Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Dit protocol stelt onderzoekers in staat om te identificeren of caspase-activiteit optreedt in combinatie met celdood, waardoor verschillende manieren van celdood worden geïdentificeerd. Het voordeel van deze techniek is de flexibiliteit om caspase-activiteit te beoordelen bij een populatiegebaseerde test of een enkele cel. Stefanie Rufli, een phd-afgestudeerde, en Jing Tong, een bezoekende promovendus uit het laboratorium van Wendy Wei-Lynn Wong, demonstreren de procedure.

Na het differentiëren en oogsten van de van het beenmerg afgeleide macrofagen of BMDM's zoals beschreven in het manuscript, zaait u ze in een plaat met zes putten met een dichtheid van één keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Behandel de cellen met SMAC mimetisch gedurende 16 uur. Om het cellysaat te bereiden, brengt u de plaat met behandelde cellen over op het ijs en verzamelt u het celkweekmedium in een buis van 1,5 milliliter.

Centrifugeer bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Adem het medium aan en zet de buis op ijs. Voeg vervolgens een milliliter koude PBS toe aan de celkweekplaat om de cellen te wassen.

Voeg na het aanzuigen van alle PBS 100 microliter trypsine toe aan de cellen. Zodra de cellen van de plaat zijn losgemaakt, verzamelt u ze in de buis van 1,5 milliliter. Nadat u de celsuspensie hebt gecentrifugeerd, verwijdert u het supernatant en resuspeneert u de pellet in 100 microliter DISC-lysisbuffer.

Incubeer het monster gedurende 20 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens het lysaat om de onoplosbare fractie te pelleteren. Breng 25 microliter lysaat over op een witte 96-wellsplaat met platte bodem voor de caspase-3/7-activiteitstest en 10 microliter op een transparante 96-wellsplaat met platte bodem voor de bicinchonininezuur- of BCA-test. Bereid voor eiwitkwantificering een reeks runderserumalbumine- of BSA-concentraties als standaardeiwit.

Zodra standaard BSA is toegevoegd aan de platbodemplaat met 96 putten die de monsters bevat, mengt u de BCA-reagentia één en twee in een verhouding van 50 op één en voegt u standaard 200 microliter ervan toe aan elk monster. Na 30 minuten incuberen bij 37 graden Celsius, meet je de absorptie op 562 nanometer op een fluorometrisch instrument en kwantificeer je de eiwitconcentratie met de standaardcurve. Om een populatie-gebaseerde test uit te voeren, start u het fluorometrische instrument en verwarmt u de machine tot 30 graden Celsius.

Stel de excitatie- en emissiegolflengte in op respectievelijk 360 en 465 nanometer. Bereid vervolgens een masterreactiemix op ijs zoals beschreven in het manuscript om de caspase-activiteit te bepalen. Voeg 75 microliter van het mengsel toe aan elk monster en standaard om een totaal reactievolume van 100 microliter te verkrijgen.

Meet onmiddellijk de fluorescentie met behulp van de fluorometrische instrumentopstelling en registreer elke minuut individuele metingen gedurende 40 minuten om de reactiekinetiek te bepalen. Na het zaaien, oogst de hechtende cellen zoals eerder aangetoond in een vijf milliliter polystyreen buis. Centrifugeer het monster vervolgens bij 300 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en verwijder het supernatant.

Om het kleuringsmengsel te bereiden, neemt u één microliter van het fluorogene substraat en verdunt u deze met 150 microliter PBS. Voeg 50 microliter kleuringsmix per monster toe, incubeer het in het donker bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten en meng elke 15 minuten. In deze populatiegebaseerde test toonden de representatieve gegevens van de kinetische assay voor caspase-3/7-activiteit een verhoogde substraatsplitsing met verhoogde SMAC mimetische concentratie.

De toename bij een nanomolaire concentratie van 500 was echter onbeduidend op basis van een gewone eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen. Analyse van caspase-3/7-activiteit met behulp van flowcytometrie wees op een verschuiving in fluorescentie voor de cellen behandeld met SMAC-mimetica in vergelijking met de onbehandelde cellen, wat ook duidelijk was in de uitgezette mediane fluorescentie-intensiteit en de toename bij 500 nanomolaire concentratie was significant. De procedure moet op ijs worden uitgevoerd.

In populatiegebaseerde testen kunnen monsters echter niet voor onbepaalde tijd op ijs worden achtergelaten. Na de lysisstap moeten monsters onmiddellijk verder worden verwerkt of ingevroren. Het in beeld brengen van de caspase-activiteit met behulp van levende celmicroscopie zou een aanvullende methode zijn om kinetische informatie op een enkelcellig niveau te verkrijgen.