Name: In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Leer een in vitro migratieassay om neurale topcelmigratie te bestuderen in een hyaluronzuurrijke extracellulaire matrix. Deze methode maakt evaluatie van celadhesie en HA-afbraak mogelijk voor onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ik spreek grote dank uit aan Fumitoshi Irie en Yu Yamaguchi voor hun aanmoediging en vriendelijke suggesties bij het vaststellen van deze methode. Dit werk werd ondersteund door subsidies-in-steun voor wetenschappelijke onderzoeksprogramma's van de Japan Society for the Promotion of Science (#19KK0232 tot T.I., #20H03896 tot T.I.). De oorspronkelijke methode voor het coaten van HA op glassubstraten en in situ HA-afbraaktests op de substraten werd beschreven in Yamamoto et al. (2017)8, terwijl de methode voor de bereiding van HA/Col1 gemengde substraten werd beschreven in Irie et al. (2021)7.

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Osaka University Graduate School of Dentistry.
1. Cultuur van hersenneurale topcellen van muizen
OPMERKING: De neurale topcellijn die in deze studie wordt gebruikt, bestaat uit O9-1-cellen, oorspronkelijk afgeleid van Wnt1-Cre; R26R-GFP-tot expressie brengende cellen geïsoleerd uit E8.5 muizenembryo's12 (zie discussie). De hier beschreven methode voor het kweken van O9-1-cellen volgt een eerder vastgesteld protocol13.
<ol><li>Bereid de keldermembraan matrix-gecoate plaat voor.<ol><li>Ontdooi de keldermembraanmatrix (zie Materiaaltabel) op ijs. Verdun de matrix 1:50 in gekoelde 1x PBS en houd op ijs.</li>
		<li>Bedek een kweekplaat van 10 cm met 10 ml van de verdunde keldermembraanmatrixoplossing. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en zuig de matrix voor gebruik op.</li>
		<li>Was de plaat 3x met 2 ml PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Kweek O9-1 cellen op de kelder membraan matrix-gecoate plaat.<ol><li>Verwarm het volledige embryonale stamcelmedium (ES) (zie materiaaltabel) in een waterbad bij 37 °C.</li>
		<li>Meng voorzichtig de O9-1 celsuspensie (zie Tabel met materialen) en tel het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller (zie Tabel met materialen). Stel de celconcentratie in op 1,1 × 106/ml met volledig ES-celmedium.</li>
		<li>Voeg 8 ml voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de matrixgecoate kweekplaat van 10 cm en zaai de O9-1-cellen op 1,1 x 106 cellen / plaat. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.</li>
		<li>Vervang het medium de volgende dag door vers compleet ES-celmedium (voorverwarmd tot 37 °C). Vervang daarna elke 2-3 dagen door vers medium. OPMERKING: Wanneer de cellen ongeveer 80% confluent zijn (3-4 dagen na plating), kunnen ze worden gedissocieerd met 0,25% trypsine-EDTA en verder worden gepasseerd of ingevroren voor later gebruik. Representatieve beelden van O9-1-cellen zijn weergegeven in figuur 1.</li>
		<li>Was de kweekplaat met 2 ml 1x PBS voorafgaand aan trypsinisatie. Voeg 2 ml voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Controleer op volledige celloslating; Tik indien nodig een paar keer zachtjes op de zijkant van de plaat.</li>
		<li>Voeg 2 ml voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de kweekplaat en breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis op 300 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren. Voeg vervolgens 2 ml voorverwarmd volledig ES-celmedium toe aan de buis en resuspendeer de cellen grondig door pipetteren. Zaai de cellen op een nieuwe kweekplaat met de gewenste celdichtheid.</li>
		<li>U kunt ook een bevroren celvoorraad bereiden door 1 ml celvriesmedium met 10% dimethylsulfoxide (DMSO) aan de buis toe te voegen in plaats van volledig ES-celmedium en de cellen grondig te resuspenderen. Breng de celsuspensie over naar cryobuizen en bewaar bij −80 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bereiding van de HA/Col1-gecoate schaal
OPMERKING: De oorspronkelijke methode voor het coaten van HA/Col1 op schotels met glazen bodem werd voorgesteld door Irie et al.7.
<ol><li>Voeg voorzichtig 50 μL onverdund triethoxysilaan toe aan een schaal met glazen bodem van 3,5 cm (zie materiaaltabel). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en bescherm tegen licht. OPMERKING: De incubatie met triethoxysilaan mag niet langer zijn dan 5 min. Dit kan de coatingefficiëntie beïnvloeden en ongewenste producten produceren.</li>
	<li>Was de schaal snel 3x met 2 ml gedestilleerd water. Voeg 50 μL 0,25% glutaaraldehyde toe, 100x verdund in PBS, per gerecht, en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.</li>
	<li>Snel 4x wassen met 2 ml PBS. Bedek vervolgens de gerechten met 300 μL collageen type I in 0,2 N azijnzuur bij RT gedurende 1 uur.</li>
	<li>Snel 3x wassen met 2 ml PBS. Voeg 300 μL 200 μg/ml fluoresceinamine-gelabeld natriumhyaluronaat-H2 (FAHA-H2) (verdund in PBS) toe aan elk gerecht en incubeer een nacht bij RT. Was opnieuw 3x met 2 ml PBS. Na het aanzuigen van de PBS, droogt u de plaat gedurende 5 minuten aan de lucht op een schone bank. OPMERKING: FAHA-H2 is een fluoresceinamine-gelabeld natriumhyaluronaat met een gemiddeld molecuulgewicht variërend van 1.200-1.600 KDa. HA met een geschikt molecuulgewicht kan worden gebruikt volgens de onderzoeksopzet.</li>
