Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster
26 januari 2024
Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.
Het doel van dit protocol is om een endogene bewerkte vlieglijn te genereren. We laten een fluorescerende eiwit-knock-in zien als voorbeeld, maar het kan ook worden toegepast op andere knock-in, knock-out en mutatiegeneratie. Ons protocol is een op CRISPR gebaseerde methode op basis van homologe recombinatie, dus er is bijna geen beperking op mutatieplaatsen.
Bovendien heeft ons protocol de tijd en moeite die gemoeid zijn met genotyperingsstappen aanzienlijk verminderd. Open om te beginnen de CRISPR-website om sgRNA's voor Drosophila te ontwerpen en voer ongeveer 100 basenpaarsequenties in rond de gewenste knock-in-locatie. Selecteer CRISPR-doelen met de vijf belangrijkste guanine-opties.
Klik op de knop CRISPR-doelen zoeken om een lijst met mogelijke sgRNA-sequenties te genereren. Klik vervolgens op de knop evalueren voor elke sequentie en kies twee sgRNA's die nul off-targets hebben. Aangezien de natuurlijke eiwitexpressieniveaus doorgaans veel lager zijn, selecteert u fluorescerende tags die helder en fotostabiel zijn en passen bij de experimentele opstelling.
Ontwerp vervolgens een linker om epitooptags te koppelen aan de fluorescerende marker voor biochemische analyse. Gebruik een linkerpeptide variërend van twee tot 20 aminozuren, bestaande uit aminozuren zoals glycine en serine. Om de donorvector voor Drosophila te ontwerpen, organiseert u de DNA-sequentie van het linkerpeptide en de fluorescerende tag en zorgt u voor homologe sequenties die beide uiteinden flankeren.
Wijzig eventuele PAM-sequenties in het donorplasmide om de resulterende aminozuursequentie van eiwitten te behouden. Plaats vervolgens de start- en stopcodons, afhankelijk van de locatie van de tag. Zorg er voor interne tagging voor dat de fluorescerende tag in beeld is met de coderende sequentie van het doelgen.
Voor N-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag na het endogene startcodon. Voor C-terminus-tagging plaatst u de fluorescerende tag vóór het natuurlijke stopcodon. Zorg ervoor dat u slechts één startcodon behoudt om mogelijke vertaalproblemen te voorkomen.
Gebruik de alternatieve, op restrictie-enzymen gebaseerde kloonbenadering om de sgRNA-sequentie in het plasmide U6 Bbs1-chiRNA-plasmide in te voegen. Na het maken van het sgRNA-plasmide, transformeert u het plasmide in DH5-Alpha Escherichia coli volgens de instructies van de fabrikant. Controleer de resulterende klonen door middel van Sanger-sequencing, met behulp van T3- of T7-standaardsequencingprimers.
Om het donorplasmide te maken, gebruikt u dubbelstrengs DNA met de gewenste sequentie en integreert u het in de plasmide Bluesript 2SK-negatieve meervoudige kloonplaats. Sequentie van het donorplasmide om ervoor te zorgen dat sgRNA- of PAM-sequenties correct worden gewijzigd en dat er geen SNP's in het plasmide aanwezig zijn. Neem vervolgens Cas9-vliegen geïnjecteerd met het geconstrueerde gRNA en donorplasmiden.
Verdoof de vliegen met kooldioxide en scheid mannelijke vliegen en maagdelijke vrouwtjes. Om vliegenkruisingen tot stand te brengen, koppelt u elk G zero-mannetje aan ten minste twee FM7L-maagdelijke vrouwtjes in individuele smalle CT-voedselflesjes. Plaats gekruiste injectieflacons in een geventileerde incubator die op 25 graden Celsius en 60% luchtvochtigheid wordt gehouden totdat de F1-vliegen sluiten.
