Name: Toepassing van AlDeSense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-31T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer ALDH1A1-activiteit meten in eierstokkankercellen met behulp van een isoform-selectieve fluorogene probe en flowcytometrie. Deze methode biedt hoge specificiteit voor stamcelbiomarkerdetectie in levende cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door The National Institutes of Health (R35GM133581 naar JC) en het Cancer Center at Illinois Graduate Scholarship (toegekend aan SG). JC bedankt de Camille and Henry Dreyfus Foundation voor de steun. De auteurs bedanken Dr. Thomas E. Bearrood voor zijn eerste bijdrage aan het voorbereiden van voorraden AlDeSense en AlDeSense AM. Wij danken de heer Oliver D. Pichardo Peguero en de heer Joseph A. Forzano voor hun hulp bij het bereiden van verschillende synthetische precursoren. We danken Prof. Erik Nelson (Department of Molecular and Integrative Physiology, UIUC) voor Caov-3, IGROV-1 en PEO4 cellen. Wij danken Prof. Paul Hergenrother (Vakgroep Chemie, UIUC) voor BG-1 cellen. We danken de Core Facilities van het Carl R. Woese Institute for Genomic Biology voor de toegang tot de Zeiss LSM 700 Confocal Microscope en bijbehorende software. We danken de Flow Cytometry Facility voor de toegang tot BD LSR II CMtO Analyzer. We danken Dr. Sandra McMasters en de Cell Media Facility voor hun hulp bij het voorbereiden van celkweekmedia.

