verminderen die nodig is voor het voorbereiden van de tumorcelmonolagen voor 2D-culturen. Tumorsferoïden maken het mogelijk om te bestuderen hoe de normale versus kwaadaardige cellen signalen uit hun omgeving ontvangen en erop reageren5 en zijn een belangrijk onderdeel van tumorbiologische studies.
In vergelijking met de monolaag lijken 3D-culturen bestaande uit verschillende celtypen op tumorweefsels in hun structurele en functionele eigenschappen en zijn daarom geschikt voor het bestuderen van metastase en invasie van tumorcellen. Daarom dragen dergelijke sferoïde modellen bij aan het versnellen van kankeronderzoek6.
Sferoïden helpen ook bij het ontwikkelen van de technologie om menselijke organoïden te maken, omdat weefsel- en orgaanbiologie zeer uitdagend zijn om te bestuderen, vooral bij mensen. Vooruitgang in stamcelkweek maakt het mogelijk om 3D-culturen zoals organoïden te ontwikkelen die bestaan uit stamcellen en weefselvoorlopers, evenals verschillende soorten volwassen (weefsel) cellen van een orgaan met enkele functionele kenmerken zoals een echt orgaan dat kan worden gebruikt om orgaanontwikkeling, ziekten te modelleren, maar ze kunnen ook als nuttig worden beschouwd in regeneratieve geneeskunde7.
Primaire menselijke hepatocyten worden meestal gebruikt voor het bestuderen van in vitro biologie van menselijke hepatocyten, leverfunctie en geneesmiddel-geïnduceerde toxiciteit. Culturen van menselijke hepatocyten hebben twee belangrijke nadelen, ten eerste de beperkte beschikbaarheid van primair weefsel zoals menselijke hepatocyten, en ten tweede de neiging van hepatocyten om snel te dedifferentiëren in 2D-cultuur, waardoor hun specifieke hepatocytenfunctie verlorengaat 8. 3D-leverculturen zijn in dit opzicht superieur en zijn onlangs gemaakt van gedifferentieerde menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)9. Bioengineered hepatische 3D-sferoïden zijn van bijzonder belang voor het bestuderen van ontwikkeling, toxiciteit, genetische en infectieziekten van de lever, evenals bij het ontdekken van geneesmiddelen voor de behandeling van leverziekten10. Ten slotte hebben ze ook het potentieel om klinisch te worden gebruikt, wetende dat acute leverziekten een sterftecijfer van bijna 80% hebben, bio-kunstmatige lever en / of leversferoïden kunnen deze patiënten mogelijk redden door een gedeeltelijke leverfunctie te bieden totdat een geschikte donor kan worden gevonden11.
We hebben een protocol opgesteld voor het genereren van menselijke leversferoïden met behulp van bloedafgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) om sferoïden van verschillende grootte te bereiden die 4000 tot 1 x 106 cellen bevatten en deze geanalyseerd door middel van lichtmicroscopie en immunofluorescentie. We hebben ook het vermogen van hepatocyt-specifieke functie getest, waarbij we de expressie van cytochroom P450 3A4 (CYP3A4) en 2E1 (CYP2E1) enzymen beoordeelden die behoren tot de cytochroom P450-familie die een belangrijke rol spelen in cellulair en geneesmiddelmetabolisme door het proces van ontgifting12.

