Laserablatie en intravitale microscopie om intestinale remodellering te bestuderen

Letselmodellen zijn onmisbaar om regeneratie in vivo te bestuderen, maar het onderzoeken van regeneratie in de darm blijkt een technische uitdaging te zijn. Het ontbreken van longitudinale beeldvormingsprotocollen heeft een dieper inzicht in de cel- en weefselschaaldynamiek die darmregeneratie orkestreert, verhinderd. In dit protocol beschrijven we een intravitale microscopiemethode die lokaal weefselschade induceert op enkele crypteschaal en de regeneratieve respons van het darmepitheel in de levende muis volgt op op fotonen gebaseerde laserablatieschade van enkele crypte of grotere darmvelden op een tijd- en ruimtegecontroleerde manier.

Daaropvolgende, langdurige, repetitieve intravitale beeldvorming maakt het mogelijk om het beschadigde gebied in de loop van de tijd te volgen en maakt het mogelijk om de cryptdynamiek tijdens weefselherstel gedurende een periode van meerdere weken te volgen. Induceer muizen door tamoxifen opgelost in zonnebloemolie te injecteren in vier tot zes weken voorafgaand aan de operatie. Breng analgesie aan, injecteer 200 microliter buprenorfine subcutaan 30 minuten voor de operatie.

Dien carprofen toe in drinkwater 24 uur voor de operatie. Introduceer geautoclaveerde steriele chirurgische hulpmiddelen in de biohazard-kast. Zet het verwarmingskussen aan en stel de temperatuur in op 37 graden Celsius.

Zet de temperatuurregelkamer van de microscoop ten minste vier uur voor de beeldvorming aan. Houd de temperatuur in de klimaatkamer stabiel op 37 graden Celsius. Schakel de twee fotonenmicroscoop, de scanner en de laser in.

Start de beeldbewerkingssoftware. Stem de golflengte van de laser af op 960 nanometer en open de sluiter. Verdoof de muis met twee tot 3% isofluraan en plaats deze op een verwarmingskussen bedekt met een steriele doek.

Controleer de diepte van de anesthesie door de frequentie en de kwaliteit van de ademhaling één ademhaling per seconde te beoordelen en door de reflex van de muis te controleren. Bedek de ogen van de muis met oogzalf. Injecteer 200 microliter voorverwarmde steriele zoutoplossing subcutaan.

Scheer de buik en verwijder het haar. Vervang de steriele doek in het operatiegebied. Plaats een rectale sonde om de temperatuur van de muis te controleren.

De temperatuur moet ongeveer 37 graden Celsius zijn. Draag een nieuw paar steriele handschoenen. Reinig het operatiegebied op een cirkelvormige manier met afwisselende scrubs van antiseptische oplossing gevolgd door 80% ethanol drie keer.

Bedek de muis met een steriel chirurgisch gordijn. Controleer de reflex van de muis. Maak een verticale middellijnincisie van 10 millimeter door de huid met behulp van een steriel scalpel.

Snijd de linea alba in met de schaar om de rectus buikspieren te scheiden en de buik te openen. Zoek de blindedarm van de muis met behulp van een steriel wattenstaafje gedrenkt in voorverwarmde zoutoplossing om het als referentiepunt te gebruiken. Maak een klein stukje gaas, maak het nat in voorverwarmde steriele zoutoplossing en plaats het boven de incisie.

Verwijder de darm met steriele wattenstaafjes gedrenkt in voorverwarmde steriele zoutoplossing. Houd de darm gehydrateerd door gesteriliseerde voorverwarmde zoutoplossing toe te voegen. Breng de muis over in een voorverwarmde steriele beeldvormingsdoos.

Plaats de darm op het steriele glas. Plaats de kop van de muis in de inhalatiebuis van de beeldvormingsdoos. Zet de muis indien nodig vast met steriele flexibele folie en tape.

Plaats de beeldvormingsdoos met de muis in de microscoopkamer. Controleer de muis tijdens de beeldvorming door elke 15 minuten de frequentie en diepte van de ademhaling en de temperatuur te controleren via een rectale sonde. Isofluraan moet tussen één en 2% worden gehoudenZoek een gebied in de darm met behulp van de IP's van de microscoop.

Verkrijg een breed gezichtsveld van het gebied van belang met behulp van de interne camera van de microscoop. Beeld het gebied van belang met behulp van de 960 nanometer laser van multifoton microscoop. Pas het laservermogen en de golflengte aan volgens de fluorvormen die in het experiment worden gebruikt.