1. Meet de totale ALDH1A1-activiteit in homogenaten van eierstokkankercellen via fluorimetrie
<ol><li>Ontdooi 1 × 106 cellen in een T25-celkweekkolf in 5 ml van de volgende celkweekmedia:<ol><li>IGROV-1 en PEO4: Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).</li>
		<li>BG-1 en Caov-3: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% P/S.</li>
		<li>OVCAR-3: RPMI 1640 met 20% FBS, 1% P/S en 0,01 mg/ml insuline.</li>
	</ol></li>
	<li>Houd de cellen in een incubator op 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie passages. Zorg ervoor dat de cellen niet meer dan 80% -90% samenvloeiing hebben voordat ze passeren.</li>
	<li>Trypsiniseer de cellen in 0,25% trypsine gedurende 10 minuten, tel ze met behulp van een geautomatiseerde celteller en pellet 1 × 107 cellen via centrifugatie (180 × g) bij 25 °C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verwijder het supernatant voorzichtig via aspiratie, was de pellet door de cellen opnieuw te suspenseren in 1 ml 1x PBS en pellet de cellen opnieuw via centrifugeren onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 4.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen in een oplossing van 1x proteaseremmer in 1x PBS. Gebruik 1 ml van deze oplossing per 2,5 × 106 cellen.</li>
	<li>Soniceer de celsuspensie op ijs gedurende 2 minuten (1 s puls, 40% amplitude) met een celhomogenisatorsonde.</li>
	<li>Pellet onoplosbare/membraanfracties via centrifugatie (3.200 × g) bij 25 °C gedurende 15 min. Verwijder en bewaar het supernatant, omdat dit het homogenaat is dat in volgende stappen zal worden gebruikt. Scheid de homogenaten in drie cuvetten om het experiment in drievoud uit te voeren.</li>
	<li>Voeg de sonde toe aan het homogenaat om een uiteindelijke sondeconcentratie van 4 μM te verkrijgen. Pipetteer driemaal op en neer om de oplossing goed te mengen.</li>
	<li>Meet het fluorescerende signaal direct na toevoeging en na gewenste incubatietijden op een fluorimeter. De incubatietijd kan worden geoptimaliseerd om de maximale vouwbeurt te zien (1 uur in dit experiment). De incubatietijd moet constant zijn over alle vergeleken cellijnen.<ol><li>Stel de excitatiegolflengte in op 496 nm.</li>
		<li>Stel de emissie in op 510-600 nm.</li>
		<li>Stel de spleetbreedte in op 0,5 mm.</li>
		<li>Pipetteer de oplossing in een kwartscuvet van 1 ml, plaats deze in de fluorimeter en druk op de scan.</li>
	</ol></li>
	<li>Deel de uiteindelijke fluorescentie-intensiteit bij 516 nm (maximale fluorescerende golflengte) door de intensiteit bij dezelfde golflengte vanaf de eerste meting om de vouwactivering van de isovormselectieve kleurstof te bepalen.</li>
</ol>2. Gebruik van fluorescentiemicroscopie om cellen met hoge ALDH1A1-activiteit af te beelden
<ol><li>Ontdooi 1 × 106 cellen in een T25-celkweekkolf in 5 ml van de juiste celkweekmedia.</li>
	<li>Houd de cellen in een incubator op 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie passages. Zorg ervoor dat de cellen niet meer dan 80% -90% samenvloeiing hebben voordat ze passeren.</li>
	<li>De dag voorafgaand aan confocale beeldvorming, plaat 4 × 105 cellen in een 8-well kamer glijden.<ol><li>Bedek de bodem van elke put met poly-L-lysine (0,1 mg / ml, 100 μl per put) gedurende 10 minuten en zuig vervolgens op.</li>
		<li>Was elke put 3x door water van celkweekkwaliteit (100 μL per put) toe te voegen en aan te zuigen.</li>
		<li>Trypsiniseer de cellen in 0,25% trypsine gedurende 10 minuten, tel ze met behulp van een geautomatiseerde celteller en plaats de cellen op 4 × 105 cellen per put.</li>
		<li>Laat de cellen bezinken en hechten 's nachts (12-16 uur).</li>
	</ol></li>
	<li>Zuig de groeimedia aan en voeg serumvrije media (500 μL per put) toe, aangevuld met 2 μM van de sonde of de controlesonde.</li>
	<li>Incubeer met de sonde bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten en breng de cellen onmiddellijk in beeld.</li>
	<li>Schakel de confocale microscoop in en pas het monster aan.<ol><li>Laad het monster voorzichtig bij de laagste vergroting; Zoek de cellen om de juiste positionering te garanderen.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de objectieflens 10x vergroting heeft en lokaliseer de cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voor dit experiment zijn het FITC-kanaal (excitatie: 488 nm laser; emissie: 516-521 nm) en T-PMT (doorgelaten licht) kanaal vereist. Lokaliseer en focus op de cellen die T-PMT gebruiken om gedurende het hele experiment op hetzelfde z-vlak te focussen om bias te verwijderen.</li>
	<li>Pas het laservermogen en de FITC-versterking aan de juiste instelling aan, waarbij het signaal van de Ctrl-AlDeSense AM-monsters minimaal detecteerbaar is, terwijl het signaal nog steeds wordt gezien in AlDeSense AM-monsters. Elke parameter kan worden aangepast door de bijbehorende balk te schuiven. De instellingen moeten mogelijk een paar keer worden aangepast om de juiste parameters te identificeren. Eenmaal geoptimaliseerd, voltooit u de rest van het experiment binnen die cellijn met identieke parameters.</li>
	<li>Maak drie foto's per put voor een totaal van drie putten per behandelingsconditie (negen afbeeldingen in totaal). Focus op het juiste vlak met behulp van T-PMT om bias te voorkomen in plaats van het fluorescentiekanaal of samengevoegde afbeelding te gebruiken.</li>
	<li>Verwerk de afbeeldingen om het percentage ALDH1A1+-cellen te bepalen.<ol><li>Splits het czi-bestand met behulp van beeldverwerkingssoftware op in verschillende kanalen.</li>
		<li>Tel het totale aantal cellen en het totale aantal fluorescerende cellen.</li>
		<li>Om het percentage ALDH1A1+-cellen te bepalen, deelt u het aantal fluorescerende cellen door het totale aantal cellen in elke afbeelding. Het is noodzakelijk om voor elke afbeelding op dezelfde manier te tellen zonder de afbeeldingen te manipuleren, omdat bijvoorbeeld het aanpassen van de helderheid een verstorende variabele kan toevoegen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Toepassing van flowcytometrie om cellen met een hoge ALDH1A1-activiteit te identificeren
<ol><li>Ontdooi 1 × 106 cellen in een T25-celkweekkolf in 5 ml van de juiste celkweekmedia.</li>
	<li>Houd de cellen in een incubator op 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie passages. Zorg ervoor dat de cellen niet meer dan 80% -90% samenvloeiing hebben voordat ze passeren.</li>
	<li>Trypsiniseer, tel en pelleteer de cellen in een centrifugebuis van 15 ml via centrifugatie (180 × g) bij 25 °C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Resuspendie van de cellen in 1 ml 2 μM sonde/controlesondeoplossing in PBS. Schommel de cellen gedurende 60 minuten op kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat de blootstelling aan de kleurstof gelijkmatig is.</li>
	<li>Pellet de cellen na de incubatietijd via centrifugeren (180 × g) gedurende 5 minuten bij 25 °C. Resuspendie van de cellen in 0,5 ml PBS. Voer de cellen door een celzeef (35 μm nylon gaas) om celklonten te verwijderen die de flowcytometer kunnen verstoppen. Plaats de cellen onmiddellijk op ijs.</li>
	<li>Schakel het instrument in en voer het opstartprotocol uit.</li>
	<li>Controleer op mantelvocht en leeg afval.</li>
	<li>Laat de lijnen met 10% bleekmiddel en water elk 5 minuten lopen.</li>
	<li>Voer kwaliteitscontrolekralen uit om een goede werking te garanderen.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Instellingen FSC (forward scatter), SSC (side scatter) en FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat) voor het fluorescentiefilter.</li>
	<li>Teken de volgende grafieken om te controleren op levensvatbaarheid, singlets en fluorescentie. Optimaliseer het laservermogen (specifiek voor het instrument van de gebruiker) zodat de celpopulaties binnen de gegeven parameters liggen voor verdere analyse.<ol><li>FSC-A versus SSC-A scatter plot: de hoofdcelpopulatie bevindt zich in het midden van de grafiek.</li>
		<li>FSC-A versus FSC-W scatter plot: smalle horizontale band die wijst op singlets (in plaats van celklonten).</li>
		<li>FITC-A versus FSC-A scatter plot: observeer de verdeling van cellen gesorteerd door de isoform-selectieve fluorogene turn-on probe.</li>
		<li>FITC-A histogram: observeer de verschuiving in populatie op basis van FITC om het percentage ALDH1A1+ cellen te bepalen.</li>
	</ol></li>
	<li>Om het FITC-laservermogen te optimaliseren, voert u een monster uit met de sonde, zodat de rechterstaart van de histogramcurve zich in de buurt van het maximale FITC-A-signaal bevindt. Voer vervolgens een monster uit met de controlesonde. Een populatieverschuiving moet waarneembaar zijn om het maximale dynamische bereik te onthullen. De optimalisatiestap van het laservermogen moet mogelijk meerdere keren worden herhaald, maar het laservermogen mag niet worden gewijzigd in monsters zodra een instelling is aangewezen voor een experiment.</li>
	<li>Voer elk monster uit voor 10.000 tellingen (uitgevoerd in drievoud).</li>
	<li>Herhaal stap 3.12 voor elke cellijn, omdat er variabiliteit zal zijn in opname en ALDH1A1-activiteit.</li>
	<li>Nadat het monster is verzameld, voert u de lijnen uit met 10% bleekmiddel en water gedurende elk 5 minuten en start u vervolgens het uitschakelen van het instrument.</li>
	<li>Verwerk de gegevens met behulp van de flowcytometriesoftware en gate de gewenste celpopulatie. Stel de poorten zo in dat alle gebeurtenissen in de ALDH1A1- of ALDH1A1+ poort vallen. Stel met behulp van de rechthoekige poortselectie de ALDH1A1-poort zo in dat >99,5% van de gebeurtenissen in de monsters van de controlesonde binnen deze poort plaatsvinden. De overige cellen worden beschouwd als ALDH1A1+. Dezelfde poorten kunnen vervolgens worden toegepast op het sondemonster om het aantal gebeurtenissen te kwantificeren dat als ALDH1A1- en ALDH1A1+ wordt beschouwd.</li>
</ol>

