Menselijke mesenchymale stamcelverwerking voor klinische toepassingen met behulp van een gesloten semi-geautomatiseerde workflow

Benchtop centrifugatie is een open en handmatig proces dat uitdagend is om op te schalen. Ons protocol laat zien hoe de dissociatie, het wassen en oogsten van mesenchymale stamcellen, of MSC's, in één keer kan worden gesloten en geautomatiseerd. De installatie is eenvoudig.

Het hele proces kan buiten de bioveiligheidskast worden uitgevoerd in een klasse cGMP-faciliteit. Gesloten geautomatiseerde celverwerking vermindert handmatige verwerkingsstappen die risicogevoelig kunnen zijn en cGMP-naleving mogelijk maken. Deze methode kan worden toegepast op andere celtypen die zijn uitgebreid in meerlaagse kweeksystemen.

Het Counterflow Centrifugation System maakt het mogelijk om alle protocolstappen voor verschillende toepassingen te wijzigen. Dr. Alan Lam, stafwetenschapper van de stamcelbioprocessinggroep van het Bioprocessing Technology Institute, A star in Singapore, demonstreert deze procedure. Om te beginnen met de tegenstroomcentrifugatiekit voor eenmalig gebruik, verbindt u de kit voor eenmalig gebruik met de PVC-overdrachtszakken voor eenmalig gebruik via buislassen, zoals beschreven in de afbeelding.

Bevestig vervolgens in een bioveiligheidskast een 10-laagse meerlaagse kolf met confluent, Wharton's Jelly-afgeleide menselijke mesenchymale stamcellen of Wharton's Jelly HMSCs aan de aangepaste buisassemblage. Breng het bijgevoegde 10-laags kweekvat met de aangepaste buisassemblage over naar een bank en las het aan lijn E van de kit voor eenmalig gebruik. Ook. Las een steriele monsterpoort aan lijn G van de high-flow single-use kit.

Sluit vervolgens de oogstlijn H aan op een steriel kunstaas, voorzien van een spuit van 50 milliliter. Om de instrumentrun in te stellen, schakelt u het instrument in met behulp van de tuimelschakelaar aan de achterkant van het instrument en sluit u de laptop aan op de USBC-poort op het instrument met behulp van de meegeleverde USBC-kabel. Voer de grafische gebruikersinterface of GUI-software van Counterflow Centrifuge uit vanaf het bureaublad of het startmenu en meld u aan.

Laad vervolgens het protocol door op de knop Selecteer een protocol op de hoofdwelkomstpagina te klikken. Druk vervolgens op de blauwe ontgrendelingsknop op het instrument en open de glazen deur om de geassembleerde kit voor eenmalig gebruik op het tegenstroomcentrifugatiesysteem te laden. Begin met het ophangen van de zakken aan de hangerhaken in een volgorde die ze het beste uitlijnt met de buispoorten op de bellensensorstrips met de 10-laagse meerlaagse kolf onder een hoek geplaatst.

Lijn de kit uit met de twee kitlocatieknoppen. Rek de pompslang rond de peristaltische pomp en druk de witte bolvormige connector op zijn plaats. Bevestig de centrifugekamer door de zilveren hendel van de drager van de tegenstroomcentrifugekamer op te tillen en vast te zetten door de hendel rechtop te zetten.

Druk de slang van elke poort op de kit in de sporen langs de bellensensorstrips. Sluit de deur door op de deurvergrendeling te drukken. Druk op de knop Initiate op de GUI.

Er verschijnt een checklist. De eerste vier items zijn instrumentcontroles, terwijl de laatste twee gebruikerscontroles zijn. Zorg er op dit punt voor dat de tassen en aansluitingen overeenkomen met het kitbeeld en dat de handmatige klemmen open zijn.

Druk op Bevestigen om het scherm Protocolinvoer weer te geven. Stel de waarde van het dialoogvenster gegevensinvoer of oogstvolume in op 45 milliliter en druk op Bevestigen. Druk op de groene startknop op het instrument om de protocolrun te starten.

