Een menselijk beenmerg 3D-model om de dynamiek en interacties tussen residente cellen in fysiologische of tumorale contexten te onderzoeken

Deze techniek maakt de ontwikkeling mogelijk van een gestandaardiseerd systeem dat gemakkelijk op te zetten is vanuit menselijke cellijnen of primaire celpopulaties en kenmerken biedt van een goed georganiseerde, beenmergachtige structuur. Dit model maakt het mogelijk om celoogst na fixatie in situ cellokalisatie binnen het systeem te karakteriseren via beeldvorming, of 3D-structuurdissociatie om elke cellulaire component te verzamelen voor moleculaire of functionele studies. Kevin Geistlich, een assistent-ingenieur uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure.

Weeg 35 tot 40 milligram BCP-kralen in een buis van 1,5 milliliter voor elke insert. Dat wil zeggen, een kleine cilindrische plastic schaal met een polycarbonaatmembraan aan de onderkant. Boor een klein gaatje met een schone naald door de bovenkant van de buis van 1,5 milliliter om te voorkomen dat het deksel openspringt tijdens de autoclaafcyclus en plaats de buizen in een verticale positie in een gesloten, steriele doos.

Plaats steriele polycarbonaat celkweekinzetstukken in de putten van een plaat met zes putten. Giet steriele BCP-kralen uit een buis van 1,5 milliliter in de insert. Was de kralen zorgvuldig door 350 microliter 1X PBS in de insert te druppelen en voeg vervolgens 4,5 milliliter 1X PBS toe aan de put.

Gooi de PBS weg met behulp van een vacuüm of een pipet van vijf milliliter door de punt in een hoek van de put te plaatsen. Herhaal de wasstap twee keer. Gebruik vervolgens 1X PBS aangevuld met 10% FBS om het systeem te blokkeren.

Voeg voorzichtig 350 microliter van de blokkerende oplossing toe aan de insert en 4,5 milliliter aan de put en plaats de hele plaat een nacht in een incubator. Verwijder de blokkeringsoplossing uit het systeem. Meng 1 keer 10 met de 6 HMEC-1-cellen en 2 keer 10 met de 6 HS27A-cellen, die respectievelijk de vasculaire en mesenchymale stromale celcompartimenten vertegenwoordigen, in een buis van 15 milliliter en centrifuge gedurende vijf minuten bij 1.575 G bij kamertemperatuur.

Gooi het supernatant weg en voeg 175 microliter HMEC-1-medium toe, aangevuld met 175 microliter ODM die mesenchymale stromale celdifferentiatie in osteoblasten zal bevorderen. Giet 350 microliter van de celsuspensie met 3 maal 10 op de 6 totale cellen in elke insert. Giet vervolgens 4,5 milliliter van de gecombineerde media zonder cellen in de putten van de plaat.

Zuig het mengsel voorzichtig meerdere keren op en doseer het met een micropipette van één milliliter om de cellen en BCP-kralen in het inzetstuk te homogeniseren. Laat het hele mengsel op de bodem van de insert bezinken. Zodra de endotheel- en mesenchymale cellen in de insert zijn gehomogeniseerd, houdt u de zesputtenplaat gedurende drie weken in de incubator.

Verander het medium in de insert twee keer per week in de put door het medium voorzichtig te verwijderen met behulp van een micropipette van één milliliter en de punt bij de binnenste insertwand te plaatsen om te voorkomen dat de hoek van de insert wordt verstoord. Resuspensie van de hematologische cellen van belang in het HMEC-1 en RPMI combinatiemedium en voeg de celsuspensie toe aan de insert. Andere celtypen met speciale media kunnen bij deze stap worden toegevoegd.

Als een medicijnbehandelingsprotocol vereist is, wacht dan 24 uur na het toevoegen van de cellen van belang voordat u ze behandelt, zodat ze de tijd hebben om zich aan de botachtige structuur te hechten. Ververs het medium met 50%HMEC-1 compleet medium en 50%RPMI compleet medium twee keer per week. Nadat u het kweekmedium twee keer per week hebt vervangen, bewaart u het opgehaalde supernatant aan de binnenkant van de insert bij min 80 graden Celsius om de eiwitproductie in het systeem te evalueren.