<table><tbody><tr><td>Albumine antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500217</td><td>geproduceerd in kip</td></tr><tr><td>Albumine Fraction V</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>T8444.4</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-1 Fetoproteïne</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>14550-1-AP</td><td>konijn polyklonaal IgG</td></tr><tr><td>Biolaminine 111 LN</td><td>BioLamina&nbsp;</td><td>LN111-02</td><td>menselijk recombinant</td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-045-801</td><td>nano-grootte magnetische kralen</td></tr><tr><td>Cell Strainer</td><td>pluriSelect</td><td>43-10040-40</td><td></td></tr><tr><td>CellSens&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>beeldvormingssoftware</td></tr><tr><td>Centrifugebuizen 50 mL&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>210270</td><td></td></tr><tr><td>CEROplate 96 wel</td><td>OLS OMNI Life Science</td><td>2800-109-96</td><td></td></tr><tr><td>CKX53&nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commercieel verkrijgbaar wasmiddel</td><td>Procter &amp; Gamble</td><td></td><td>nonionisch wasmiddel</td></tr><tr><td>CYP2E1-specifiek antilichaam</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>19937-1-AP</td><td>konijn polyklonaal antilichaam IgG</td></tr><tr><td>CYP3A4&nbsp;</td><td>Proteintech Germany GmbH</td><td>67110-1-lg</td><td>muis monoklonaal antilichaam IgG1</td></tr><tr><td>Cytokeratine 18</td><td>DakoCytomation</td><td>M7010</td><td>muis monoklonaal antilichaam IgG1</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14040091</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1030B</td><td>Niet meer verkrijgbaar. Beschikbaar onder: TMS-013-B</td></tr><tr><td>Glazen dekseltjes 14 mm</td><td>R. Langenbrinck</td><td>01-0014/1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>L-glutamine</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde 25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G588.2-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG Cy3</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN1673767</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>Geit anti-muis IgG DyLight 488</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN1889284</td><td>polyklonaal</td></tr><tr><td>Geit anti-konijn IgG Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721-1LGL</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17705021</td><td>hepatocyten rijpingsmedium</td></tr><tr><td>HGF</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0324</td><td>menselijk recombinant</td></tr><tr><td>HNF4&alpha; antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1457-25UL</td><td>kloon 4C19 ZooMAb Rbmono</td></tr><tr><td>Hydrocortison 21-hemisuccinaat (natriumzout)</td><td>Biomol</td><td>Cay18226-100</td><td></td></tr><tr><td>Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco</td><td>Fisher Scientific</td><td>A3181501</td><td>KSR</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12660012</td><td>Niet meer verkrijgbaar. Beschikbaar onder Catalogusnr. 10-828-010</td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-303</td><td>magnetische standaard</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x Gibco</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31350010</td><td>50mM</td></tr><tr><td>MiniMACS kolommen</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Multidishes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6789</td><td>4 welpjes platen</td></tr><tr><td>Oncostatin M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHC5015</td><td>menselijk recombinant</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS steriel</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9143.2</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Biochrom GmbH</td><td>A2213</td><td>10000 U/ml</td></tr><tr><td>PS 15ml buizen steriel</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188171</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-kip IgG Texas rood</td><td>Antibodies online</td><td>ABIN637943</td><td></td></tr><tr><td>Roti Cell Iscoves MDM</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>9033.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Mount FluorCare DAPI</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>HP20.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti Sep 1077 menselijk</td><td>Carl Roth GmbH+Co. KG</td><td>0642.2</td><td></td></tr><tr><td>Transthyretine antilichaam&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB3500378</td><td>geproduceerd in kip</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HFH10</td><td>1%</td></tr></tbody></table>

humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Human Liver Spheroids from Peripheral Blood for Liver Disease Studies

Menselijke levercellen kunnen een driedimensionale (3D) structuur vormen die in staat is om enkele weken in cultuur te groeien, waardoor hun functionele capaciteit behouden blijft. Vanwege hun aard om te clusteren in de kweekschalen met lage of geen kleefeigenschappen, vormen ze aggregaten van meerdere levercellen die menselijke leversferoïden worden genoemd. De vorming van 3D-leversferoïden is afhankelijk van de natuurlijke neiging van levercellen om te aggregeren in afwezigheid van een kleefbaar substraat. Deze 3D-structuren hebben betere fysiologische reacties dan cellen, die dichter bij een in vivo omgeving staan. Het gebruik van 3D-hepatocytenculturen heeft tal van voordelen in vergelijking met klassieke tweedimensionale (2D) culturen, waaronder een meer biologisch relevante micro-omgeving, architecturale morfologie die natuurlijke organen opnieuw samenstelt, evenals een betere voorspelling met betrekking tot de ziektetoestand en in vivo-achtige reacties op geneesmiddelen. Verschillende bronnen kunnen worden gebruikt om sferoïden te genereren, zoals primair leverweefsel of onsterfelijke cellijnen. Het 3D-leverweefsel kan ook worden gemanipuleerd door menselijke embryonale stamcellen (hESCs) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) te gebruiken om hepatocyten af te leiden. We hebben menselijke leversferoïden verkregen met behulp van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) gegenereerd uit ongemanipuleerd perifeer bloed door activering van menselijk membraangebonden GPI-gebonden eiwit en gedifferentieerd tot menselijke hepatocyten. De van BD-PSC's afgeleide menselijke levercellen en menselijke leversferoïden werden geanalyseerd door lichtmicroscopie en immunofenotypering met behulp van menselijke hepatocytenmarkers.

