Name: Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Leer CRISPR-manipulatie van muizenplacenta via injectie en elektroporatie op embryodag 12.5. Deze methode maakt tijdsspecifieke genexpressieveranderingen mogelijk voor onderzoek naar placentaontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen de volgende financieringsbronnen: R01 MH122435, NIH T32GM008629 en NIH T32GM145441. De auteurs bedanken Dr. Val Sheffield en Dr. Calvin Carter's laboratoria aan de Universiteit van Iowa voor het gebruik van hun operatiekamer en apparatuur, evenals Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan en Dr. Matthew Weber voor hun hulp bij microscopie. De auteurs bedanken ook Dr. Sara Maurer, Maya Evans en Sreelekha Kundu voor hun hulp bij de pilootoperaties.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met en in overeenstemming met de federale regelgeving en het beleid van de Universiteit van Iowa en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dieren en veehouderij
<ol><li>Houd de dieren in een daglichtcyclus van 12 uur met voedsel en water ad libitum.</li>
	<li>Gebruik CD-1 vrouwelijke muizen in de leeftijd van 8-15 weken. Gebruik de aanwezigheid van een copulatorische plug om E0.5 te identificeren.</li>
	<li>Op E0.5, afzonderlijk huisvesten de zwangere moederdieren.</li>
</ol>2. Kalibratie van de micropipette
OPMERKING: De kalibratie van de micropipette moet indien mogelijk vóór de operatie worden uitgevoerd.
<ol><li>Voordat u de micropipet maakt en kalibreert, verdunt u alle plasmiden tot de aanbevolen concentratie (0,1 μg/μL) in DNasevrij water. Meng het plasmide met de juiste verdunde Fast Green-kleurstof (1 μg/μL in PBS) (uiteindelijke plasmideconcentratie: 0,06 μg/μL).</li>
	<li>Trek micropipettes met behulp van glazen haarvaten van 10 cm met een buitendiameter van 1,5 mm en een binnendiameter van 0,86 mm met een micropipettrekker.</li>
	<li>Breek de punt van een micropipette (2-3 mm) voorzichtig af met een steriele tang.</li>
	<li>Laad de micropipette in een microcapillaire punt die aan een micro-injector is bevestigd. Zorg ervoor dat de micro-injector is bevestigd aan de micro-injectiemachine en dat er voldoende stikstofniveaus zijn om de micropipet te kalibreren.</li>
	<li>Zodra de micropipette aan de micro-injector is bevestigd, laadt u deze met de Fast Green-kleurstofoplossing om de kalibratie uit te voeren (1 μg / μL in PBS). Kalibreer de micropipette om een volume van ongeveer 3,5 μl te injecteren. Leeg ("helder") de micropipette ter voorbereiding op het laden van de plasmide-oplossingen zoals hieronder. OPMERKING: Elke micropipette zal iets anders zijn. Om beschadiging van de placenta tijdens de injectie te voorkomen, moet de injectietijd worden ingesteld tussen 0,5-1,5 s. De druk moet worden ingesteld tussen 1-8,5 psi. Kalibreer elke micropipette afzonderlijk; Als de micropipette niet binnen deze parameters kan worden gekalibreerd, mag deze niet worden gebruikt.</li>
</ol>3. Chirurgie (figuur 1A)
OPMERKING: Om zich voor te bereiden, reinigt u de oppervlakken van zowel het preparaat als de chirurgische gebieden met 70% ethanol. Plaats een absorberende onderlaag in de bereidingsruimte. Plaats in het operatiegebied een verwarmingskussen naar beneden en plaats hier vervolgens een absorberende onderlegger op. Steriliseer alle hulpmiddelen voorafgaand aan de operatie. De tijd dat de moeder onder narcose is, moet minder dan 1 uur zijn.