</ol>3. Migratietest op de met HA/Col1 gecoate schaal
OPMERKING: Een op wondsluiting gebaseerde test met behulp van gedefinieerde celvrije openingen van 500 μm in Col1/HA-substraten werd uitgevoerd met behulp van 2-well kweekinzetstukken (zie materiaaltabel). De O9-1-cellen drukken Tmem2 uit, dat nodig is voor de adhesie en afbraak van HA in de extracellulaire ruimte9 (figuur 2 en figuur 3).
<ol><li>Na het drogen van de gecoate schaal met glazen bodem, bevestigt u de 2-well cultuurinzetstukken aan de gerechten en vult u de inzetstukken extern met 1 ml PBS.</li>
	<li>Zaai de O9-1 cellen in de putjes op 1 x 104 cellen in 100 μL van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) met 2% foetaal runderserum (FBS) per insert. Kweek de cellen gedurende 2 dagen bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde incubator.</li>
	<li>Verwijder de inzetstukken voorzichtig van de gecoate glazen bodemschalen met een pincet. Was de gecoate glazen bodemschalen voorzichtig met 2 ml 1x PBS om de cellen en celresten te verwijderen. Voeg 2 ml verse DMEM met 2% FBS toe aan de kweekgerechten.</li>
	<li>Leg fasecontrastbeelden nu vast als begintijdpunt met behulp van een alles-in-één fluorescentiemicroscoop in monochrome modus met instellingen met hoge resolutie (versterking bij 6 dB, geen binning). Objectieve lenzen met vergrotingen van 4x tot 20x werden gebruikt voor beeldvorming in deze studie (zie Tabel van materialen). OPMERKING: Leg de fasecontrastafbeeldingen vast met de bijbehorende schaalbalken en sla ze op in TIFF-indeling.</li>
	<li>Kweek de cellen nog eens 48 uur bij 37 °C en 5% CO2. Leg fasecontrastbeelden vast op 24 uur en 48 uur in cultuur met behulp van de alles-in-één fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Fixeer de cellen op 48 uur met 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was vervolgens de vaat 3x gedurende 5 minuten elk met 1 ml verse PBS.</li>
	<li>Plaats een afdekplaat met montagemedium (zie materiaaltabel) voor verdere morfologische observatie. OPMERKING: De gerechten kunnen onmiddellijk worden afgebeeld of maximaal 2 maanden bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Optioneel: Immunolabel de cellen voor eiwitten van belang. OPMERKING: Een protocol om het focale adhesie (FA) complex te detecteren met behulp van een muis-afgeleid monoklonaal anti-vinculine antilichaam (zie tabel van materialen) wordt hier beschreven als een voorbeeld.<ol><li>Incubeer de gerechten (vanaf stap 3.6) met 0,5 ml blokkeringsbuffer (5% normaal geitenserum in PBS) gedurende 60 minuten. OPMERKING: Kies een geschikte blokkeringsbuffer voor het primaire antilichaam. Een typische blokkeringsbuffer zou 5% normaal serum zijn van dezelfde soort als het gebruikte secundaire antilichaam.</li>
		<li>Bereid het verdunde primaire antilichaam in antilichaamverdunningsbuffer (1% normaal geitenserum in PBS). Incubeer de gerechten met 0,5 ml verdund primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C. OPMERKING: Kies de juiste antilichaamverdunningsbuffer. Meestal wordt het antilichaam gebruikt bij een verdunning van 1:50-1:200.</li>
		<li>Spoel 3x gedurende 5 minuten elk met 2 ml PBS. Bereid het verdunde van geiten afgeleide antimuis secundaire antilichaam in de antilichaamverdunningsbuffer (1% normaal geitenserum in PBS). Incubeer de gerechten met 0,5 ml verdund secundair antilichaam gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: Meestal wordt het secundaire antilichaam gebruikt bij een verdunning van 1:500-1:1.000. DAPI kan worden gebruikt voor het kleuren van de kernen.</li>
		<li>Spoel 3x af met 2 ml PBS gedurende telkens 5 min. Plaats de afdekplaat met 50 μL montagemedium. OPMERKING: De gerechten kunnen worden afgebeeld met behulp van de alles-in-één fluorescentiemicroscoop met een GFP-filter (excitatie: 470/40, emissie: 525/50) en een TexasRed-filter (excitatie: 560/40, emissie: 630/75) in monochrome modus met instellingen met hoge resolutie (versterking bij 6 dB, geen binning). Voor de beeldvorming in dit onderzoek werden objectieflenzen met vergrotingen van 4x tot 20x gebruikt. OPMERKING: De dia kan maximaal 2 maanden worden bewaard bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Data-analyse
<ol><li>Open de ImageJ 1.51s-software. Selecteer in het ImageJ-venster Bestand > openen in de menubalk om het opgeslagen afbeeldingsbestand te openen.</li>
	<li>Voor het instellen van de meetschaal tekent u een lijn van dezelfde afstand als de schaalbalk. Ga naar Schaal analyseren > instellen en typ de bekende afstand en eenheden van de lijn in de juiste vakken van het venster Schaal instellen .</li>
	<li>Teken een rechte lijn tussen de celspleet en druk op Analyseren > meten om de waarden over te brengen naar een gegevensvenster. Meet ten minste vijf verschillende posities in elk monster en bereken het gemiddelde van de afstanden om de representatieve steekproefgegevens te verkrijgen. Voer de statistische analyses uit met behulp van de juiste software (zie Materiaaltabel).</li>
</ol>