<ol><li>Bonnet, D., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+acute+myeloid+leukaemia+is+organised+as+a+heirarchy+that+originates+from+a+primitive+haematopoetic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human acute myeloid leukaemia is organised as a heirarchy that originates from a primitive haematopoetic cell.</a> Nature Medicine. 3 (7), 730-737 (1997).</li>
<li>Begicevic, R. R., Falasca, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+transporters+in+cancer+stem+cells%3A+Beyond+chemoresistance%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">ABC transporters in cancer stem cells: Beyond chemoresistance.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2362(2017).</li>
<li>Cojoc, M., Mäbert, K., Muders, M. H., Dubrovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+cancer+stem+cells+in+therapy+resistance%3A+Cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for cancer stem cells in therapy resistance: Cellular and molecular mechanisms.</a> Seminars in Cancer Biology. 31, 16-27 (2015).</li>
<li>Islam, F., Gopalan, V., Smith, R. A., Lam, A. K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+potential+of+cancer+stem+cells%3A+A+review+of+the+detection+of+cancer+stem+cells+and+their+roles+in+cancer+recurrence+and+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Translational potential of cancer stem cells: A review of the detection of cancer stem cells and their roles in cancer recurrence and cancer treatment.</a> Experimental Cell Research. 335 (1), 135-147 (2015).</li>
<li>Li, F., Tiede, B., Massagué, J., Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+tumorigenesis%3A+Cancer+stem+cells+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Beyond tumorigenesis: Cancer stem cells in metastasis.</a> Cell Research. 17 (1), 3-14 (2007).</li>
<li>Kim, W. T., Ryu, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+surface+markers+on+normal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell surface markers on normal stem cells.</a> BMB Reports. 50 (6), 285-298 (2017).</li>
<li>Pors, K., Moreb, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenases+in+cancer%3A+An+opportunity+for+biomarker+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenases in cancer: An opportunity for biomarker and drug development.</a> Drug Discovery Today. 19 (12), 1953-1963 (2014).</li>
<li>Jackson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+the+aldehyde+dehydrogenase+gene+%28ALDH%29+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Genomics%22%5BJournal%5D)">Update on the aldehyde dehydrogenase gene (ALDH) superfamily.</a> Human Genomics. 5 (4), 283-303 (2011).</li>
<li>Vasiliou, V., Pappa, A., Petersen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+aldehyde+dehydrogenases+in+endogenous+and+xenobiotic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Role of aldehyde dehydrogenases in endogenous and xenobiotic metabolism.</a> Chemico-Biological Interactions. 129 (1-2), 1-19 (2000).</li>
<li>Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+stem+cells+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer.</a> Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).</li>
<li>Anorma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+cancer+stem+cell+plasticity+using+an+isoform-selective+fluorescent+probe+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Surveillance of cancer stem cell plasticity using an isoform-selective fluorescent probe for aldehyde dehydrogenase 1A1.</a> ACS Central Science. 4 (8), 1045-1055 (2018).</li>
<li>Bearrood, T. E., Aguirre-Figueroa, G., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+red+fluorescent+sensor+for+ALDH1A1+displaying+enhanced+cellular+uptake+and+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rational design of a red fluorescent sensor for ALDH1A1 displaying enhanced cellular uptake and reactivity.</a> Bioconjugate Chemistry. 31 (2), 224-228 (2020).</li>
<li>Chan, J., Dodani, S. C., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-based+small-molecule+fluorescent+probes+for+chemoselective+bioimaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reaction-based small-molecule fluorescent probes for chemoselective bioimaging.</a> Nature Chemistry. 4 (12), 973-984 (2012).</li>
<li>East, A. K., Lucero, M. Y., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+of+activity-based+sensing+for+in+vivo+NIR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">New directions of activity-based sensing for in vivo NIR imaging.</a> Chemical Science. 12 (10), 3393-3405 (2021).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+NIR+bioluminescence+probe+enables+discovery+of+diet-induced+modulation+of+the+tumor+microenvironment+via+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Activity-based NIR bioluminescence probe enables discovery of diet-induced modulation of the tumor microenvironment via nitric oxide.</a> ACS Central Science. 8 (4), 461-472 (2022).</li>
<li>Yadav, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activity-based+sensing+approach+for+the+detection+of+cyclooxygenase-2+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">An activity-based sensing approach for the detection of cyclooxygenase-2 in Live Cells.</a> Angewandte Chemie. 59 (8), 3307-3314 (2020).</li>
<li>Ueno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+principles+for+modulating+fluorescence+properties+of+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Rational principles for modulating fluorescence properties of fluorescein.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (43), 14079-14085 (2004).</li>
<li>Tanaka, F., Mase, N., Barbas 3rd, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+use+of+fluorogenic+aldehydes+for+monitoring+the+progress+of+aldehyde+transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Design and use of fluorogenic aldehydes for monitoring the progress of aldehyde transformations.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3692-3693 (2004).</li>
<li>Thurber, G. M., Schmidt, M. M., Wittrup, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+tumor+penetration%3A+transport+opposed+by+systemic+and+antigen-mediated+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Antibody tumor penetration: transport opposed by systemic and antigen-mediated clearance.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60 (12), 1421-1434 (2008).</li>
<li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li>
<li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1+maintains+ovarian+cancer+stem+cell-like+properties+by+altered+regulation+of+cell+cycle+checkpoint+and+DNA+repair+network+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1 maintains ovarian cancer stem cell-like properties by altered regulation of cell cycle checkpoint and DNA repair network signaling.</a> PLoS One. 9 (9), e107142(2014).</li>