<ol><li>Verdoving<ol><li>Dien 5 mg/kg NSAID (meloxicam) of een ander goedgekeurd analgeticum toe aan de zwangere moeder 30 minuten tot 1 uur vóór de operatie.</li>
		<li>Plaats de zwangere dam in een inductiekamer die is bevestigd aan een isofluraan vaporizer.</li>
		<li>Stel de vaporizer in op 4% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof.</li>
		<li>Zodra de verdoving is bevestigd door het gebrek aan reactie op een teenknijp en een verminderde ademhalingssnelheid, verwijdert u de dam van de inductiekamer naar het voorbereidingsgebied.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de operatie<ol><li>Plaats in het voorbereidingsgebied de damrug met een neuskegel.</li>
		<li>Verlaag de vaporizer tot 2% isofluraan en 3,5 L/min zuurstof terwijl de dam in de neuskegel zit.</li>
		<li>Scheer de buik van de moeder grondig en verwijder overtollige vacht. Breng de geschoren buik afwisselend driemaal met povidonoplossing en 70% ethanol met steriele applicatoren met katoenpunt. Breng de laatste laag povidon-oplossing aan. Om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen, plaatst u kunstmatige traangel over beide ogen van de dam (figuur 2A, B).</li>
		<li>Verplaats na de voorbereiding de dam met de neuskegel naar het aangewezen operatiegebied.</li>
	</ol></li>
	<li>Baarmoederlaparotomie OPMERKING: Gebruik steriele handschoenen tijdens de chirurgische ingreep. Vervang de handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.<ol><li>Plaats in het operatiegebied de damrug en zet de neuskegel op zijn plaats met tape. Zet het verwarmingskussen onder het absorberende kussen op 45 °C.</li>
		<li>Maak met behulp van een tang en een schaar een incisie van ongeveer 2 cm middellijn door de huid. Gebruik een tang om de huid te tenten en maak een verticale incisie in de huid. Maak hierna nog een incisie van vergelijkbare grootte door het peritoneum om de baarmoederhoorns bloot te leggen. Gebruik een tang om het buikvlies te tenten terwijl u de verticale incisie maakt (figuur 2C, D). OPMERKING: Het niet goed tenten tijdens het insnijden van het buikvlies kan leiden tot een fatale incisie van de darmen.</li>
		<li>Masseer de baarmoederhoorns zachtjes door de incisie door op de zijkanten van de buik te drukken. Doe dit door de baarmoeder zorgvuldig te begeleiden zonder gereedschap, met alleen vingers om onbedoeld letsel te voorkomen. Plaats de blootgestelde baarmoeder bovenop een steriel chirurgisch gordijn dat de buik van de moeder bedekt en houd het vochtig tijdens de operatie met druppels steriele zoutoplossing, die vóór gebruik naar behoefte kunnen worden verwarmd tot 30 °C (figuur 2E, F). OPMERKING: De baarmoederhoorns kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven in Wang et al.27.</li>
		<li>Zodra de baarmoeder is blootgesteld, selecteert u drie paar placenta's voor manipulatie. OPMERKING: De placenta's kunnen worden geïdentificeerd zoals beschreven door Elmore et al.24. Om de overleving van de embryo's te maximaliseren, mogen niet meer dan 6 placenta's worden behandeld. Als er minder dan 12 embryo's aanwezig zijn, mogen niet meer dan 4 placenta's worden geïnjecteerd. Selecteer twee aangrenzende placenta's zodat de ene een controle-injectie krijgt en de andere het experimentele plasmide. Het gebruik van twee aangrenzende placenta's zorgt voor een betere vergelijking van placenta's op vergelijkbare locaties in de baarmoeder en maakt ook een verhoogde overlevingskans mogelijk. De geselecteerde placentaparen worden willekeurig gekozen en verdeeld over beide baarmoederhoorns (figuur 1B).</li>
		<li>Noteer de locatie van placentamanipulaties en organisatie van de embryo's in de baarmoederhoorns, zodat de embryo's en placenta's tijdens het verzamelen kunnen worden geïdentificeerd, omdat één moeder zowel controle- als experimenteel behandelde placenta's / embryo's zal dragen.</li>
	</ol></li>
	<li>Placenta-injectie en elektroporatie van het controleplasmide OPMERKING: Om een aseptische techniek te behouden, steriliseert u de elektroporatiepeddels en micro-injector vóór gebruik met een koud sterilismiddel. Vervang handschoenen als er contact komt met een niet-steriel oppervlak.<ol><li>Laad met behulp van de gekalibreerde micropipet een voldoende hoeveelheid van het juiste controleplasmide voor drie injecties. Voer alle injecties uit op een diepte van ~ 0,5 mm zijdelings in de placenta tussen de decidua (wit) en de junctionele zone (donkerrood) (figuur 3A-F).</li>
		<li>Voer injecties uit in de drie controleplacenta's. OPMERKING: Voer alle controleplasmide-injecties uit voorafgaand aan de experimentele injecties om kruisbesmetting van de plasmiden met de micropipet te voorkomen. Hierdoor kan dezelfde micropipette worden gebruikt, omdat het veranderen van micropipetten en kalibratietijd de operatietijd drastisch verhoogt en de overleving van de moeder vermindert.</li>
