High-Throughput Eiwitkristallisatie via microdialyse

Kristallisatie door dialyse is een onderbenutte methode. Dit protocol presenteert een Novo-benadering hiervan, die het scala aan kristallisatiestrategieën dat momenteel beschikbaar is voor gestructureerde bepaling zal vergroten. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het een hoge doorvoer heeft, eenvoudig is in te stellen zonder dat er specialistische apparatuur nodig is en dat het een eenvoudige bewaking van de kristalgroei mogelijk maakt.

De persoon die deze techniek uitvoert, moet vertrouwd zijn met pipetteren met een laag volume en het gebruik van meerkanaals pipetten. De druppels moeten zo voldoende mogelijk worden gepipetteerd om gedeeltelijke uitdroging te voorkomen. Om het microdialyse-experiment op te zetten, plaatst u een in de handel verkrijgbare 96-well microdialyseplaat in de oriëntatie van de eiwitzijde naar boven en verwijdert u de zelfklevende afdektape door de 200-micron drukklevende afstandhouder af te pellen.

Nadat u de zelfklevende afdekband hebt afgepeld, noteert u de positie van put A1. Laad vervolgens met behulp van een meerkanaalspipet maximaal 3,2 microliter goed voorbereid eiwitmonster in elke put. Plaats de UV-afdekfolie van 200 micron op de juiste manier over de 96-putsplaat met de film naar boven gericht. Om vervolgens de druklijm te activeren en af te dichten, drukt u met een afdichtingspeddel op de UV-afdekfolie en controleert u de integriteit ervan.

Keer nu de plaat om om deze naar de bufferzijde naar boven te brengen en let op de gespiegelde positie van de gemarkeerde put A1. Laad met behulp van een meerkanaals pipet maximaal 350 microliter van de dialyseoplossing in elke put van de plaat en sluit de putten zorgvuldig af met de reservoirafdekfolie. Plaats de plaat vervolgens in de bufferzijde naar boven in een geschikte temperatuurgeregelde incubator bij 20 graden Celsius om kristalgroei mogelijk te maken. Om de kristalvorming onder de microscoop te onderzoeken, verwijdert u de beschermende afdekfolie van de 200 micron UV-afdekfolie en plaatst u de plaat onder het oculair met de eiwitzijde naar boven gericht.

Om een grootschalig kristallisatie-experiment op te zetten, neemt u de omstandigheden aan waarin microkristalgroei plaatsvond in de microdialyseplaat en repliceert u dezelfde omstandigheden in grote containers. Selecteer de grootte van de container afhankelijk van het volume van de dialyseoplossing. Pipetteer een maximaal volume van 500 microliter eiwitmonster in de dialysatorbuis voordat u de buis afsluit met de rode plastic dop.

Plaats de verzegelde dialyseerbuis van 500 microliter in het drijvende rek in de container gevuld met dialyseoplossing. Plaats vervolgens de container ongestoord in een geschikte temperatuurgeregelde incubator op 20 graden Celsius om kristalgroei te bereiken. Om te controleren op de vorming van kristallen, pipet u één tot twee microliter van de oplossing van de dialysator op een glazen afdekplaat.

Bedek de oplossing op de dia met een andere glazen dia en bekijk deze onder een microscoop. Beelden gemaakt met een stereo hoge vergrotingsmicroscoop toonden succesvolle microkristalvorming van vier eiwitten met behulp van de microdialyseplaten met 10-kilodalton moleculaire gewicht afsnijmembranen. Lysozym bleek kristallen te vormen wanneer het werd gedialyseerd tegen 0,1 molair natriumacetaat bij pH 4 met de juiste additieven.

Domatine vormde kristallen bij dialyse tegen 0,1 molair bis-tris propaan bij pH 6,6 met de juiste additieven. Geoptimaliseerde dialysecondities leidden tot microkristalvorming door de membraaneiwitten, namelijk het E.coli multidrug effluxpompeiwit AcrB en de E.coli lactosetransporter LacY. Grootschalige kristallisatie in de dialysatorbuizen met behulp van de geoptimaliseerde dialysecondities verkregen uit de microdialyse-experimenten leidde tot de vorming van duizenden microkristallen voor elk van de eiwitten.

Voor kristallisatie van fomitine werd 250 microliter eiwit gedialyseerd tegen 50 milliliter van de dialyseoplossing. Voor AcrB werd 250 microliter van het eiwit gedialyseerd tegen 25 microliter dialyseoplossing. De LacY-kristallisatie werd ook in dezelfde verhouding opgezet, met 100 microliter eiwit tot 10 milliliter dialyseoplossing.

Bij het omkeren van de plaat naar de bufferzijde naar boven, is het belangrijk om de positie van A1 te noteren, zodat oplossingen van het kristallisatiescherm dienovereenkomstig kunnen worden afgegeven. De kristallen die met deze methode worden verkregen, kunnen worden gebruikt voor downstream-toepassingen, zoals seriële kristallografie en micro-ED.