We hebben met succes menselijke BD-PSC's gedifferentieerd in endoderm / hepatische voorlopercellen en hepatocyten door een tweestappenprotocol toe te passen. Morfologische veranderingen tijdens het leverdifferentiatieproces zijn weergegeven in figuur 1. BD-PSC's differentiëren in hepatocyten die drie verschillende stadia doorlopen. De eerste fase vertegenwoordigt de differentiatie in endodermale cellen L4, de tweede, differentiatie naar levervoorlopercellen (hepatoblast) L8, met een typische...

Hier presenteren we een niet-genetische methode om menselijke autologe leversferoïden te genereren met behulp van mononucleaire cellen geïsoleerd uit steady-state perifeer bloed.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Human liver cells can form a three-dimensional (3D) structure capable of growing in culture for some weeks, preserving their functional capacity. Due to ...

Generatie van menselijke leversferoïden met behulp van autologe bronnen kan bijdragen aan verschillende onderzoeksgebieden zoals toxicologie, kanker en geneesmiddelenontdekking. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is om BDPC-afgeleide menselijke hepatocyten te gebruiken om menselijke leversferoïden te engineeren, waardoor het tekort aan primaire menselijke hepatocyten of PHH wordt omzeild. Autologe menselijke sferoïden kunnen worden uitgebreid tot regeneratieve geneeskunde en therapie, vooral bij patiënten met acuut leverfalen.Dr.Anne-Katherin Schott, projectleider in mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Begin met het bereiden van 500 milliliter hepatoblast KnockOut serumvervangend dimethylsulfoxide of KSR DMSO-medium en hepatocytenrijpingsmedium. Aliquoteer het medium uit de bouillon en voeg verse hepatocytengroeifactor of HGF en oncostatine M of OCM toe in eindconcentraties van 10 of 20 nanogram per milliliter voor elke mediumverandering.Breng drie keer 10 tot de vijfde van het bloed afgeleide pluripotente stamcellen of BD-PSC-cellen over in een met biolaminine gecoate vierputplaat en incuber de plaat in een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vijf dagen. Om de endodermale differentiatie te ondersteunen, kweek de cellen gedurende vijf dagen in KSR DMSO hepatoblastmedium en verander het medium elke 48 uur. Voeg op dag vijf hepatocytenrijpingsmedium toe en kweek de cellen gedurende nog eens zeven tot 10 dagen in de couveuse bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, waardoor het medium elke 48 uur wordt vervangen.Tel cellen met behulp van een telkamer en centrifugeer BD gededifferentieerde celsuspensie bij 300 G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendien BD gededifferentieerde cellen in KSR DMSO-medium bij twee keer 10 van de zes cellen per milliliter concentratie. Nadat u de suspensie van één cel hebt verzekerd, verwijdert u extra vuil door de cellen door een celzeef van 40 micrometer te laten gaan.Nogmaals, tel de cellen met behulp van een telkamer en bereid een voldoende volume van elke celzaaidichtheid voor om het vereiste volume per put af te geven. Bereid een gradiënt voor met topzaaiing van een miljoen cellen tot een lage zaaidichtheid van 4.000 cellen. Doseer vervolgens 100 microliter KSR DMSO-medium in 96-well lage bevestigingsplaten en voeg 100 microliter celzaaiverdunning toe.Incubeer de lage bevestigingsplaat gedurende vijf dagen. Verander 50% van het medium op de derde of vierde dag na het zaaien wanneer de sferoïden voldoende compact zijn. Verander op dag vijf het medium in hepatocytenrijpingsmedium en kweek de cellen erin gedurende nog eens zeven tot 10 dagen, waarbij het medium elke 48 uur wordt vervangen.Nadat u de cellen gedurende 4, 8, 15 en 24 dagen hebt gekweekt met behulp van de eerder beschreven differentiatiemethode, verwijdert u de media. Incubeer de cellen met voorverwarmde fixatieven die 4% paraformaldehyde bevatten in PBS gedurende 10 minuten. Gooi vervolgens het fixatief weg en was de cellen twee keer met PBS gedurende elk vijf minuten.Voeg onmiddellijk 0,1% Triton X-100-oplossing toe en permeabiliseer de cellen gedurende vijf minuten voordat u PBS twee keer wast. Voeg een blokkeringsoplossing gemaakt van PBS en 5% runderserumalbumine of BSA toe voordat u de cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur op een wipplaat plaatst. Verdun primaire antilichamen in verdunningsbuffer 1% BSA PBS en voeg 50 microliter van de antilichaamverdunning per put