Visualisatie en kwantificering van endogene intra-organeleiwitinteracties op ER-mitochondriale contactlocaties door nabijheidsligatietests

Ons PLA-protocol maakt het mogelijk om endogene interactie tussen eiwitten op membraancontactplaatsen te identificeren en te kwantificeren. We hebben het gebruikt om de interactie tussen twee endoplasmatische reticulumeiwitten op endoplasmatisch reticulum mitochondriale contactplaatsen te bestuderen. Deze techniek combineert PLA met organelkleuringen en analyse van de afstanden van organellen.

Het maakt het mogelijk om te lokaliseren en te kwantificeren in interactie tussen eiwitten op inter-organellen membraancontactplaatsen. Na het uitvoeren van proximity ligation assay, of PLA, en beeldacquisitie, stelt u de celanalysesoftware in om MATLAB te starten en een extensie te starten door op de optie Imaris in het Mac-besturingssysteem of het bewerkingsmenu in Windows te klikken. Selecteer de voorkeuren, ga naar het deelvenster Aangepaste gereedschappen en stel het pad in.

Om de afbeeldingen in de software te importeren, converteert u de confocale stapelafbeeldingen naar een IMS-bestand, rechtstreeks via het arenagedeelte of met behulp van de zelfstandige bestandsconverter die batchconversie mogelijk maakt. Klik na het importeren op bewerken, ga naar afbeeldingseigenschappen en selecteer afbeeldingsgeometrie om de beeldkalibratie te controleren. Controleer of de voxelgrootte overeenkomt met de pixelgrootte die wordt verwacht voor de werkelijke afbeelding in X en Y, en de stap die door de microscoop is toegepast om de Z-stapel te genereren in Z.To het contrast van de verschillende kanalen aan te passen Klik op Bewerken in het menu, ga naar de weergaveaanpassing en selecteer Weergaveaanpassing weergeven.

Pas elk kanaal afzonderlijk aan om de weergave van elke kleur te optimaliseren. Deze stap is essentieel om nauwkeurige drempelwaarden in te stellen of zwakke objecten te detecteren. Klik vervolgens op bewerken en selecteer 3D bijsnijden om de analyse te beperken tot één cel door de afbeelding bij te snijden.

Als u een andere cel in hetzelfde gezichtsveld wilt analyseren, opent u dezelfde afbeelding opnieuw en snijdt u deze anders bij. Detecteer de PLA-signalen die worden gegenereerd op de locatie van ORP5- en ORP8-interactie door op de optie Nieuwe vlekken toevoegen te klikken, waarmee een nieuwe set objecten wordt gemaakt en de wizard voor spotdetectie wordt geopend. Selecteer het kanaal waarop de spotdetectie moet worden uitgevoerd.

Pas de geschatte XY-diameter aan om het spotdetectiealgoritme te helpen de interessante objecten te vinden. Als de gekozen waarde te hoog is, zullen de nabijgelegen objecten fuseren en als de waarde te klein is, kunnen afwijkende signalen worden gedetecteerd. Klik nu op achtergrondaftrek om de achtergrond van de afbeelding te verwijderen vóór spotdetectie om het lokale contrast rond de interessante objecten te verbeteren.

Pas de drempelwaarde voor spotdetectie aan door de kwaliteit als drempelparameter in de automatische drempelwaarde van de software te behouden of wijzig deze waarde enigszins om alle objecten te detecteren. Zodra de spotdetectie is voltooid, slaat u de detectieparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken. Detecteer vervolgens het mitochondriale netwerk om een oppervlakteweergave te genereren door te klikken op Nieuwe oppervlakken toevoegen om een nieuw object te maken en de oppervlaktedetectiewizard te openen.

Selecteer het kanaal waarop het maken van het oppervlak moet worden uitgevoerd. Pas het Gauss-filter toe om een gladder oppervlak te verkrijgen door op het vloeiende selectievakje te klikken en een drempel in te stellen die de kleine details aangeeft die op het oppervlak waarneembaar zijn. Voer daarna een achtergrondaftrek uit om de lokale contrasten te verbeteren en pas de drempel aan om het mitochondriale netwerk te detecteren op basis van de intensiteit van het signaal.