<ol><li>Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+switches+in+mammalian+neural+crest+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).</li>
<li>Casini, P., Nardi, I., Ori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan+is+required+for+cranial+neural+crest+cells+migration+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development.</a> Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).</li>
<li>Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versican+is+selectively+expressed+in+embryonic+tissues+that+act+as+barriers+to+neural+crest+cell+migration+and+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth.</a> Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+hyaluronan+synthase-2+abrogates+normal+cardiac+morphogenesis+and+hyaluronan-mediated+transformation+of+epithelium+to+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme.</a> Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).</li>
<li>Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-valve+mesenchyme+formation+is+dependent+on+hyaluronan-augmented+activation+of+ErbB2-ErbB3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors.</a> Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).</li>
<li>Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hyaluronan+synthase-2+in+craniofacial+and+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development.</a> Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).</li>
<li>Irie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+regulates+cell+adhesion+and+migration+via+degradation+of+hyaluronan+at+focal+adhesion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites.</a> Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).</li>
<li>Yamamoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+the+zebrafish+transmembrane+protein+2+%28TMEM2%29+is+the+long-sought-after+cell-surface+hyaluronidase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).</li>
<li>Inubushi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+surface+hyaluronidase+TMEM2+plays+an+essential+role+in+mouse+neural+crest+cell+development+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival.</a> PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).</li>
<li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Humphries, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+controls+focal+adhesion+formation+by+direct+interactions+with+talin+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin.</a> Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).</li>
<li>Perris, R., Perissinotto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+extracellular+matrix+during+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration.</a> Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).</li>
<li>Perris, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+changes+in+the+distribution+of+proteoglycans+during+avian+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development.</a> Development. 111 (2), 583-599 (1991).</li>
<li>Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+developmental+expression+and+function+in+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Decorin developmental expression and function in the early avian embryo.</a> The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).</li>
<li>Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+avian+neural+crest+cell+migration+on+fibronectin+and+laminin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin.</a> Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+tissue+mechanical+properties+affect+enteric+neural+crest+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration.</a> Scientific Reports. 6, 20927(2016).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Griffith, L. G., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+complex+3D+tissue+physiology+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capturing complex 3D tissue physiology in vitro.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
<li>Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+methods+for+cell-cycle+synchronization+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells.</a> Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).</li>
<li>Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+T+lymphocyte+adhesion+receptor+for+an+alternative+cell+attachment+domain+%28CS-1%29+in+plasma+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin.</a> Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).</li>
<li>Robert, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+3-aminopropyltriethoxysilane+layers+formed+on+silanol-terminated+silicon+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces.</a> The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).</li>
</ol>