		<li>Voer elektroporatie uit van de controleplasmide-geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie.</li>
		<li>Gebruik voor elektroporatie een paar peddels van 3 mm die aan een elektroporatiemachine zijn bevestigd. Om de efficiëntie van CRISPR-opname en de levensvatbaarheid van embryo's te garanderen, gebruikt u de volgende elektroporatie-instellingen: 2 pulsen, 30 V, 30 ms puls, 970 ms puls uit, unipolair.</li>
		<li>Na injectie, maar onmiddellijk voorafgaand aan elektroporatie, bedek de plaatsen van contact met steriele zoutoplossing en breng de zoutoplossing precies aan op de drie plaatsen op de baarmoederwand en de peddels met een druppelaar of spuit.</li>
		<li>Druk zachtjes op de elektroporatiepeddels aan de zijkanten van de placenta. Plaats de anodepeddel over de injectieplaats en de kathode recht tegenover elkaar (figuur 4A-C).</li>
		<li>Druk op de puls op de elektroporatiemachine en wacht tot de twee pulsen zijn voltooid voordat u de elektroporatiepeddels verwijdert. OPMERKING: Een kleine hoeveelheid wit schuim wordt vaak gezien tussen de peddels en placenta tijdens pulsen. Als dit niet gebeurt, controleer dan de spanning van de peddels met een voltmeter voor verder gebruik. Als de aflezing op de voltmeter niet overeenkomt met de elektroporatiespanningsinstelling, zijn de peddels niet functioneel.</li>
	</ol></li>
	<li>Placenta-injectie en elektroporatie van het experimentele plasmide<ol><li>Volg dezelfde instructies uit stap 3.4.1. naar stap 3.4.2. met behulp van het experimentele plasmide in plaats van het controleplasmide.</li>
		<li>Voer elektroporatie uit van alle drie de experimentele geïnjecteerde placenta's binnen 2 minuten na de injectie. Dit moet op dezelfde manier worden uitgevoerd als voor degenen die met de controleplasmiden worden geïnjecteerd. Volg stap 3.4.4. naar stap 3.4.7.</li>
	</ol></li>
	<li>Voltooiing van de operatie<ol><li>Zodra de placentamanipulatie is voltooid, masseert u de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte met alleen vingers (figuur 5A).</li>
		<li>Voer eerst dubbelgeknoopte enkele hechtingen uit op de peritoneumlaag met behulp van gecoate en gevlochten oplosbare hechtingen die 45 cm lang zijn met een 13 mm 3/8c naaldlegering. Plaats de hechtingen 2-3 mm uit elkaar (figuur 5B).</li>
		<li>Na het hechten van de peritoneumlaag, hecht u de huid met oplosbare hechtingen. Drievoudige knoop de enkele hecht 2-3 mm uit elkaar om ervoor te zorgen dat de dam de hechting niet ongedaan kan maken (figuur 5C).</li>
		<li>Zodra het hechten is voltooid, stelt u de isofluraan in op 1% en de zuurstof op 3,5 l/min en brengt u weefsellijm aan op de hechtingen op de huid (figuur 5D). OPMERKING: Weefsellijm is optioneel, maar wordt aanbevolen om te voorkomen dat de incisie opnieuw wordt geopend als gevolg van damkauwen.</li>
		<li>Wanneer de weefsellijm is opgedroogd, schakelt u de verdamper uit en verwijdert u de dam uit het operatiegebied. Plaats de dam in een ondersteunende kooi op zijn rug.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Postoperatieve zorg en monitoring
<ol><li>Laat de zwangere moeder herstellen in een schone kooi onder toezicht gedurende minimaal 30 minuten om ervoor te zorgen dat er geen onmiddellijke complicaties van de operatie optreden. Observeer totdat het volledig ambulant is en zonder hulp op zijn voeten kan draaien. Afzonderlijk huisvesten van de dam na de operatie.</li>
	<li>Volg de institutionele postoperatieve zorg en monitoring tot het verzamelen van embryo's. Noteer het damgewicht en controleer dagelijks de hechtingen en de incisieplaats.</li>
</ol>5. E14.5 placentale verzameling
<ol><li>Op E14.5, verdoof de dam diep met een ketamine / xylazine cocktail (1 mg / ml ketamine en 0, 1 mg / ml xylazine), en vervolgens cervisch ontwrichten van de dam.</li>
	<li>Maak een V-vormige incisie in de buik van de dam met een schaar en verwijder de baarmoeder. Plaats direct op een petrischaal van 5 cm op ijs. Verwijder met een tang voorzichtig het embryo en de bijbehorende placenta uit de baarmoeder. OPMERKING: Houd een register bij van de embryolocatie en de bijbehorende placenta in de baarmoederhoorns om te bepalen welke de directe manipulatie tijdens de operatie heeft ontvangen.</li>
	<li>Noteer de placentagewichten. Gebruik een RNAse-vrije tang en scheermesjes om de placenta in tweeën te snijden langs de middellijn. Doe de helft in 4% PFA bij 4 °C. Snijd de resterende helft opnieuw doormidden en bewaar de resterende twee kwarten bij −80 °C in twee buisjes, waarvan één met RNA-opslagreagens. OPMERKING: Embryo's en andere maternale weefsels kunnen uit de collectie worden bewaard bij −80 °C voor toekomstig gebruik.</li>
</ol>6. Placenta-genexpressieanalyse
<ol><li>Gebruik het kwart van de placenta dat is opgeslagen bij −80 °C in RNA-opslagreagens.</li>