<li>Kaipio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1A1-related+stemness+in+high-grade+serous+ovarian+cancer+is+a+negative+prognostic+indicator+but+potentially+targetable+by+EGFR%2FmTOR-PI3K%2Faurora+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1A1-related stemness in high-grade serous ovarian cancer is a negative prognostic indicator but potentially targetable by EGFR/mTOR-PI3K/aurora kinase inhibitors.</a> The Journal of Pathology. 250 (2), 159-169 (2020).</li>
<li>Deng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+levels+and+patterns+of+stem+cell+marker%2C+aldehyde+dehydrogenase+isoform+1+%28ALDH1%29%2C+in+human+epithelial+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct expression levels and patterns of stem cell marker, aldehyde dehydrogenase isoform 1 (ALDH1), in human epithelial cancers.</a> PLoS One. 5 (4), e10277(2010).</li>
<li>Chang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+expression+correlates+with+favorable+prognosis+in+ovarian+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">ALDH1 expression correlates with favorable prognosis in ovarian cancers.</a> Modern Pathology. 22 (6), 817-823 (2009).</li>
<li>Gardner, S. H., Reinhardt, C. J., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+activity-based+sensing+probes+for+isoform-selective+imaging+of+enzymatic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Advances in activity-based sensing probes for isoform-selective imaging of enzymatic activity.</a> Angewandte Chemie. 60 (10), 5000-5009 (2021).</li>
<li>Reid, B. M., Permuth, J. B., Sellers, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+ovarian+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of ovarian cancer: a review.</a> Cancer Biology and Medicine. 14 (1), 9-32 (2017).</li>
<li>Tulake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+stem+cell+markers+ALDH1A1+and+OCT4+as+potential+biomarkers+for+the+early+detection+of+cervical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Letters%22%5BJournal%5D)">Upregulation of stem cell markers ALDH1A1 and OCT4 as potential biomarkers for the early detection of cervical carcinoma.</a> Oncology Letters. 16 (5), 5525-5534 (2018).</li>
<li>Nwani, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+ALDH1A1+inhibitor+targets+cells+with+stem+cell+characteristics+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">A novel ALDH1A1 inhibitor targets cells with stem cell characteristics in ovarian cancer.</a> Cancers. 11 (4), 502(2019).</li>
<li>Roy, M., Connor, J., Al-Niaimi, A., Rose, S. L., Mahajan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1A1+%28ALDH1A1%29+expression+by+immunohistochemistry+is+associated+with+chemo-refractoriness+in+patients+with+high-grade+ovarian+serous+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) expression by immunohistochemistry is associated with chemo-refractoriness in patients with high-grade ovarian serous carcinoma.</a> Human Pathology. 73, 1-6 (2018).</li>
<li>Landen Jr, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+aldehyde+dehydrogenase+cancer+stem+cells+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting aldehyde dehydrogenase cancer stem cells in ovarian cancer.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 9 (12), 3186-3199 (2010).</li>
<li>Condello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin-regulated+ALDH1A1+is+a+target+in+ovarian+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">β-catenin-regulated ALDH1A1 is a target in ovarian cancer spheroids.</a> Oncogene. 34 (18), 2297-2308 (2015).</li>
<li>Storms, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primitive+human+hematopoietic+progenitors+on+the+basis+of+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of primitive human hematopoietic progenitors on the basis of aldehyde dehydrogenase activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (16), 9118-9123 (1999).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescence+assay+for+aldehyde+dehydrogenase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A bioluminescence assay for aldehyde dehydrogenase activity.</a> Analytical Biochemistry. 434 (2), 226-232 (2013).</li>
<li>Minn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+red-shifted+fluorescent+substrate+for+aldehyde+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A red-shifted fluorescent substrate for aldehyde dehydrogenase.</a> Nature Communications. 5, 3662(2014).</li>
<li>Dollé, L., Boulter, L., Leclercq, I. A., van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+of+ALDH+substrates+and+their+potential+to+study+maturational+lineage+biology+in+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Next generation of ALDH substrates and their potential to study maturational lineage biology in stem and progenitor cells.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 308 (7), 573-578 (2015).</li>
<li>Yagishita, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+highly+selective+fluorescent+probe+enabling+flow-cytometric+isolation+of+ALDH3A1-positive+viable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of highly selective fluorescent probe enabling flow-cytometric isolation of ALDH3A1-positive viable cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (2), 302-306 (2017).</li>
<li>Maity, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiophene+bridged+aldehydes+%28TBAs%29+image+ALDH+activity+in+cells%3A+Via+modulation+of+intramolecular+charge+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Thiophene bridged aldehydes (TBAs) image ALDH activity in cells: Via modulation of intramolecular charge transfer.</a> Chemical Science. 8 (10), 7143-7151 (2017).</li>
<li>Koenders, S. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+retinal-based+probe+for+the+profiling+of+retinaldehyde+dehydrogenases+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a retinal-based probe for the profiling of retinaldehyde dehydrogenases in cancer cells.</a> ACS Central Science. 5 (12), 1965-1974 (2019).</li>
<li>Oe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep-red%2Fnear-infrared+turn-on+fluorescence+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1A1+in+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Deep-red/near-infrared turn-on fluorescence probes for aldehyde dehydrogenase 1A1 in cancer stem cells.</a> ACS Sensors. 6 (9), 3320-3329 (2021).</li>
<li>Yagishita, A., Ueno, T., Tsuchihara, K., Urano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+BODIPY-based+blue+fluorescent+probes+for+aldehyde+dehydrogenase+1-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amino BODIPY-based blue fluorescent probes for aldehyde dehydrogenase 1-expressing cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (2), 234-238 (2021).</li>
<li>Okamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+cancer+stem+cells+using+a+newly+developed+long-acting+fluorescence+probe%2C+C5S-A%2C+targeting+ALDH1A1%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of breast cancer stem cells using a newly developed long-acting fluorescence probe, C5S-A, targeting ALDH1A1.</a> Anticancer Research. 42 (3), 1199-1205 (2022).</li>
</ol>