De auteur verklaart dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.

Verschillende ECM-componenten regelen NCC-emigratie/-migratie. Zo reguleert HA de NCC-migratie 2,15 positief. Interessant is dat een studie op basis van genetische muismodellen van Tmem2, een hyaluronidase van het celoppervlak, de vereiste van HA-degradatie bij NCC-migratieophelderde 9. Collageen zijn ook overvloedig aanwezig in de ECM rond de neurale buis16. Van decorine, een kleine leucine-rijke proteoglycaan, is ...

Neurale topcellen (NCC's) zijn een multipotente celpopulatie die aanwezig is in zich ontwikkelende embryo's en ze zijn afkomstig van de neurale plaatrand tijdens neurulatie. Ze dragen bij aan de vorming van een verscheidenheid aan weefsels, waaronder het perifere zenuwstelsel, het cardiovasculaire systeem, craniofaciale weefsels en het skelet1. Na inductie en NCC-specificatie aan de neurale plaatrand emigreren NCC's van het neuro-epitheel en migreren ze naar NCC-afgeleide weefsellocaties1.
Hyaluronaat (HA) is een niet-gesulfateerd glycosaminoglycaan dat in verschillende weefsels wordt verdeeld als onderdeel van de extracellulaire matrix (ECM). Het belang van HA in de ontwikkeling van embryo's is aangetoond in modelsystemen door de ablatie van genen die verantwoordelijk zijn voor het hyaluronaatmetabolisme. Zo bleken mutaties in hyaluronaatsynthasegenen (Has1 en Has2) in Xenopus te leiden tot NCC-migratiedefecten en craniofaciale misvorming2. Bovendien is gemeld dat de HA-bindende proteoglycanen, aggrecan en versican, remmende effecten uitoefenen op NCC-migratie3. Bij muizen leidt Has2-ablatie tot ernstige defecten in de vorming van endocardiale kussens, wat resulteert in een dodelijkheid halverwege de dracht (E9,5-10) 4,5,6.
Van transmembraaneiwit 2 (Tmem2), een hyaluronidase van het celoppervlak, is onlangs aangetoond dat het een cruciale rol speelt bij het bevorderen van integrine-gemedieerde kankerceladhesie en migratie door het verwijderen van matrix-geassocieerd HA op de adhesieplaatsen 7,8. Meer recent toonden Inubushi et al.9 aan dat een tekort aan Tmem2 leidt tot ernstige craniofaciale defecten als gevolg van afwijkingen in NCC emigratie/migratie en overleving. In de vorige studie9 werd Tmem2-expressie geanalyseerd tijdens NCC-vorming en migratie. Tmem2-expressie werd waargenomen op de plaats van NCC-delaminatie en bij het emigreren van Sox9-positieve NCC's (figuur 1). Bovendien toonde de studie, met behulp van Tmem2-uitgeputte muis O9-1 neurale topcellen, aan dat de in vitro expressie van Tmem2 essentieel was voor de O9-1-cellen om focale verklevingen te vormen en voor hun migratie naar HA-bevattende substraten (figuur 2 en figuur 3)9.
Deze resultaten geven sterk aan dat Tmem2 ook belangrijk is voor NCC-adhesie en migratie via de HA-rijke ECM. Het moleculaire mechanisme van NCC-adhesie en migratie binnen de HA-rijke ECM is echter nog steeds onduidelijk. Het is daarom noodzakelijk om een experimenteel systeem voor in vitro kweken op te zetten om de NCC-adhesie en -migratie binnen de HA-rijke ECU volledig te onderzoeken.
Van de vele benaderingen die worden gebruikt bij het testen van celmigratie, is de op celwondsluiting gebaseerde test een eenvoudige methode die vaak wordt gebruikt op het gebied van fysiologie en oncologie10. Deze benadering is nuttig vanwege de relevantie voor het in vivo fenotype en is effectief bij het bepalen van de rol van geneesmiddelen en chemoattractanten tijdens celmigratie11. Het is mogelijk om het migratievermogen van zowel hele celmassa's als individuele cellen te evalueren door de celspleetafstanden in de loop van de tijdte meten 11. In dit manuscript wordt een gemodificeerde in vitro op wondsluiting gebaseerde test geïntroduceerd om NCC-migratie te modelleren naar HA-rijke weefsels rond de neurale buis. Deze procedure is ook van toepassing op het bestuderen van verschillende ECM-componenten (d.w.z. collageen, fibronectine en laminine) om de rol van de ECM-steiger in NCC-migratie te analyseren.