toe.Gooi de antilichaamoplossing na een incubatie van één uur bij kamertemperatuur weg en geef drie wasbeurten van elk vijf minuten met PBS. Voeg 50 microliter secundaire antilichamen verdund in verdunningsbuffer toe in elke put en incuber de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Nadat u de cellen drie keer met PBS gedurende vijf minuten hebt gewassen, monteert u de afdekstroken met montagemedia die DAPI bevatten voor microscopische analyse.Gooi de kweekmedia voorzichtig weg zonder de sferoïden aan te raken en voeg vers bereide PBS toe met 0,1% Triton X-100-oplossing en incubeer gedurende vijf minuten om de cellen te permeabiliseren. Was de sferoïden twee keer met het medium door het medium langzaam te pipetteren. Incubeer vervolgens de sferoïden met 50 microliter van de primaire antilichamen gedurende een uur.Als u klaar bent, verwijdert u voorzichtig de overtollige antilichaamoplossing en geeft u drie wasbeurten medium. Bereid de overeenkomstige secundaire antilichamen zoals geitenantimuis IgG Cy3, geitenantimuis IgG 488 en konijn anti-kip IgG Texas Red in PBS met 1% BSA en voeg 50 microliter antilichaamverdunning per put toe vóór 20 minuten incubatie in de kooldioxide-incubator. Nogmaals, was driemaal met het medium vóór 30 minuten incubatie in de couveuse.Schakel de fluorescentielichtbron 10 minuten voor gebruik in. Schakel de computer in en open de beeldbewerkingssoftware. Gebruik het 4X-vergrotingsobjectief door op de 4X-knop in de werkbalk te klikken om de juiste schaalbalk te selecteren.Plaats vervolgens de 96-putplaat op de middenplaat van het podium. Schakel de LED-lichtbron in, gebruik het brightfield-filter en plaats de plaat in de gewenste put met behulp van de XY-astrapverstelknop. Ga naar het lichtpad van de camera en klik op de live-knop in de beeldbewerkingssoftware om het beeld op het scherm te visualiseren.Zorg ervoor dat de sferoïde gecentreerd is met behulp van de XY-asknoppen en stel scherp met behulp van de grove of fijne scherpstelknop. Kies vervolgens de brightfield-observatiemethode in de werkbalk, zet de belichtingsinstellingen op automatisch en klik op de snapshotknop in het bedieningspaneel van de camera om een foto te maken. Sla de afbeelding vervolgens op als vsi-bestand met de juiste naam in de gewenste map.Plaats een afschermingsplaat voor omgevingslicht om het LED-licht uit te schakelen en vervang het filter voor B-excitatie. Kies dan voor de observatiemethode 488. Open de sluiter, maak een foto door op de snapshotknop te klikken en sluit de sluiter en sla het bestand op als een vsi.Herhaal het proces met een filter voor G-excitatie om het proces voor elke interessante put te herhalen. Morfologische veranderingen tijdens het leverdifferentiatieproces toonden aan dat de BD-PSC's in drie fasen differentieerden in hepatocyten. De eerste fase vertegenwoordigde de differentiatie in endodermale cellen.De tweede differentiatie in levervoorlopercellen vertoont een typische veelhoekige morfologie. En de derde, de rijping tot hepatocyten. Immunofluorescentieanalyse toonde de sterke expressie van endoderm humane levervoorlopermarkers zoals het alfa-fetoproteïne of APF en transthyretine of TTR in de cellen in de eerste fase van het leverdifferentiatieproces op L4 tot L8-dag.Hun expressie nam echter af op L15-dag. De expressie van albumine of ALB en hepatocyten nucleaire factor vier alfa of HNF4 alfa verscheen eerst bij L4, nam toe gedurende de differentiatietijd L4 tot L15 en bereikte een sterke en stabiele expressie tijdens de rijpingstijd L15 tot L24. Spontane aggregatie van cellen werd waargenomen in lage hechtingsplaten die hepatocyteninductie of rijpingsmedium geïnitieerde sferoïdevorming bevatten.Er werd een consistente correlatie waargenomen tussen steroïde sferoïde en het variabele aantal cellen. De sferoïden gevormd en gedifferentieerd bij L14 en levend gekleurd met antilichamen onthulden de potentiële hepatische functionele activiteit van BD-PSC's afgeleide sferoïden. De voorbereiding van mononucleaire cellen voor herprogrammering is de belangrijkste stap in deze procedure.Het genereren van menselijke leversferoïden is de eerste stap naar het creëren van organoïden in vitro vereenvoudigde versie van het orgaan in 3D met microanatomie vergelijkbaar met die in vivo. Organoïden die in het laboratorium zijn gemaakt, worden gebruikt om organogenese, ziekteontwikkeling en voedingsstoffen te bestuderen.