We onthullen een aangevraagd patent (US20200199092A1) voor de AlDeSense-technologie.

Pan-selectiviteit is een belangrijke beperking van veel ALDH-sondes; Er zijn echter onlangs verschillende isovormselectieve voorbeelden gemeld 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41. De isovormsel...

Kankerstamcellen (CSC's) zijn een subpopulatie van tumorcellen die stamcelachtige eigenschappen vertonen1. Net als hun niet-kankerachtige tegenhangers bezitten CSC's het buitengewone vermogen om zichzelf te vernieuwen en te vermenigvuldigen. Samen met andere ingebouwde mechanismen, zoals de upregulatie van ATP-bindende cassettetransporters, worden CSC's vaak gespaard van initiële chirurgische debulking-inspanningen, evenals daaropvolgende adjuvante therapie2. Vanwege hun cruciale rol in behandelingsresistentie3, terugval4 en metastase5, zijn CSC's een prioriteit geworden in kankeronderzoek. Hoewel er een verscheidenheid aan celoppervlakantigenen (bijv. CD133) zijn die kunnen worden gebruikt om CSC's6 te identificeren, is het benutten van de enzymatische activiteit van aldehydedehydrogenasen (ALDHs) in het cytoplasma naar voren gekomen als een aantrekkelijk alternatief7. ALDH's zijn een superfamilie van 19 enzymen die verantwoordelijk zijn voor het katalyseren van de oxidatie van reactieve endogene en xenobiotische aldehyden tot de overeenkomstige carbonzuurproducten8.
Over het algemeen is aldehyde-ontgifting cruciaal bij het beschermen van cellen tegen ongewenste crosslinking-gebeurtenissen en oxidatieve stress die de integriteit van stamcellen kunnen schaden9. Bovendien regelt de 1A1-isovorm het retinoïnezuurmetabolisme, dat op zijn beurt de stengelheid beïnvloedt via retinaldehyde-signalering10. AlDeSense 11,12, een kleine-molecuul activity-based sensing (ABS) sonde om selectief ALDH1A1-activiteit te detecteren, is onlangs ontwikkeld. ABS-ontwerpen bereiken analytdetectie door middel van een chemische verandering in plaats van een bindingsgebeurtenis, waardoor een hoge selectiviteit en verminderde off-target responsenmogelijk zijn 13,14,15,16. Het ontwerpprincipe van de isovormselectieve fluorogene sonde is gebaseerd op een donor-foto-geïnduceerde elektronenoverdracht (d-PeT) blusmechanisme17, afkomstig van de aldehyde-functionele groep, die dient om de fluorescerende handtekening van de sonde18 te onderdrukken. Bij ALDH1A1-gemedieerde omzetting naar carbonzuur wordt stralingsrelaxatie ontgrendeld om een zeer fluorescerend product te verkrijgen. Omdat d-PeT-blussing nooit 100% efficiënt is, werd de resterende fluorescentie die kan leiden tot mogelijke vals-positieve resultaten overwogen bij het vaststellen van deze test door de ontwikkeling van Ctrl-AlDeSense, een niet-responsief reagens met overeenkomende fotofysische kenmerken (bijv. Kwantumopbrengst) en een identiek cytoplasmatisch kleuringspatroon in cellen. Wanneer deze unieke koppeling in combinatie wordt gebruikt, kan deze op betrouwbare wijze cellen met een hoge ALDH1A1-activiteit onderscheiden van cellen die lage niveaus vertonen via fluorimetrie, moleculaire beeldvorming en flowcytometrie. Verschillende belangrijke voordelen zijn verbonden aan het gebruik van isoform-selectieve activatable kleurstoffen ten opzichte van traditionele immunohistochemische methoden. Er wordt bijvoorbeeld verondersteld dat CSC's diep in een tumor worden begraven en dus toegankelijker zijn voor een klein molecuul in vergelijking met grote antilichamen19. Bovendien wijzigt het omgedraaide fluorescerende product geen enkele cellulaire component, wat betekent dat het gemakkelijk kan worden verwijderd via wascycli om een CSC in een ongewijzigde toestand te laten. Ten slotte identificeert de turn-on respons alleen levensvatbare cellen en functies, net als de MTT-test, vanwege de afhankelijkheid van de NAD + -cofactor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de fluorescerende inschakeling van AlDeSense. De isovormselectieve kleurstof wordt geactiveerd door ALDH1A1 en kan worden gebruikt om verhoogde ALDH1A1-activiteit in eierstokkankercellen te identificeren via fluorimetrie, moleculaire beeldvorming en flowcytometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64713/64713fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
In eerder werk heeft de isovormselectieve fluorogene sondetest met succes ALDH-hoge (ALDH +) -cellen gestratificeerd van ALDH-lage (ALDH-) cellen in K562 menselijke chronische leukemiecellen, MDA-MB-231 menselijke borstkankercellen en B16F0-muizenmelanoomcellen. Dit is belangrijk omdat, voor veel soorten kanker, een hoge ALDH1A1-eiwitexpressie een slechtere klinische prognose betekent20. Dit veronderstelt dat verhoogde niveaus van ALDH1A1 indicatief zijn voor CSC's die de behandeling kunnen ontwijken, resistentie kunnen ontwikkelen en zich door het hele lichaam kunnen verspreiden. In het geval van eierstokkanker zijn er echter studies die de tegenovergestelde bevinding melden (hoge ALDH1A1-expressie is gekoppeld aan verbeterde overleving van de patiënt)21,22,23,24. Hoewel dit op het eerste gezicht tegenstrijdig lijkt, correleert expressie niet noodzakelijkerwijs met enzymactiviteit, die kan worden beïnvloed door veranderingen in de micro-omgeving van de tumor (bijv. pH-flux, zuurstofgradiënten), beschikbaarheid van de NAD + -cofactor of aldehydesubstraten, niveaus van carbonzuren (productremming) en posttranslationele modificaties die de enzymactiviteit kunnen veranderen25 . Bovendien is eierstokkanker verdeeld in vijf belangrijke histologische typen (hooggradig sereus, laaggradig sereus, endometrioïde, heldere cel en mucineus), waarvan we veronderstellen dat ze variabele niveaus van ALDH1A1-activiteit zullen hebben26. Met het doel om ALDH1A1-activiteit in eierstoktumoren te onderzoeken, werd een isovormselectieve fluorogene sondetest gebruikt om ALDH1A1 + -populaties te identificeren in een panel van vijf eierstokkankercellijnen die behoren tot de verschillende histologische typen die hierboven zijn genoemd. De cellijnen die in deze studie zijn getest, omvatten BG-1-, Caov-3-, IGROV-1-, OVCAR-3- en PEO4-cellen, die heldere cel- en sereuze histotypen omvatten. Hierin werd de veelzijdigheid en generaliseerbaarheid van de sonde benadrukt om CSC's te identificeren voor de onderzoekers die vergelijkbare studies willen uitvoeren in andere vereeuwigde kankercellijnen en patiëntenmonsters. Het gebruik van AlDeSense zal licht werpen op de biochemische routes die betrokken zijn bij CSC-onderhoud in complexe weefselmicro-omgevingen en mogelijk dienen als een klinisch hulpmiddel voor het bepalen van de prognose en het meten van de agressiviteit van kanker.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;0,25% Trypsin, 0,1% EDTA in HBSS zonder Calcium, Magnesium en Natrium Bicarbonaat</td><td>Corning</td><td>&nbsp;&nbsp;25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x Fosfaat Buffer Saline</td><td>Corning</td><td>21-040-CMX12</td><td></td></tr><tr><td>AccuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-huis</td></tr><tr><td>BG-1</td><td></td><td></td><td>Een geschenk van het Prof. Paul Hergenrother Lab, Universiteit van Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>BioLite 25cm2 Fles</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>130189</td><td></td></tr><tr><td>Bioveiligheidskabinet 1300 serie A2</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caov-3</td><td></td><td></td><td>Een geschenk van het Prof. Erik Nelson Lab, Universiteit van Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Cel homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5180R</td><td>Eppendorf</td><td>22627040</td><td></td></tr><tr><td>Contrl-AlDeSense</td><td></td><td></td><td>Gesynthetiseerd in-huis</td></tr><tr><td>DMEM, 10% FBS, 1% P/S</td><td></td><td></td><td>Bereidt door UIUC cell media facility</td></tr><tr><td>Falcon Ronde-Bodem Polystyreen Testbuizen met Cel Strainer Snap Cap, 5mL</td><td>Corning</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>FCS Express 6</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door UIUC CMtO</td></tr><tr><td>FL microscoop</td><td>EVOS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer</td><td>Photon Technology International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Series II Water-Jak CO2&nbsp;Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>IGROV-1</td><td></td><td></td><td>Een geschenk van het Prof. Erik Nelson Lab, Universiteit van Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 42R Geïncubeerde Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Chambered #1.0 Borosicilate Dekglas Systeem</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>OVCAR-3</td><td>ATCC</td><td>HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>PEO4</td><td></td><td></td><td>Een geschenk van het Prof. Erik Nelson Lab, Universiteit van Illinois Urbana-Champaign</td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32963</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI, 10% FBS, 1% P/S</td><td></td><td></td><td>Bereidt door UIUC cell media facility</td></tr><tr><td>RPMI, 20% FBS, 1% P/S, 0,01 mg/mL Insulin</td><td></td><td></td><td>Bereidt door UIUC cell media facility</td></tr></tbody></table>