<table><tbody><tr><td>10cm celkweekschaal</td><td>CORNING</td><td>Cat. 353003</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nr. BSS-1005-B</td><td></td></tr><tr><td>2-puts celkweekinserts</td><td>ibidi</td><td>Cat. Nr. 80209</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-gelabelde geiten anti-muis IgG</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. A21422</td><td>Geitenafgeleid anti-muis secundair antilichaam</td></tr><tr><td>geautomatiseerde celteller</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat. Nr. TC20</td><td></td></tr><tr><td>CELLBANKER</td><td>ZENOGEN PHARMA</td><td>Cat. 11910</td><td>Celbevriezingsmedium</td></tr><tr><td>collageen type I</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr. 08-115</td><td></td></tr><tr><td>Complete ES Cell Medium</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nr. ES-101-B</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>Cat. 10184322</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Gemodificeerd Eagle Medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>Cat. 11971025</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>Gibco</td><td>Cat. 10270106</td><td></td></tr><tr><td>fluorescentiemicroscoop</td><td>Keyence</td><td>Cat. Nr. BZ-X700</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescerend gelabeld HA</td><td>PG Research</td><td>FAHA-H2</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodemschaal</td><td>Iwaki</td><td>Cat. 11-0602</td><td></td></tr><tr><td>glutaldehyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr. G5882</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Fisher</td><td>Cat. Nr. CB-40234</td><td>De basement-membraan matrix</td></tr><tr><td>monoklonaal anti-vinculine antilichaam</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr. V9264</td><td></td></tr><tr><td>montagemedium</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Fisher</td><td>Cat. 50062Z</td><td></td></tr><tr><td>O9-1 cellen</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nr. SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>Cat. 158127</td><td></td></tr><tr><td>triethoxysilaan</td><td>Sigma</td><td>Cat. Nr. 390143</td><td></td></tr><tr><td>trypsine-EDTA</td><td>Millipore</td><td>Cat. Nr. SM-2003-C</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie

In Vitro Investigation of the Effects of the Hyaluronan-Rich Extracellular Matrix on Neural Crest Cell Migration