Om de cellen van de 3D-structuur te scheiden, mengt u 4,5 milliliter RPMI met 0,5 milliliter FBS, aangevuld met 0,4 milligram per milliliter collagenase in een buis van 15 milliliter. Verwarm vervolgens de oplossing op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Plaats de insert ondersteboven op een steriele plaatafdekking met zes putten om het membraan goed uit te snijden.

Gebruik een steriel scalpel om het membraan vanaf de zijkanten te snijden en zo een witte vaste schijf op te halen. Plaats de schijf in de warme buis van 15 milliliter met het eerder bereide oplossingsmengsel. Plaats de buis in een actief wiel in een incubator van 37 graden Celsius en incubeer gedurende 10 minuten om de spijsvertering mogelijk te maken.

Pas dezelfde incubatietijd toe voor alle membranen om een scheve analyse te voorkomen. Na de incubatie centrifugeert u de buis van 15 milliliter gedurende vijf minuten bij 1.575 G bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in vijf milliliter warme 1X PBS.

Resuspendeer de pellet in 300 microliter warme trypsine en meng goed door gedurende 10 seconden te pipetteren en plaats het gedurende één minuut in een waterbad op 37 graden Celsius. Stop de enzymatische spijsvertering door een milliliter warme, zuivere FBS toe te voegen. Met een micropipette van één milliliter kunt u het medium mechanisch aanzuigen en doseren om de schijf volledig te dissociëren.

Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 1.575 G en resuspeneer de pellet in drie milliliter 1X PBS aangevuld met 10%FBS. Laat de kralen vijf seconden aan sediment voordat u het supernatant verzamelt en filtert door een 35 micron celzeef die op een verzamelbuis is geplaatst. Centrifugeer het opgehaalde filtraat gedurende vijf minuten bij 1.575 G en tel de cellen met trypanblauw om de levensvatbaarheid te evalueren.

Resuspenseer de pellets in het antilichaammengsel en incubeer gedurende 30 tot 40 minuten op ijs uit de buurt van licht. Voeg een milliliter PBS aangevuld met 2% FBS toe om de cellen te wassen en centrifugeer gedurende vijf minuten op 1.575 G.To start de flowcytometrie-analyse, resuspendeer de opgehaalde pellet in 200 microliter 1X PBS met 10% FBS, aangevuld met DAPI in een oplossing van 1 tot 2000. Analyseer de buizen in een cytometer met behulp van de parameters die in het tekstmanuscript worden beschreven.

Gebruik een FSC-H versus FSC-W grafiek om de singletpopulatie te beschermen. Gebruik in de singletfractie een DAPI-A versus FSC-A grafiek om de levensvatbare celpopulatie te bepalen. Met de DAPI-negatieve populatie eerder omheind, gebruik een APCA-A versus FSC-A grafiek plot om de CD45-positieve populatie te bepalen.

Om de BM-achtige structuur te bevestigen, brengt u de insert over van de oude plaat naar een nieuwe zesputtenplaat gevuld met 1X PBS. Vervang vervolgens voorzichtig het medium in de insert door 1X PBS. Zodra de insert is gewassen, plaatst u deze in een nieuwe zes-wellenplaat en vult u zowel de put als de insert met vers geopend paraformaldehyde.

Laat het fixatieproces vier uur doorgaan bij kamertemperatuur, uit de buurt van licht. Was vervolgens het inzetstuk eenmaal met 1X PBS en bewaar het op vier graden Celsius uit de buurt van licht. Na de gewenste blootstelling suggereerden de resultaten dat het mogelijk was om hematologische cellen gedurende ten minste zes weken binnen het 3D-model te behouden voordat levensvatbare cellen werden opgehaald.

Het was mogelijk om de HS27A-cellijn te vervangen door primair normaal beenmerg MSC of acute myeloïde leukemie MSC in dit 3D BM-achtige model, of de hematopoëtische cellijn te vervangen door primaire HSC's. Paraffine-inbedding en immunochemie maakten met succes de analyse van CD45- en CD73-inhoud mogelijk met behulp van de 3D-modellen. Dit 3D-systeem vereist drie weken beenmergachtige structuren en extra tijd met interessante cellen.

En steriele omstandigheden moeten worden gehandhaafd, omdat we soms gemiddelde besmettingen kunnen zien met de tweewekelijkse mediumveranderingen.