toepassing van aldesense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1a1-activiteit

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Terugval na kankerbehandeling wordt vaak toegeschreven aan de persistentie van een subpopulatie van tumorcellen die bekend staat als kankerstamcellen (CSC's), die worden gekenmerkt door hun opmerkelijke tumor-initiërende en zelfvernieuwende vermogen. Afhankelijk van de oorsprong van de tumor (bijv. Eierstokken), kan het CSC-oppervlaktebiomarkerprofiel dramatisch variëren, waardoor de identificatie van dergelijke cellen via immunohistochemische kleuring een uitdagende onderneming wordt. Integendeel, aldehydedehydrogenase 1A1 (ALDH1A1) is naar voren gekomen als een uitstekende marker om CSC's te identificeren, vanwege het geconserveerde expressieprofiel in bijna alle voorlopercellen, inclusief CSC's. De ALDH1A1-isovorm behoort tot een superfamilie van 19 enzymen die verantwoordelijk zijn voor de oxidatie van verschillende endogene en xenobiotische aldehyden tot de overeenkomstige carbonzuurproducten. Chan et al. hebben onlangs AlDeSense ontwikkeld, een isovormselectieve "turn-on" probe voor de detectie van ALDH1A1-activiteit, evenals een niet-reactief matching control reagens (Ctrl-AlDeSense) om rekening te houden met off-target kleuring. Van dit isovormselectieve hulpmiddel is al aangetoond dat het een veelzijdig chemisch hulpmiddel is door de detectie van ALDH1A1-activiteit in K562 myelogene leukemiecellen, mammospheres en van melanoom afgeleide CSC-xenografts. In dit artikel werd het nut van de sonde aangetoond door middel van aanvullende fluorimetrie, confocale microscopie en flowcytometrie-experimenten waarbij de relatieve ALDH1A1-activiteit werd bepaald in een panel van vijf eierstokkankercellijnen.

Totale ALDH1A1-activiteit van homogenaten van eierstokkankercellen De gemiddelde fold turn-ons voor elke cellijn verkregen uit deze test zijn: BG-1 (1,12 ± 0,01); IGROV-1 (1,30 ± 0,03); Caov-3 (1,72 ± 0,06); PEO4 (2,51 ± 0,29); en OVCAR-3 (10.25 ± 1.46) (figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64713/64713fig02.jpg"> Figuur 2: De vou...