human-liver-spheroids-from-peripheral-blood-for-liver-disease-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates a method for generating a dual humanized mouse model with a human immune system and liver cells. It involves transplanting human liver cells and hematopoietic stem and progenitor cells into a transgenic immunodeficient mouse via intrasplenic injection, leading to engraftment of liver cells and development of human immune cells.

Developing a Humanized Mouse Model with Human Liver Cells and Immune Cells

Er wordt een techniek beschreven om menselijke hepatocyten en niet-parenchymale levercellen van dezelfde donor te isoleren. De verschillende leverceltypen vormen de basis voor functionele levermodellen en weefselengineering. Deze nieuwe methode streeft ernaar om levercellen met een hoge opbrengst en levensvatbaarheid te isoleren.

Protocol voor isolatie van primaire menselijke hepatocyten en Overeenkomstige Major Populaties van niet-parenchymale Liver Cells

Het doel van dit protocol is bedoeld als een stapsgewijze handleiding om uit te voeren van de experimenten van de 3-D "lever-on-a-chip" infectie met het hepatitis B-virus.

"Lever-on-a-Chip" culturen van primaire hepatocyten en Kupffer cellen voor Hepatitis B-virusinfectie

Dit protocol beschrijft een benadering voor de productie van hepatosferen van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een gedefinieerd cultuur systeem en cel zelf montage. Dit protocol is reproduceerbaar in een aantal cellijnen, kostenbesparend en maakt de productie mogelijk van stabiele menselijke hepatosferen voor biomedische toepassing.

Serum vrije productie van driedimensionale menselijke Hepatosferen uit pluripotente stamcellen

We stelden een microfysiologisch systeem (MPS) met darm- en leverorganoïden bloot aan paracetamol (APAP). Dit artikel beschrijft de methoden voor organoïde productie en APAP farmacokinetische en toxicologische eigendomsbeoordelingen in de MPS. Het beschrijft ook de weefselfunctionaliteitsanalyses die nodig zijn om de resultaten te valideren.

Een darm/levermicrofysiologisch systeem voor farmacokinetische en toxicologische beoordeling

Deze procedure werd vastgesteld om te worden gebruikt voor de ontwikkeling van geavanceerde 3D-leverculturen in vitro, die een meer fysiologisch relevante beoordeling kunnen bieden van de genotoxische gevaren die gepaard gaan met blootstelling aan nanomaterialen gedurende zowel acute als langdurige, herhaalde dosisschema's.

Geavanceerde 3D-levermodellen voor in vitro genotoxiciteitstests na langdurige blootstelling aan nanomaterialen

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Geneesmiddel-geïnduceerde leverbeschadiging (DILI) is een belangrijke oorzaak van falen van geneesmiddelen. Er is een protocol ontwikkeld om de DILI-aansprakelijkheid van een verbinding nauwkeurig te voorspellen met behulp van een levermicrofysiologisch systeem (MPS). Het levermodel maakt gebruik van de cocultuur van primaire levercellen en translationeel relevante eindpunten om cellulaire reacties op de behandeling te beoordelen.

Humane lever microfysiologisch systeem voor het beoordelen van geneesmiddel-geïnduceerde levertoxiciteit in vitro

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Hier beschrijven we een platform dat niet-invasieve in vivo beeldvorming mogelijk maakt van leversferoïden die zijn geënt in de voorste oogkamer van het oog van de muis. De workflow strekt zich uit van het genereren van sferoïden van primaire levercellen tot transplantatie in het oog van de muis en in vivo beeldvorming met cellulaire resolutie door confocale microscopie.

In vivo beeldvorming van leversferoïden geënt in de voorste oogkamer van het muizenoog

Leer hoe je humane leversferoïden genereert uit perifeer bloed voor toxicologie en geneesmiddelonderzoek. Deze niet-genetische methode biedt een alternatief voor schaarse primaire hepatocyten.

Humane leversferoïden uit perifeer bloed voor leverziektestudies

Meer video's verkennen