	<li>Verwerk de placenta's voor qPCR zoals beschreven in Elser et al. met behulp van de Trizol-methode voor RNA-isolatie, een spectrofotometer voor RNA-concentratie, een cDNA-synthesekit en qPCR met SYBR Green Master Mix28. In plaats van de Turbo DNAfree-kit DNAse waarnaar wordt verwezen in Elser et al., gebruikt u een RNAcleanup-kit na de Trizol RNA-isolatie om ervoor te zorgen dat de monsters geen verontreinigingen bevatten28. OPMERKING: Lees het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor Trizol en gebruik het in een chemische zuurkast.</li>
	<li>Beoordeel de plasmide-insertie van het controleplasmide met GFP-primers en van het experimentele plasmide met BLAST-primers (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de CT-waarde om de aanwezigheid van het plasmide te bepalen. OPMERKING: CT-waarden boven 35 zijn vals-positieven en alleen die onder 35 moeten worden beschouwd als een positieve indicator dat het plasmide met succes is ingebracht.</li>
	<li>Beoordeel IGF-1 placenta-expressie genormaliseerd naar het huishoudgen 18s (primers vermeld in aanvullende tabel 1). Gebruik de ddCT-methode om de vouwverandering te berekenen en bereken vervolgens de genormaliseerde vouwverandering van de experimentele monsters naar de gemiddelde vouwverandering van de controlemonsters.</li>
</ol>7. Analyse van het placenta-eiwitgehalte
<ol><li>Gebruik het kwart van de placenta dat is bewaard bij −80 °C. Homogeniseer het weefsel in een bufferoplossing gemaakt van 11,5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl 2 en 10 mM proteaseremmer in diH2 O met een uiteindelijke pH van 7,4. Gebruik een draagbare homogenisator en stamper om het weefsel te breken. OPMERKING: Het monster mag niet groter zijn dan 10% van het volume van de buffer.</li>
	<li>Verdun de gehomogeniseerde monsters in de buffer op 1:12, zodat ze binnen het detecteerbare bereik van een bicinchoninic acid assay (BCA) kit liggen. Voer de BCA-test uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer het totale eiwit met behulp van een plaatlezer.</li>
	<li>Na het uitvoeren van de BCA-test, normaliseer alle monsters tot dezelfde totale eiwitconcentratie van 2 mg / ml voor de IGF-1 ELISA, zoals gedaan in Gumusoglu et al.29.</li>
	<li>Voer de IGF-1 ELISA uit volgens de instructies van de fabrikant en kwantificeer de IGF-1-eiwitniveaus met een plaatlezer met behulp van een standaardconcentratiecurve.</li>
</ol>8. Ruimtelijke CRIPSR-verificatie met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie-etikettering
<ol><li>Nadat de placentahelften gedurende 1-3 dagen op de juiste manier zijn gefixeerd in 4% PFA bij 4 °C, verplaatst u ze in 20% sucrose bij 4 °C voordat u ze invriest in een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding.</li>
	<li>Snijd de oct-ingebedde placentahelften in een cryostaat van −20 °C serieel in secties van 10 μm en plaats ze op dia's die moeten worden geëtiketteerd. Snijd de placentahelften zodat alle drie de subregio's zichtbaar zijn. Bewaar de dia's bij −80 °C tot gebruik voor in situ hybridisatie.</li>
	<li>Voer fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) etikettering uit volgens de protocollen van de fabrikant. Hybridiseer één dia met een dCas9-3xNLS-VP64 sonde en een tweede "zuster" dia van dezelfde placenta met een Prl8a8 sonde. OPMERKING: De dCas9-3xNLS-VP64 sonde detecteert de aanwezigheid van het overexpressieplasmide. De Prl8a8-sonde markeert spongiotrofoblasten van de junctionele zone, waardoor de subregio's van de placenta kunnen worden geïdentificeerd. Deze twee sondes zijn gelabeld op afzonderlijke "zuster" -dia's om interferentie van meerkanaalsfluorescentie met de groene autofluorescentie in de placenta's te voorkomen.</li>
	<li>Label beide sondes met de detectiekleurstof (Opal 620). Nadat u het protocol van de fabrikant voor FISH hebt voltooid, brengt u DAPI-montagemedium aan en plaatst u een afdekplaat op de dia. Sluit de coverslip af met doorzichtige nagellak.</li>
	<li>Beeld de dia's af op een rechtopstaande samengestelde fluorescentiemicroscoop en verwerk ze met behulp van een geschikte beeldverwerkingssoftware. Hier werd de CellSens software gebruikt.</li>
</ol>

<ol><li>Cross, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+development+and+evolution+of+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).</li>
<li>Perez-Garcia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placentation+defects+are+highly+prevalent+in+embryonic+lethal+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants.</a> Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).</li>
<li>Rosenfeld, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta-brain-axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">The placenta-brain-axis.</a> Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).</li>