Methoden om ALDH1A1-activiteit in levende cellen te meten zijn van cruciaal belang in kankeronderzoek vanwege de status als biomarker van stam. In deze studie gebruikten we een isovormselectieve fluorogene sonde om de relatieve niveaus van ALDH1A1-activiteit te bepalen in een panel van vijf eierstokkankercellijnen.

Toepassing van AlDeSense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

Ons protocol stelt gebruikers in staat om ALDH1A1-activiteit te meten, een stamcelbiomarker met behulp van verschillende modaliteiten, variërend van flowcytometrie tot moleculaire beeldvorming van levende cellen. De grote voordelen van deze aanpak zijn dat sondeactivering de turnaround-respons omvat die wordt gekenmerkt door een hoge signaal-achtergrondverhouding, evenals selectieve ALDH1A1-isovormdetectie. Michael Lee, Sarah Gardner en Rodrigo Tapia Hernandez promovendi van mijn laboratorium zullen deze procedure demonstreren.Om te beginnen, zuig de groeimedia uit de gekweekte cellen van belang in acht putkamerdia. Voeg 500 microliter per putje serumvrije media toe, aangevuld met een twee micromolaire isovormselectieve fluorogene sonde of een niet-reactieve controlesonde. Incubeer de glijbaan gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Ga na incubatie onmiddellijk over op confocale microscoopbeeldvorming. Lokaliseer de cellen met een vergroting van 10 x. Het FITC-kanaal en de uitgezonden lichtkanalen zijn vereist voor dit experiment.Lokaliseer en focus de cellen met behulp van het uitgezonden lichtkanaal om gedurende het hele experiment op hetzelfde Z-vlak scherp te stellen om vertekening te verwijderen. Pas het laservermogen en de FITC-versterking aan op de juiste instelling waarbij het signaal van de AlDeSense AM-monsters minimaal detecteerbaar is, terwijl u nog steeds signaal ziet in AlDeSense AM-monsters. Pas elke parameter aan door de bijbehorende balk te schuiven.De instellingen moeten mogelijk een paar keer worden aangepast om de juiste parameters te identificeren. Eenmaal geoptimaliseerd, voltooit u de rest van het experiment binnen die cellijn met identieke parameters. Maak drie beelden per put voor een totaal van drie putjes per behandelingsconditie en sla de beelden op.Zorg ervoor dat u alleen scherpstelt met behulp van het doorgelaten lichtkanaal tijdens het schakelen tussen vlakken en putten om vertekening te voorkomen. Vervolgens splitst u met behulp van de beeldverwerkingssoftware het CZI-bestand in verschillende kanalen en telt u het totale aantal cellen en fluorescerende cellen. Om het percentage aldehydedehydrogenase 1A1-positieve cellen te bepalen, deelt u het aantal fluorescerende cellen door het totale aantal cellen in elke afbeelding.Tel op dezelfde manier voor elke afbeelding om verstorende variabelen te voorkomen. Haal een T25-celkweekkolf eruit met daarin de cellen die in de couveuse worden bewaard. Voeg trypsine toe voor celonthechting en tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller.Pellet vervolgens de cellen in een centrifugebuis van 15 milliliter door centrifugeren bij 180G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius. Suspensie van de cellen in één milliliter van een twee micromolaire sonde of controlesondeoplossing in PBS. Rock de cellen gedurende 60 minuten op kamertemperatuur om een gelijkmatige blootstelling aan de kleurstof te garanderen.Na de incubatietijd pellet je de cellen door centrifugeren bij 180 G gedurende vijf minuten bij 25 graden Celsius. Suspensie vervolgens de cellen opnieuw in 0,5 milliliter PBS. Laat de cellen door een 35 micrometer nylon gaascelzeef op een buis op ijs lopen om celklonten te verwijderen die de flowcytometer kunnen verstoppen.Schakel het flowcytometerinstrument in en voer het opstartprotocol uit. Controleer op schedevocht en lege taille. Voer de lijnen uit met 10% bleekmiddel en water gedurende vijf minuten elk.Voer vervolgens kwaliteitscontrolekralen uit om een goede werking te garanderen. Selecteer op het tabblad Instellingen de forward scatter side scatter en FITC voor het fluorescentiefilter. Teken een voorwaarts spreidingsgebied versus een zijspreidingsgebiedsplot voor de hoofdcelpopulatie in de buurt van het midden van de grafiek.Teken vervolgens een voorwaarts spreidingsgebied, versus een voorwaartse spreidingsbreedteplot voor de smalle horizontale banden die singlets aangeven. Teken vervolgens een FITC-gebied versus een voorwaartse verstrooiingsgebiedplot om de verdeling van cellen te observeren die zijn gesorteerd door de isovormselectieve fluorogene inschakelsonde. Teken vervolgens een FITC-gebiedshistogram om de verschuiving in populatie op basis van FITC te observeren en het percentage aldehydededehydrogenase 1A1-positieve cellen te bepalen.Om het FITC-laservermogen te optimaliseren, voert u een monster uit met de sonde, zodat de rechterstaart van de histogramcurve zich in de buurt van het maximale FITC-gebiedssignaal bevindt. De optimalisatiestap van het laservermogen moet mogelijk meerdere keren worden herhaald, maar het laservermogen mag niet worden gewijzigd in monsters, zodra een instelling is aangewezen voor een experiment. Voeg vervolgens een monster toe aan de zeef en voer het uit met de controlesonde.Een populatieverschuiving moet waarneembaar zijn om het maximale dynamische bereik te onthullen. Voer elk monster uit voor 10.000 tellingen in drievoud. Nadat het monster is verzameld, voert u de lijnen uit met 10% bleekmiddel en water gedurende vijf minuten elk en sluit u het instrument vervolgens af.Verwerk de gegevens met behulp van flowcytometriesoftware en ga de gewenste celpopulatie gangen. Stel met behulp van de rechthoekige poortselectie de aldehydedehydrogenase 1A1-negatieve gang in, zodat meer dan 99,5% van de gebeurtenissen in de controlesondemonsters binnen deze poort plaatsvindt. De overige cellen worden als aldehydedehydrogenase 1A1-positief beschouwd.Breng dezelfde poorten aan op het sondemonster. Om het aantal voorvallen te kwantificeren dat als aldehydededehydrogenase wordt beschouwd, 1A1 negatief en 1A1 positief. De gemiddelde fold turn-ons voor elke cellijn werden bepaald om de totale aldehydededehydrogenase 1A1-activiteit te kwantificeren.Het percentage aldehydededehydrogenase 1A1-positieve cellen werd in elke cellijn bepaald door het laservermogen en de versterking af te stemmen. Om het signaal in het met AlDeSense AM behandelde monster te minimaliseren, werd het fluorescentiesignaal geoptimaliseerd in de met AlDeSense AM behandelde cellen. Door het aantal aldehydededehydrogenase A1A-positieve cellen te tellen, werd het percentage aldehydededehydrogenase A1A-positieve cellen bepaald.Met de toepassing van de isovormselectieve fluorogene sonde werd de aldehydedehydrogenase 1A1-positieve celpopulatie binnen elke cellijn gekwantificeerd door te gapen naar de bovenste 0,5% van de helderste cellen binnen de controle AlDeSense AM behandelde populatie. Analyse van het panel van eierstokkankercellen heeft het percentage aldehydedehydrogenase 1A1-positieve cellen onthuld. Uit de verkregen resultaten van de geteste kankercellijnen kan worden geconcludeerd dat BG-1 de laagste aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit en de laagste aldehydededehydrogenase 1A1-positieve populatie heeft.Bovendien onthulden confocale beeldvorming en flowcytometrie het grootste percentage aldehydededehydrogenase 1A1-positieve cellen in Caov-3-cellen. Maar de totale activiteit van de cellijn was slechts de op twee na hoogste. Als alternatief bevatten OVCAR-3-cellen de op twee na hoogste aldehydededehydrogenase 1A1-positieve populatie, maar vertoonden de hoogste algehele activiteit.AlDeSense is een veelzijdige en generaliseerbare sonde om CSC's in onsterfelijke cellijnen en in patiëntmonsters te identificeren. We hopen het te zien als een prognostisch hulpmiddel in de klinische setting.