Neurale topcellen (NCC's) zijn sterk migrerende cellen die afkomstig zijn uit het dorsale gebied van de neurale buis. De emigratie van NCC's uit de neurale buis is een essentieel proces voor NCC-productie en hun daaropvolgende migratie naar doellocaties. De migratieroute van NCC's, inclusief de omliggende neurale buisweefsels, omvat hyaluronaat (HA) -rijke extracellulaire matrix. Om NCC-migratie in deze HA-rijke omliggende weefsels vanuit de neurale buis te modelleren, werd in deze studie een gemengde substraatmigratietest bestaande uit HA (gemiddeld molecuulgewicht: 1.200-1.400 kDa) en collageen type I (Col1) vastgesteld. Deze migratietest toont aan dat NCC-cellijn, O9-1, cellen sterk migrerend zijn op het gemengde substraat en dat de HA-coating wordt afgebroken op de plaats van focale verklevingen in de loop van de migratie. Dit in vitro model kan nuttig zijn voor verdere verkenning van de mechanistische basis die betrokken is bij NCC-migratie. Dit protocol is ook van toepassing voor het evalueren van verschillende substraten als steigers om NCC-migratie te bestuderen.

Een migratietest werd uitgevoerd op gemengde substraten bestaande uit Col1 en hoog molecuulgewicht HA (gemiddeld molecuulgewicht: 1.200-1.400 kDa) met behulp van het hier beschreven protocol. O9-1-cellen aan de grens van de kloof bleken gemakkelijk te migreren naar de HA-rijke kloof (figuur 4). Immunostaining voor een FA-marker, vinculine14, bevestigde dat de O9-1-cellen focale verklevingen (VA's) vormden op de plaatsen van HA-afbraak (figuur 5</s...

Dit protocol schetst een in vitro migratie-experiment dat geschikt is voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij de in vivo migratie van neurale topcellen naar de hyaluronrijke extracellulaire matrix.

In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie

Neural crest cells (NCCs) are highly migratory cells that originate from the dorsal region of the neural tube. The emigration of NCCs from the neural tube ...