<li>Maslen, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+placenta-heart+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in placenta-heart interactions.</a> Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).</li>
<li>Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+horizons+for+neurodevelopmental+disorders%3A+Placental+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms.</a> Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).</li>
<li>Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+placental+development+and+its+impact+on+fetal+growth-new+insights+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).</li>
<li>Goeden, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Inflammation+disrupts+fetal+neurodevelopment+via+increased+placental+output+of+serotonin+to+the+fetal+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain.</a> Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).</li>
<li>vander Bom, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+changing+epidemiology+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The changing epidemiology of congenital heart disease.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).</li>
<li>Wilson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+commonly+expressed+genes+between+first+trimester+fetal+heart+and+placenta+cell+types+in+the+context+of+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).</li>
<li>Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Genetic+manipulation+of+the+rodent+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Review: Genetic manipulation of the rodent placenta.</a> Placenta. 32, S130-S135 (2011).</li>
<li>Wenzel, P. L., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cre+recombinase+in+early+diploid+trophoblast+cells+of+the+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta.</a> Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).</li>
<li>Zhou, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+Cre+recombinase+provokes+placental-specific+DNA+recombination+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice.</a> PLoS One. 7 (2), e29236(2012).</li>
<li>Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+platelet-derived+growth+factor+receptor+alpha+promoter-directed+expression+of+cre+recombinase+in+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta.</a> Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).</li>
<li>Nadeau, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Map2k1+and+Map2k2+genes+contribute+to+the+normal+development+of+syncytiotrophoblasts+during+placentation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation.</a> Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).</li>
<li>Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+trophoblast-specific+genetic+manipulation+using+lentiviral+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22BioProtocol%22%5BJournal%5D)">Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery.</a> BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).</li>
<li>Okada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementation+of+placental+defects+and+embryonic+lethality+by+trophoblast-specific+lentiviral+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer.</a> Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).</li>
<li>Lecuyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+placental+marker+of+fetal+brain+defects+after+in+utero+alcohol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).</li>
<li>Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+placental+gene+transfer+of+IGF-1+corrects+placental+insufficiency+via+enhanced+placental+glucose+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms.</a> PLoS One. 8 (9), e74632(2013).</li>
<li>Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid+transporters+by+adenoviral-mediated+human+insulin-like+growth+factor-1+in+a+mouse+model+of+placental+insufficiency+in+vivo+and+the+human+trophoblast+line+BeWo+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro.</a> Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).</li>
<li>Song, A. J., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+avoiding+problems+when+using+the+Cre-lox+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system.</a> Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).</li>
<li>Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosafety+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Biosafety of adenoviral vectors.</a> Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).</li>
<li>Evers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+knockout+screening+outperforms+shRNA+and+CRISPRi+in+identifying+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes.</a> Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).</li>
<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+development%3A+Lessons+from+mouse+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Placental development: Lessons from mouse mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li>