Verdoof en verzamel vervolgens ten minste 10 maagdelijke vrouwelijke nakomelingen van zowel mannelijke als vrouwelijke kruisingen van G zero. Zorg ervoor dat elke F1-vlieg is getagd met de details van zijn afkomst en apart wordt opgeslagen. Om vliegen op PCR te screenen, ontwerpt u primers met een smelttemperatuur van ongeveer 55 graden Celsius die de bewerkingsplaats van het doelgen omvatten.
Bereid lysisbuffer voor elk vliegmonster en doseer 10 microliter in elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes. Houd de buffer op een koude temperatuur tijdens het beendissectieproces. Bereid vervolgens glazen capillaire buizen voor en vul het ene uiteinde met sucrose-agarvoedsel.
Plaats deze buizen in een plaat met 96 putjes en diepe putten, ook wel het vlieghotel genoemd. Voor beendissectie plaatst u het kooldioxide-verdovingskussen onder een stereomicroscoop. Verdoof een kandidaat-vlieg en snijd een van zijn middenpoten door.
Dompel daarna het been onder in de lysisbuffer. Houd de vliegenvleugel vast met een fijne metalen pincet. Verplaats de vlieg naar het vliegenhotel en sluit de buis onmiddellijk af met garen.
Huisvest het vliegenhotel in een geventileerde incubator die wordt gehandhaafd op 25 graden Celsius en een luchtvochtigheid van 60%. Dompel de afgehakte benen onder in de lysisbufferoplossing in een thermische cycler. Organiseer de PCR-reactie volgens de instructies van de fabrikant, met 1,5 microliter van het vliegpootlysaat als DNA-bron.
Onderwerp de PCR-producten aan agarosegelelektroforese en interpreteer de resultaten op basis van de bandgrootte. Selecteer op basis van de gelresultaten de positieve vliegen uit het vlieghotel en kruis ze individueel met balancervliegen om de F2-generatie te produceren. Gebruik homozygote aandelen voor Sanger-sequencing van de bewerkingssite om nauwkeurigheid te garanderen.
Back-cross gevalideerde vlieglijnen met wildtype vliegen om achtergrondmutaties te verwijderen. Screen elke generatie met behulp van het PCR-protocol met één been. Confocale microscoopbeelden van volwassen Drosophila-hersenen toonden periode-eiwit georganiseerd in discrete nucleaire brandpunten gedurende de late nacht en vroege ochtend.
Over het algemeen is dit protocol robuust als uw genotypering PCR-primers specifiek zijn.
Overzicht
Deze studie presenteert een vereenvoudigd protocol voor het taggen van endogene genen bij Drosophila, waarbij gebruik wordt gemaakt van een PCR-gebaseerde techniek voor de marker-vrije identificatie van succesvolle genetische modificaties. De aanpak vergemakkelijkt de ontwikkeling van stabiele knock-in lijnen, aangetoond aan de hand van een voorbeeld met een fluorescent eiwit, en kan worden aangepast voor aanvullende genetische modificaties.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Genetica
- Drosophila-onderzoek
Achtergrond
- Genbewerkings technologieën zoals CRISPR hebben genetische modificaties in modelorganismen versneld.
- Endogene tagging maakt het mogelijk om eiwitgedrag en interacties te observeren.
- Efficiënte genotyperingsmethoden zijn essentieel voor het bevestigen van succesvolle modificaties.
Doel van de studie
- Om het proces voor het creëren en bevestigen van genetisch gemodificeerde Drosophila-lijnen te stroomlijnen.
- Om een protocol te bieden dat de tijd die nodig is voor genotyperingsprocedures minimaliseert.
- Om de toepasbaarheid van CRISPR-homologe recombinatietechnieken uit te breiden.
Gebruikte methoden
- CRISPR-homologe recombinatie in Drosophila is toegepast voor genbewerking.
- De belangrijkste interventies omvatten het ontwerpen van sgRNA's en het construeren van donorplasmiden.