Hyaluronzuur is een van de meest voorkomende extracellulaire matrixen in diermodellen. Het belang van hyaluronzuur in de embryonale ontwikkeling is aangetoond. Dit in vitro model is nuttig om te onderzoeken hoe neurale topcellen zich hechten en migreren binnen de hyaluronzuurrijke extracellulaire matrix.Met onze techniek kunnen we de migratie en het HA-degradatievermogen van zowel de groothandelspopulatie als vervolgens individuele cellen in de loop van de tijd evalueren. Bovendien kan deze techniek worden gebruikt voor medicijnscreening om verbindingen te vinden die HA-afbraak versnellen of voorkomen. Verdun om te beginnen de keldermembraanmatrix met gekoelde PBS in een verhouding van 1:50 en houd deze op ijs.Bedek een kweekplaat van 10 centimeter met 10 milliliter van de verdunde matrixoplossing en incuber de plaat gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was de plaat drie keer met twee milliliter PBS. Om de O9-1-cellen op de matrix gecoate plaat te kweken, verwarmt u de volledige embryonale stam of ES-celmedium in een waterbad bij 37 graden Celsius.Meng voorzichtig de O9-1 celsuspensie en tel het aantal cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller. Pas vervolgens de celconcentratie aan tot 1,1 miljoen cellen per milliliter met het volledige ES-celmedium. Voeg acht milliliter voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de matrixgecoate kweekplaat van 10 centimeter en zaai de O9-1-cellen met 1,1 miljoen cellen per plaat.Incubeer bij 37 graden Celsius in een 5% kooldioxide bevochtigde incubator. Vervang de volgende dag het medium door vers compleet ES-celmedium voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Vervang daarna om de twee tot drie dagen door vers medium.Was de kweekplaat met twee milliliter PBS en voeg vervolgens twee milliliter voorverwarmde 0,25% Trypsine-EDTA toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Voeg twee milliliter voorverwarmd compleet ES-celmedium toe aan de kweekplaat en breng de gedissocieerde cellen over in een conische buis van 15 milliliter.Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 300 g en gooi het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren. Voeg twee milliliter voorverwarmd volledig ES-celmedium toe aan de buis en resuspensie de cellen grondig door pipetteren. Zaai de cellen vervolgens op een nieuwe kweekplaat met de gewenste celdichtheid.Voeg voorzichtig 50 microliter onverdund triethoxysilaan toe aan een schaal met glazen bodem van 3,5 centimeter en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was de schaal drie keer met twee milliliter gedestilleerd water en voeg 50 microliter 0,25% glutaaraldehyde 100 keer verdund in PBS per gerecht toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, was vervolgens vier keer met twee milliliter PBS en bedek de gerechten met 300 microliter collageen type één in 0,2 normaal azijnzuur bij kamertemperatuur gedurende een uur.Nogmaals, was drie keer met twee milliliter PBS. Voeg 300 microliter van 200 microgram per milliliter fluoresceinamine, gelabeld natriumhyaluronaat H2 toe aan elk gerecht en incubeer een nacht bij kamertemperatuur. Was opnieuw met twee milliliter PBS drie keer.Na het drogen van de gecoate glazen bodemschaal, bevestigt u de twee putcultuurinzetstukken aan de gerechten en vult u de inzetstukken extern met één milliliter PBS. Zaai de O9-1-cellen in de putjes bij 10.000 cellen in 100 microliter DMEM met 2% foetaal runderserum of FBS per insert. Kweek de cellen gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide bevochtigde incubator, Leg fasecontrastbeelden vast als het begintijdpunt, met behulp van een alles-in-één fluorescentiemicroscoop.Verwijder de inzetstukken voorzichtig van de gecoate glazen bodemschalen met een pincet en was de gecoate glazen bodemschalen voorzichtig met twee milliliter PBS om de cellen en celresten te verwijderen. Voeg twee milliliter verse DMEM met 2% FBS toe aan de gekweekte gerechten. Kweek de cellen nog eens 48 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en leg fasecontrastbeelden vast na 24 uur en 48 uur in cultuur.Was de vaat met PBS en fixeer de cellen na 48 uur met één milliliter 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur of 's nachts bij vier graden Celsius. Was vervolgens de afwas drie keer gedurende vijf minuten elk met een milliliter verse PBS. Plaats ten slotte een afdekplaat met het montagemedium voor verdere morfologische observatie.Transversale secties van de neurale buis van Tmem2-vlagembryo's op E9.0 zijn in deze figuur weergegeven. De secties op craniaal en rompniveau van de neurale buis waren dubbel gelabeld voor het Tmem2-vlageiwit en hyaluronaat. Tmem2-expressie werd waargenomen in de neurale plaat en het grensgebied van de neurale buis, terwijl deze plaatsen verstoken waren van hyaluronakleuring.Dubbele labeling van de neurale topcellen voor Tmem2-vlag en Sox9 wordt hier weergegeven. Transversale secties van de E9.0 neurale buis werden gekleurd voor Tmem2 vlag en Sox9. De representatieve beelden van Tmem2 uitgeputte en controle O9-1 cellen gekweekt op een gewone kweekschaal zijn weergegeven in deze figuur.De expressie van Tmem2 in deze cellen werd geëvalueerd door qPCR met GAPDH als interne controle voor normalisatie. Tmem2-uitgeputte en controle O9-1-cellen werden gedurende 48 uur gekweekt op glazen afdekstroken bedekt met gefluoresceerd hyaluronaat. Hyaluronaat degraderende activiteit wordt onthuld als donkere gebieden in de fluorescerende achtergrond.Het niveau van hyaluronaatafbraak werd ook kwantitatief vergeleken tussen Tmem2-uitgeputte en controle-O9-1-cellen. De afbraak van substraatgebonden hyaluronaat bij de focale verklevingen in O9-1-cellen is in deze figuur weergegeven. O9-1-cellen gekweekt op gemengde substraten bestaande uit Col1/HA werden immunogelabeld met een anti-vinculine-antilichaam.De donkere vlekken of strepen vertegenwoordigen hyaluronaatafbraakactiviteit in het FAHA H2-substraat. De plaatsen van hyaluronaatafbraak en focale verklevingen werden geco-lokaliseerd op de gemengde substraten. Coval coating van de glazen bodemschalen met HA is een cruciale stap in het protocol omdat onvoldoende coating ertoe kan leiden dat de HA gemakkelijk kan worden verwijderd door mechanische kracht tijdens hechting en migratie.Om een goede coating te garanderen, gebruiken we glutaaraldehyde, chemisch geïmmobiliseerd type één collageen aan het glas via een bewapeningskoppeling aan het aldehyde. Het is mogelijk om extracellulair matrixsubstraat te gebruiken naast type één collageen, maar ze moeten bewapeningsgroepen hebben en er kunnen beperkingen zijn in het covalcoaten op glazen bodemschalen vanwege hun chemische eigenschappen. Vallen en opstaan kan dus nodig zijn om de beste aanpak te bepalen.Dit laboratoriumexperiment kan nuttig zijn bij het bestuderen van hoe bepaalde moleculen werken tijdens de beweging van neurale topcellen in de HA- of HA-omgeving rond de neurale buis. Het kan ook een nuttige manier zijn om medicijnen te testen die dit migratieproces kunnen versnellen of voorkomen. Het is interessant om te weten waarom Tmem2 zowel de functies van adhesie over HA als de afbraak van HA heeft en waarom HA op de volledige cohesieplaats moet worden afgebroken.Aangezien HA de meest voorkomende stof in de extracellulaire matrix is, is het uitzoeken van het antwoord op deze vraag erg belangrijk in de biologie en de geneeskunde. Dit experimentele protocol is waardevol omdat het kan worden toegepast op verschillende celtypen, waaronder huidfibroblasten, epitheelcellen en kankercellen.