application-aldesense-to-stratify-ovarian-cancer-cells-based-on

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Geëvalueerd in syngeneïsche immunocompetente gastheren, toonde het op kankerstamcel (CSC) gebaseerde dendritische cel (DC) vaccin een significant hogere antitumorimmuniteit aan dan traditionele DC-vaccins gepulseerd met heterogene bulktumorcellen.

Generatie van een nieuw dendritisch celvaccin met melanoom en plaveiselkankerstamcellen

In vitro bollen-assays worden vaak gebruikt om kanker stamcellen te identificeren. Hier vergelijken we enkele met meercellen gebaseerde bollen-assays. De meer bewerkelijk enkele cel-gebaseerde assays of methylcellulose suppletie geven nauwkeurigere resultaten terwijl meercellen gebaseerde assays uitgevoerd in vloeibaar medium sterk kunnen worden beïnvloed door celdichtheid.

Evaluatie van Stem Cell Properties in Human ovariumcarcinoomcellen Met behulp van Multi en Single-Cell gebaseerde Spheres Testen

Tumor-initiërende cellen (TIC's) kunnen een haalbaar therapeutisch doelwit zijn voor de behandeling van eierstokkanker, een zeer terugkerende en dodelijke ziekte. We presenteren een protocol voor kweekcondities die deze zeer tumorigene populatie cellen verrijken.

In vitro Verrijking van eierstokkanker tumor-initiërende cellen

Dit protocol beschrijft het genereren van door patiënten afgeleide spheroïden en downstreamanalyses, waaronder de kwantificering van proliferatie, cytotoxiciteits testen, Flowcytometrie, immunofluorescentie kleuring en confocale beeldvorming, om de geneesmiddelen te beoordelen potentiële kandidaten als anti-neoplastische Therapeutics. Dit protocol ondersteunt precisie geneeskunde met identificatie van specifieke geneesmiddelen voor elke patiënt en stadium van de ziekte.

Fysiologisch patiënt afgeleide 3D-Spheroids voor anti-neoplastische geneesmiddelen screening om kanker stamcellen te targeten

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

Dit protocol beschrijft een high-throughput workflow voor kunstmatige intelligentie-gedreven segmentatie van pathologie-bevestigde gebieden van belang van gekleurde, dunne weefselsectiebeelden voor verrijking van histologie-opgeloste celpopulaties met behulp van lasermicrodissectie. Deze strategie omvat een nieuw algoritme dat de overdracht van afbakeningen die interessante celpopulaties aangeven, rechtstreeks naar lasermicroscopen mogelijk maakt.

Geïndustrialiseerde, kunstmatige intelligentie-geleide lasermicrodissectie voor proteomische analyse op microschaal van de tumormicro-omgeving

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Dit experimentele protocol biedt een stabiele, kosteneffectieve en efficiënte methode die lncRNA-knockdown combineert met kolonievormende assays om het effect van lncRNA op de proliferatie van osteosarcoomcellen te kwantificeren.

Kolonievormingstest Detecteer de proliferatieve capaciteit van LncRNA-knockdown osteosarcoomcellen

Leer ALDH1A1-activiteit meten in eierstokkankercellen met behulp van een isoform-selectieve fluorogene probe en flowcytometrie. Deze methode biedt hoge specificiteit voor stamcelbiomarkerdetectie in levende cellen.

Toepassing van AlDeSense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit

Meer video's verkennen