Evaluatie van antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken in vitro

De protocollen bieden een methode om de antimicrobiële activiteiten van nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken te onderzoeken, van vooronderzoeken tot complexere oppervlakteonderzoeken. In tegenstelling tot eerder beschreven methoden die resulteerden in onvergelijkbare gegevens in verschillende studies, produceren deze methoden consistente en vergelijkbare resultaten voor verschillende nanodeeltjesmaterialen, nanogestructureerde materialen en microbiële soorten. Het handhaven van een homogene verdeling van nanodeeltjes in methoden A en B kan moeilijk zijn.

Vortex-monsters grondig zorgen voor suspensie van nanodeeltjes, en pipetteren drie tot vier keer tussen aliquots zal suspensies behouden Begin met het verzamelen van gekweekte bacteriën door één milliliter van de 's nachts gekweekte bacteriecultuur in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen te aliquoteren. Nadat u een voldoende aantal aliquots hebt gemaakt, centrifugeert u ze om de gewenste zitdichtheid te bereiken. Verzamel het supernatant in een opvangbak.

En suspensie de celpellet opnieuw in 0,5 milliliter vers groeimedium. Combineer de suspensie uit twee buizen en herhaal de centrifugalisatie. Geef na het centrifugeren een tweede wasbeurt met vers groeimedium en herhaal het combineren van de inhoud van twee buizen in één voordat u de buizen centrifugeert.

Geef de derde wasbeurt met 0,33 milliliter trisbuffer of hydroxyethylaminomethaanbuffer. Combineer de drie suspensies, elk met een volume van 0,33 milliliter, in één microcentrifuge van 1,5 milliliter. Verwijder na centrifugalisatie het supernatant uit de gepelletiseerde cellen en suspensie de celpellet opnieuw in één milliliter verse tris-buffer die bekend staat als de celsuspensie of een vertragingsfase bacteriële zaaicultuur.

Om de bacterie- en nanodeeltjesculturen te vormen, aliquoteert u de twee milliliter van de bacteriële zaaicultuur in elke put van een 12-goed niet-weefselbehandelde polystyreenplaat. Voeg voor elke microcentrifugebuis van vijf milliliter die vooraf gewogen magnesiumoxidedeeltjes bevat, drie milliliter van de bacteriële zaaicultuur toe. En draai de buis kort om de magnesiumoxide nanodeeltjes met de bacteriën te mengen.

Na het mengen, aliquot een milliliter van de magnesiumoxide nanodeeltjes suspensie naar drie afzonderlijke putten om de drievoudige monsters van elk vooraf gemeten gewicht van magnesiumoxide nanodeeltjes te creëren. Incubeer het monster 's nachts bij 37 graden Celsius en 120 tpm. En breng een monster van drie milliliter over in een individuele conische buis van 15 milliliter met behulp van een pipet.

Voer vervolgens één tot 10 seriële verdunning uit in een 96-putplaat door 180 microliter trisbuffer toe te voegen aan elke put in rij B tot rij G voor het juiste aantal kolommen. Draai kort een conische buis van 15 milliliter met bacteriële monsters en voeg 50 microliter bacteriemonster toe aan een individuele put in rij A.Breng vervolgens vanuit rij A 20 microliter bacterieel monster over in de overeenkomstige put van rij B met kort mengen. Breng met behulp van een steriele pipetpunt 20 microliter over van de put in rij B naar de overeenkomstige put in rij C.Ga hiermee door tot rij G om de seriële verdunning van 10 naar de negatieve in rij B naar 10 naar de negatieve zes in rij G te voltooien.Als u klaar bent, pipet u 100 microliter van elke put in een geschikte groeiagarplaat, en verspreid over de plaat om de celcultuur te verspreiden.

Plaats de putplaten een nacht in een incubatorschudder bij 37 graden Celsius en incuber de agarplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. Onderzoek de plaat en tel de platen met ongeveer 25 tot 300 kolonies. Kies indien mogelijk platen met dezelfde verdunningswaarde.

Verdun voor elk te testen materiaal de nachtelijke bacteriële monsters door drie aliquots van 200 microliter aan het groeimedium toe te voegen in drie putten en drie aliquots van 200 microliter van de bacteriecultuur in extra putten. Plaats de 96-putplaat in de plaatlezer en scan deze. Blijf indien nodig bouillon of nachtelijke bacteriecultuur toevoegen totdat de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD 600, ongeveer 0,01 is bereikt.

Om bacteriële nanodeeltjessuspensies en steriele media-nanodeeltjessuspensies te bereiden, verwijdert u één milliliter bacteriecultuur of -medium uit een drievoudige set conische buizen van 15 milliliter. En voeg het toe aan een centrifugebuis van vijf milliliter met vooraf gemeten nanodeeltjes. Vortex de buizen om de oplossing te mengen.

Verdeel de nanodeeltjes homogeen door één milliliter aliquots over te brengen van de vijf milliliter centrifugebuis naar de 15 milliliter conische buis. Als u klaar bent, aliquot dan 200 microliter van elk monster in de afzonderlijke putten van een 96-putplaat. Nadat u de eerder beschreven zitdichtheid hebt bepaald, voegt u de monsters toe en controleert u deze in de afzonderlijke putjes van een 48-put, niet-weefselbehandelde polystyreenplaat.