- PCR-screening van gemodificeerde lijnen is uitgevoerd om de succesvolle bewerkingen te valideren.
- Cruciale stappen omvatten de dissectie van poten voor monstername en PCR-amplificatie met specifieke primers.
Belangrijkste resultaten
- De studie heeft succesvol een efficiënte methode aangetoond voor het genereren van fluorescente proteïne-knock-ins in Drosophila.
- Er werd een vermindering in de tijd voor genotypering en een verhoogde nauwkeurigheid bij het bevestigen van genetische modificaties benadrukt.
- De resulterende vliegenlijnen vertoonden de gewenste proteïnelokalisatiepatronen die noodzakelijk zijn voor verdere biologische studies.
Conclusies
- Dit protocol vereenvoudigt de generatie en validatie van genetisch gemodificeerde Drosophila-lijnen aanzienlijk.
- Het vergroot het vermogen van onderzoekers om Drosophila-modellen in te zetten voor diverse genetische studies.
- De efficiëntie en flexibiliteit van de methode kunnen het inzicht in proteïnefuncties en geninteracties in vivo bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Efficiënte tagging van endogene genen in Drosophila melanogaster versnelt de validatie van proteïnefunctie en -lokalisatie, wat vroege ontdekkingen en mechanistische risicoreductie in biopharma R&D ondersteunt. Het CRISPR-gebaseerde protocol in één stap met PCR-gebaseerde screening elimineert de afhankelijkheid van zichtbare markers, waardoor de generatie van stabiele, genetisch gemodificeerde lijnen wordt gestroomlijnd. Deze aanpak verhoogt het voorspellende vertrouwen en de portfoliotriage door een snelle, marker-vrije bevestiging van genetische modificaties in ziekte-relevante modelsystemen mogelijk te maken.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van eiwitlokalisatie en functie in vivo mogelijk voor doelwitvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door nauwkeurige, endogene tagging zonder exogene markers mogelijk te maken.
- Faciliteert de snelle generatie van genetisch gedefinieerde lijnen voor hypothesegestuurde studies.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gevalideerde, marker-vrije biologische systemen voor downstream fenotypische screening.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door middel van PCR-gebaseerde genotypering.
- Maakt schaalbare productie van gemanipuleerde lijnen mogelijk voor robuuste evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij de ontwikkeling van ziekterelevante modellen door in vivo studies naar proteïnedynamica te ondersteunen.
- Waarborgt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via stabiele, genetisch gekarakteriseerde stammen.
- Vermindert biologische ambiguïteit in translationeel onderzoek door precieze genetische modificaties te bevestigen.
Pipeline- & Workflowintegratie
Dit CRISPR-taggingprotocol in één stap integreert in het continuüm van vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor een basis wordt gelegd voor downstream screening en preklinische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door real-time visualisatie van eiwitgedrag mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, marker-vrije lijnen die geschikt zijn voor kwantitatieve fenotypische assays.
- Analytiek: Maakt gebruik van PCR-gebaseerde genotypering en Sanger-sequencing voor een robuuste bevestiging van genetische modificaties.
- Translationeel onderzoek: Vergemakkelijkt de afstemming met ziektemodellen door in vivo eiwittracking mogelijk te maken.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbare workflow voor diverse toepassingen van genbewerking en tagging in Drosophila.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt genotypering, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt de schaalbare generatie van lijnen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie door modelvalidatie te versnellen.
- Impact op de portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van genetisch gemodificeerde modellen mogelijk.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in CRISPR-ontwerp, plasmidconstructie en Drosophila-genetica.
- Vereist toegang tot infrastructuur voor PCR, Sanger-sequencing en confocale microscopie.
- Vereist standaardisatie van genotyperings- en screeningsprotocollen tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse gentargets en taggingstrategieën binnen Drosophila-modellen.
- Afhankelijk van de specificiteit van het sgRNA-ontwerp en de selectie van PCR-primers voor robuuste resultaten.