Zodra de eerste priming is voltooid, moet u ervoor zorgen dat het gebruikte medium volledig in de afvalzak wordt gepompt. Til in pauzestappen zoals aangegeven in de werkstroomtabel de meerlaagse kolf op en schud deze om de buffer gelijkmatig over alle laden te verdelen. Zodra dit is voltooid, plaatst u de 10-laags meerlaagse kolf terug in de oorspronkelijke trekpositie voor de volgende stappen.

Zorg er in stap 20 en 23 voor dat de trypsinized cellen volledig in de tussenzak worden overgebracht. Meng de tussenzak goed, handmatig, in stap 25. Gebruik in stap 26 een lokspuit van twee milliliter om door de bemonsteringspoort te monsteren.

Controleer in stap 29 en 30 de stabiele vorming van het gefluïdiseerde celbed. Het zou moeten zijn als het gefluïdiseerde celbed dat hier wordt getoond. De run is voltooid op de oprit om de stap te stoppen en alle knijpwaarden op het tegenstroomcentrifugatiesysteem worden automatisch gesloten.

Nadat het protocol is uitgevoerd, drukt u op de blauwe ontgrendelknop op het instrument en opent u de glazen deur. Sluit de oogstlijn aseptisch af met een handdraagbuissealer en breng de verzegelde spuit gevuld met de geconcentreerde celoogst voorzichtig over in de biologische veiligheidskast voor celtelling en cryopreservatie. Maak de kamer weer los met behulp van de hendel.

Trek de connector van de lamp uit de fitting en til de kit voorzichtig weg en gooi deze in een biohazard-zak. Reinig het instrument met ethanoldoekjes en sluit de deur. Sluit ten slotte eerst de GUI-toepassing voordat u de schakelaar aan de achterkant van het instrument uitschakelt.

De Wharton's Jelly MSC's verspreidden zich goed wanneer ze werden uitgebreid in zowel serumbevattende als serumvrije, xenovrije media. Die in serumvrij, xenovrij medium vertoonden echter iets langere fibroblastachtige spindelvormige morfologie, met een grotere gemiddelde celgrootte van 17 micron, in vergelijking met 15 micron in serummedium. In beide media bereikten de Wharton's Jelly HMSCs consequent een maximale celdichtheid van ongeveer 23.000 cellen per vierkante centimeter en een populatieverdubbelingstijd van 34 uur.

Toen de Wharton's Jelly HMSCs werden uitgebreid in 10-laags kweekvaten met behulp van de gedemonstreerde tegenstroomcentrifugatie, werd een tienvoudige volumereductie bereikt, waardoor celconcentraties tot 5,3 miljoen cellen per milliliter werden gegenereerd. Het protocol bereikte consequent een hoog celherstel van ongeveer 98% en een hoge cellevensvatbaarheid van ongeveer 99% voor drie onafhankelijke runs. De Wharton's Jelly HMSC's die met beide methoden werden geoogst, vertoonden karakteristieke oppervlaktemarkeringsprofielen die CD73-, CD90- en CD105-positief zijn, evenals CD34- en CD45-negatief.

De cellen geoogst uit tegenstroomcentrifugatie vertoonden een vergelijkbare kolonievormende eenheid fibroblasttest of CFU-potentiaal, vergeleken met die geoogst door handmatige centrifugatie. In beide methoden behielden de cellen het vermogen om te differentiëren in adipocyten, osteoblasten en chondrocyten. De cytokinesecretieprofielen van cellen na tegenstroomcentrifugatie waren vergelijkbaar met pre-tegenstroomcentrifugatie.

Zorg ervoor dat u de kit voor eenmalig gebruik samenstelt met betrekking tot de bedopstelling, verplaats deze in deze Counterflow Centrifusion System Protocol Builder. Het protocol voor het wassen van resterende onzuiverheden uit het eindproduct kan worden gebruikt in klinische toepassingen om de gebruikers te ondersteunen bij het voldoen aan hun criteria voor het vrijgeven van de partij. Om het proces van vloeistofoverdracht voor grootschalige verwerking te versnellen, kunnen externe pompen worden gebruikt om de trypsine-inhoud eerst in een transferzak over te brengen, in plaats van direct uit de meerlaagse kolf te oogsten.