Vervolgens wordt de 0,75 milliliter van de celsuspensie in elk putje met de monsters en controles geïnventariseerd. Plaats de 48-putplaat gedurende 24 uur in een incubatorschudder bij 37 graden Celsius, met schudden bij 120 RPM. Verzamel na incubatie twee monsters van elke groep en breng ze afzonderlijk over in gelabelde microcentrifugebuizen van vijf milliliter.

Voeg twee milliliter herziene gesimuleerde lichaamsvloeistof, of RSBF, toe aan elke buis. Bereid gesteriliseerd lachgas cellulosepapier voor door ze in een diameter van één centimeter te snijden. Leg het gesneden nitrocellulosepapier op een agarplaat met het juiste medium.

Voeg vervolgens 50 microliter van de verdunde bacteriecultuur toe aan het filterpapier voordat u 50 microliter van een geschikt medium toevoegt aan het midden van elk monsteroppervlak. Pak met een gesteriliseerd pincet het saltraatcellosepapier van het oppervlak van de vijzel. Draai het saltraatcellulosepapier voorzichtig om en plaats het op het monsteroppervlak, zodat de bacteriën in contact komen met de 50 microliter medium en het nanogestructureerde oppervlak van belang.

Als het monster in cultuur afbreekbaar is, plaats er dan een houder onder om het op te tillen om contact met de trisbuffer te voorkomen. Houd de luchtvochtigheid op peil door een milliliter trisbuffer toe te voegen aan een monster dat put bevat. Verzamel na een nacht incubatie het nitrocellulosepapier van elk monsteroppervlak en plaats ze in vijf milliliter trisbuffer.

Vortex het verzamelde filterpapier en nanooppervlak materiaalmonsters gedurende vijf seconden. Verzamel de tris-buffersuspensies uit het monster en plaats ze in afzonderlijke verse opvangbuizen. De antimicrobiële effecten met behulp van methode A geïdentificeerde minimale en remmende concentratie, of MIC, van één milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes, en minimale bacteriocidale concentraties, of MBC 99,9, van respectievelijk 1,0 en 1,6 milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes voor gramnegatieve Escherichia coli en pseudomonas aeruginosa.

De grampositieve staphylococcus epidermis, S.Aureus en methicilline-resistente staphylococcus aureus, of MRSA, toonden de MIC-waarden van respectievelijk 0,5, 0,7 en één milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes. NBC 99,99 waarden van 1,6 en 1,2 milligram per milliliter werden geïdentificeerd voor respectievelijk S.epidermis en S.aureus. Terwijl MRSA niet verder kwam dan NBC 90.

MIC's van 1,2 en één milligram per milliliter werden geïdentificeerd in geneesmiddelgevoelige en medicijnresistente candida-soorten, respectievelijk C albicans en C albicans fluconazolresistent of FR. Magnesiumoxide nanodeeltjes vertoonden daarentegen MIC-waarden van één en 0,7 milligram per milliliter, of respectievelijk C.glabrata en C glabrata echinocandine resistent, of ER. Elke kandidaat-soort bereikte een NBC 90 van 0,7 tot 1,2 milligram per milliliter, maar alleen C.glabrata ER werd gereduceerd tot NBC 99,9 bij 1,2 milligram per milliliter.

In methode B groeide MRSA blootgesteld aan nanodeeltjes exponentieel tot een OD van 0,85. Blootstelling aan 1,2 milligram per milliliter magnesiumoxide nanodeeltjes en 6,25 milligram per milliliter trimethoprim resulteerde in respectievelijk 80,2% en 81,6% verminderde bacteriegroei. Evenzo verminderde 2,9 milligram per milliliter magnesiumhydroxide nanodeeltjes de bacteriële groei tot 70,3% Blootstelling aan één microliter per milliliter vancomycine resulteerde in een vermindering van 99,99% in de groei van MRSA, wat de bacteriostatische activiteit van magnesiumoxide en magnesiumhydroxide nanodeeltjes suggereert.

Methode C toonde geen remming van de bacteriegroei bij indirect contact. De resultaten gaven aan dat ZC21 de sterkste antibacteriële activiteit had tegen de adhesie en groei van MRSA, voor alle geteste monsters. In methode D werd geen levensvatbare stafylokok aureus geïdentificeerd in de 1,9A-, 1,9 AA- en EPD-monsters of hun gepaarde filterpapieren.

Blootstelling aan de EPD-monsters na een knieval verminderde echter de bacteriegroei naar een paar cellen op het nanogestructureerde oppervlak en het uitgeklede filterpapier. Het identificeren van antimicrobiële activiteiten op nanodeeltjes en nanogestructureerde oppervlakken heeft geleid tot aanvullend onderzoek in bio-engineeringtoepassingen, waaronder die met betrekking tot chronische wonden en implantaatgerelateerde infecties.