In dit voorbeeld is het tot expressie gebrachte membraan rood fluorescerend eiwit en worden ze stochastisch gelabeld met groen fluorescerend eiwit bij inductie met een lage dosis tamoxifen. Verkrijg een 10 tot 20 stap Z-stack van drie micron van het interessegebied. Kies eerder één positie of meerdere posities uit de tegelafbeelding.

Gebruik de kalibratiefunctie voor inbreukpunten in de beeldbewerkingssoftware met een resolutie van zoom 32 en 124 bij 124 pixels met een scansnelheid van 400 hertz met behulp van de bidirectionele scaneigenschap gedurende drie tot 10 seconden, afhankelijk van de grootte van de beoogde schade. Het initiëren van schade in het cryptegebied is te herkennen aan een toename van autofluorescentie in zowel het groene als het rode kanaal. Verkrijg na ablatie Z-stacks van de beschadigde regio's om de locatie en de omvang van de schade te bevestigen.

Herhaal de vorige twee stappen voor meerdere regio's in dezelfde muis. Plaats de muis terwijl hij nog onder narcose is op een steriel hechtgebied en dek af met een steriel gordijn. Steek de blootgestelde darm terug in de buik met behulp van steriele wattenstaafjes gedrenkt in voorverwarmde steriele zoutoplossing.

Hecht de linea alba door eenvoudige continue hechting uit te voeren met behulp van absorbeerbare hechtdraad. Sluit de ledematen van de hechting met chirurgische knopen. Herhaal dezelfde stap met de huidlaag.

Schakel het isofluraanstation uit, reinig en steriliseer de beeldvormingsdoos en inlay. Laat de muis herstellen van een operatie terwijl de kooi gedurende een uur op het verwarmingskussen wordt geplaatst. Injecteer 200 microliter buprenorfine subcutaan zes tot 12 uur na de operatie.

Dien carprofen toe in drinkwater gedurende 72 uur na de operatie. Weeg de muis en controleer het welzijn elke dag gedurende een week na de operatie. Op het tweede tijdstip ten minste een week na de eerste beeldvormingssessie, herhaal de operatie en intravitale beeldvorming.

Gebruik het patroon van bloedvaten om dezelfde interessante regio's terug te vinden op het eerste tijdstip. Als het niet de bedoeling is dat de muis op een ander tijdstip wordt afgebeeld, offer de muis dan op door cervicale dislocatie onder anesthesie uit te voeren. Ga anders door met de sluiting van de chirurgische site en postoperatieve zorg.

K19-Cre ERT mTmG-muizen werden vier tot zes weken voor de operatie en de eerste beeldvormingssessie geïnjecteerd met tamoxifen om stochastische etikettering van cellen met GFP te induceren. Na het chirurgisch blootleggen van de darm van de muis en het verkrijgen van camera- en fluorescerende beelden van het interessegebied, worden breekpuntinstellingen van de multifotonlaser gebruikt om crypten te aborteren. Het initiëren van schade is te herkennen aan een toename van autofluorescentie in zowel het groene als het rode kanaal.

Dezelfde procedure wordt een maand later herhaald en de vasculatuur wordt gebruikt als een oriëntatiepunt om dezelfde regio terug te vinden. Met behulp van het Lgr5-eGFP-confettimodel kunnen crypten met verschillende kleuren in de loop van de tijd worden gevolgd om de dynamiek van herstel in kaart te brengen. In dit voorbeeld drukken crypten in het groen de Lgr5 Cre uit en een crypte in magenta is gelabeld met confettikleur.

Verschillende vormen van regeneratie worden twee weken na laserablatie waargenomen. Sommige regio's blijven ongewijzigd, terwijl andere regio's verbouwingen vertonen in vormen van cryptensplitsing, dus de verdeling van één crypte in twee, of fusie, samenvoeging van twee crypten tot één, of crypteverdwijning. Laserablatie in combinatie met intravitale microscopiemethode beperkt de schade tot een bepaald interessegebied.

Dit stelt ons in staat om de locatie van de schade en de omvang van de schade te controleren. De ernst van de schade kan worden gemoduleerd om crypten of hele darmvelden te aborteren om ons te informeren over de regeneratieve respons op de crypteschaal. Naast ruimtelijke controle maakt laserablatie het ook mogelijk om het begin van schade nauwkeurig te timen, naast het in beeld brengen van hetzelfde orgaan onder zowel homeostatische als regenererende omstandigheden in dezelfde muis, waardoor de precisie van eerdere letselmodellen wordt overtroffen.

De toepassing van laserablatie en repetitieve intravitale beeldvorming kan worden gebruikt als een platform voor een veelheid aan onderzoeksvragen en diverse wetenschappelijke gebieden die regeneratie, immunologie en kankeronderzoek omvatten.