<li>Elmore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+atlas+of+the+developing+mouse+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histology atlas of the developing mouse placenta.</a> Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).</li>
<li>Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+phenotype+and+the+insulin-like+growth+factors%3A+Resource+allocation+to+fetal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth.</a> The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).</li>
<li>Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-like+growth+factors+in+embryonic+and+fetal+growth+and+skeletal+development+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review).</a> Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).</li>
<li>Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+to+the+developing+mouse+inner+ear+by+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).</li>
<li>Elser, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+maternal+exposure+to+cypermethrin+and+stress+affect+embryonic+brain+and+placental+outcomes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice.</a> Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).</li>
<li>Gumusoglu, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+maternal+interleukin-17+and+autism-related+cortical+gene+expression%2C+neurobiology%2C+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior.</a> Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).</li>
<li>Liu, F., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electric+gene+transfer+to+the+liver+following+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).</li>
<li>Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+genes+via+sonoporation+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Introduction of genes via sonoporation and electroporation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).</li>
<li>Wu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+gene+editing+using+ribonucleoproteins+in+skin+stem+cells+of+recessive+dystrophic+epidermolysis+bullosa+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).</li>
<li>Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakamura%2C+H+%22Electroporation+and+Sonoporation+in+Developmental+Biology%22">Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology</a>. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).</li>
<li>Bond, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+timing+and+coordination+of+neurogenesis+and+astrogenesis+in+developing+mouse+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions.</a> Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).</li>
<li>Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+developmental+events+in+the+early+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Timing of developmental events in the early mouse embryo.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).</li>
<li>Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+trophoblast+cells+and+trophoblast+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).</li>
<li>Mandegar, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+Interference+efficiently+induces+specific+and+reversible+gene+silencing+in+human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs.</a> Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).</li>
<li>Dai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+CRISPRa+screen+identifies+putative+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers.</a> Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).</li>
<li>Ursini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+genomic+risk+scores+and+early+neurodevelopmental+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).</li>
<li>Smajdor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+fetal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Ethics%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in fetal surgery.</a> Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).</li>
<li>Antiel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+challenges+in+the+new+world+of+maternal-fetal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Perinatology%22%5BJournal%5D)">Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery.</a> Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De placenta is een primaire regulator van foetale groei en zoals eerder opgemerkt, kunnen veranderingen in de expressie of functie van placenta-genen de foetale ontwikkeling aanzienlijk beïnvloeden6. Het hier beschreven protocol kan worden gebruikt om een gerichte in vivo CRISPR-manipulatie van de placenta van de muis uit te voeren met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak. Deze techniek zorgt voor een aanzienlijke opbrengst van levensvatbare embryo's en hun bijbehorend...