in-vitro-investigation-effects-hyaluronan-rich-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.

Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen

Een benadering om de migratie van cellen geëxplanteerde (trunk neurale cellen) analyseren beschreven. Deze methode is goedkoop, zacht en kunnen onderscheiden chemotaxis van zowel chemokinesis en andere invloeden op trekkende polariteit zoals die afgeleid van cel-cel interacties in de primaire neurale stam celkweek.

Analyse van Trunk neurale cel migratie met behulp van een gewijzigd Zigmond Kamer Assay

De craniale mesenchym ondergaat dramatische morfogenische bewegingen die waarschijnlijk zorgt voor een drijvende kracht voor verhoging van de neurale...

Een Explantatie Assay voor het beoordelen van cellulair gedrag van de craniale mesenchym

Dit protocol beschrijft hoe premigratory craniale neurale lijst (NC) ontleden van Xenopus laevis neurulas. Deze explanten worden uitgeplaat op fibronectine en gekweekt in vitro of terug in gastheercellen embryo geënt. Deze techniek maakt het bestuderen van de mechanismen van NC epitheel naar mesenchym overgang, migratie en differentiatie.

Dissectie van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Neurale lijst voor<em&gt; In vitro</em&gt; Explantaatkweek of<em&gt; In vivo</em&gt; Transplantatie

De mechanische eigenschappen en de microstructuur van de extracellulaire matrix sterk beïnvloeden 3D migratie van cellen. Een in vitro werkwijze om de tijdruimtelijk celmigratie gedrag biofysisch variabele omgevingen zowel bevolking en afzonderlijke cel niveaus, gaande beschreven.

Concentrische Gel Systeem om de biofysische rol van matrix Microenvironment op 3D-Cell Migratie Bestudeer

Epitheliële naar mesenchymale overgang (EMT) maakt het mogelijk dat kankers invasief worden. Om EMT te onderzoeken, wordt een op neurale stamcellen (NSC) gebaseerd in vitro model beschreven dat vrij is van serum en enzymen. Dit gestandaardiseerde systeem maakt een kwantitatieve en kwalitatieve beoordeling van celmigratie, gen- en eiwitexpressie mogelijk. Het model is geschikt voor geneesmiddelontdekking.

Een enzym en Serum-free neurale stamcel Cultuur Model voor EMT Investigation Geschikt voor Drug Discovery

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Leer een in vitro migratieassay om neurale topcelmigratie te bestuderen in een hyaluronzuurrijke extracellulaire matrix. Deze methode maakt evaluatie van celadhesie en HA-afbraak mogelijk voor onderzoek naar ontwikkelingsbiologie.

In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie

Meer video's verkennen