Pas een filter toe op het oppervlak om kleine resten van de drempel te verwijderen door het aantal voxels-filters in het venster Classificeren te selecteren en speel met de bovenste en onderste drempels om alleen de objecten van belang te houden. Zodra het maken van het oppervlak is voltooid, slaat u de aanmaakparameters op en gebruikt u deze opnieuw om andere afbeeldingen te verwerken. Als u een afstandskaart buiten het gecreëerde mitochondriale oppervlak wilt genereren, selecteert u het mitochondriënoppervlak in de scèneboomvak.

Klik op beeldverwerking en selecteer de functie Oppervlakken, gevolgd door afstandstransformatie. Er verschijnt een MATLAB-extensie waarin de gebruiker wordt gevraagd te kiezen of de kaart buiten of binnen het objectoppervlak moet worden berekend. Selecteer het buitenoppervlakobject om de afstand tussen de PLA-vlekken en het oppervlak van de mitochondriën te meten.

Zodra de kaart is gegenereerd, wordt deze weergegeven als een nieuw kanaal in het weergave-aanpassingsvenster. In dit kanaal heeft elke pixel een waarde die overeenkomt met de afstand tot de dichtstbijzijnde mitochondriën. Selecteer de vlekken die eerder zijn gegenereerd in de scèneboomdoos om de afstand van elk punt tot het dichtstbijzijnde mitochondrion te meten en identificeer en visualiseer de dichtstbijzijnde.

Selecteer nu specifieke waarden en centrumintensiteit van het kanaal dat overeenkomt met de afstandskaart in de statistieken en het gedetailleerde logboek om de waarde van elk spotcentrum te meten, wat overeenkomt met de afstand tot het dichtstbijzijnde mitochondrion in de afstandskaart. Exporteer de gegevens als een CSV-bestand door op het diskettepictogram linksonder in het venster te klikken. Om een subpopulatie van vlekken te extraheren op basis van hun afstanden tot mitochondriën, selecteert u de vlekken in de scèneboom en klikt u op het tabblad Filters.

Voeg een nieuw filter toe op basis van de centrumintensiteit van het kanaal dat overeenkomt met de afstandskaart in dit venster en extraheer de vlekken op minder dan 380 nanometer afstand van de mitochondriën door de onderste drempel in te stellen op nul micrometer en de bovenste drempel op 0,380 micrometer. Voer een duplicatiestap uit door op de knop Selectie dupliceren naar nieuwe vlekken te drukken om u te concentreren op de geselecteerde vlekken. Confocale beelden van endogene ORP5-ORP8 PLA toonden interacties in de HeLa-cellen in de reticulaire ER-, corticale ER- en ER-subdomeinen in nauw contact met mitochondriën, gewoonlijk mitochondriën-geassocieerde ER-membranen genoemd.

3D-beeldvormingsanalyse toonde aan dat ongeveer 50% van de endogene ORP5-ORP8 PLA-interacties werden gedetecteerd bij mitochondriën-geassocieerde ER-membranen. Het percentage ORP5-ORP8 PLA-interacties dat optreedt bij mitochondriën-geassocieerde ER-membranen in cellen die ORP5 en ORP8 co-overexpresseren, was vergelijkbaar met dat waargenomen in cellen waar deze eiwitten tot expressie kwamen op endogene niveaus. ORP5- en ORP8-downregulatie veroorzaakte een enorme afname van het totale aantal PLA-signalen, terwijl hun co-overexpressie PLA verhoogde.

PLA-signalen werden gedetecteerd in ORP5-PTPIP51 en ORP8-PTPIP51 paren, en hun gemiddelde aantallen waren vergelijkbaar met het ORP5-ORP8 PLA-paar, wat de ORP5- en ORP8-lokalisatie op ER-mitochondriale membraancontactplaatsen bevestigde. Verder wordt de interactie van ORP5-ORP8 PLA bij ER-plasmamembraancontacten in een driewegcontactplaats tussen mitochondriën, het ER en lipidedruppels geïdentificeerd met behulp van HeLa-cellen getransfecteerd met PHPLCD-RFP of mCherry-PLN1. Zoals bij elke beeldanalysemethode is de beeldkwaliteit een belangrijk punt, dus de optimalisatie van het signaal is bepalend voor de automatische detectie van de objecten.

Deze techniek kan ook worden gebruikt om de associaties tussen twee of meerdere cellulaire organellen te bestuderen, zoals we deden in onze recente studie over ORP5- en ORP8-functie op de driepartijen-ER, mitochondriën, lipidedruppels contactplaatsen. Deze techniek kan nuttig zijn in andere studies op het gebied van intracellulaire communicatie om nieuwe multipartiete interorganelassociaties te identificeren.