De placenta is een essentieel orgaan dat betrokken is bij de ontwikkeling van de foetus. De belangrijkste rol van de placenta is om essentiële factoren te bieden en de overdracht van voedingsstoffen en afval van en naar de foetus te reguleren. Zoogdier placenta's zijn samengesteld uit zowel foetaal als maternaal weefsel, die de foetale-maternale interface vormen, en dus de genetica van zowel de moeder als de foetus beïnvloeden functie1. Genetische afwijkingen of verminderde functie van de placenta kunnen de foetale ontwikkeling drastisch veranderen. Eerder werk heeft aangetoond dat placentale genetica en ontwikkeling geassocieerd zijn met de veranderde ontwikkeling van specifieke orgaansystemen bij de foetus. Met name afwijkingen in de placenta zijn gekoppeld aan veranderingen in de foetale hersenen, het hart en het vasculaire systeem 2,3,4,5.
Het transport van hormonen, groeifactoren en andere moleculen van de placenta naar de foetus speelt een belangrijke rol in de foetale ontwikkeling6. Het is aangetoond dat het veranderen van de placentaproductie van specifieke moleculen de neurologische ontwikkeling kan veranderen. Maternale ontsteking kan de productie van serotonine verhogen door de metabole genexpressie van tryptofaan (TRP) in de placenta te veranderen, wat vervolgens een accumulatie van serotonine in de foetale hersenen creëert7. Andere studies hebben placenta-afwijkingen gevonden naast hartafwijkingen. Afwijkingen in de placenta worden verondersteld bij te dragen aan aangeboren hartafwijkingen, de meest voorkomende geboorteafwijking bij mensen8. Een recente studie heeft verschillende genen geïdentificeerd die vergelijkbare cellulaire routes hebben in zowel de placenta als het hart. Indien verstoord, kunnen deze paden defecten in beide organen veroorzaken9. De defecten in de placenta kunnen aangeboren hartafwijkingen verergeren. De rol van placentale genetica en functie op de ontwikkeling van specifieke foetale orgaansystemen is een opkomend vakgebied.
Muizen hebben hemochoriale placenta's en andere kenmerken van menselijke placenta's, waardoor ze zeer nuttige modellen zijn voor het bestuderen van menselijke ziekten1. Ondanks het belang van de placenta is er momenteel een gebrek aan gerichte in vivo genetische manipulaties. Bovendien zijn er momenteel meer opties beschikbaar voor knock-outs of knockdowns dan overexpressie of gain-of-function-manipulaties in de placenta10. Er zijn verschillende transgene Cre-expressing lijnen voor placenta-specifieke manipulatie, elk in verschillende trofoblastlijnen op verschillende tijdstippen. Deze omvatten Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER en Gcm1-Cre 11,12,13,14. Hoewel deze Cre-transgenen efficiënt zijn, zijn ze mogelijk niet in staat om sommige genen op specifieke tijdstippen te manipuleren. Een andere veelgebruikte methode om placentale genexpressie uit te schakelen of te overexpresseren is het inbrengen van lentivirale vectoren in de blastocystcultuur, die een trofoblastspecifieke genetische manipulatie veroorzaakt15,16. Deze techniek zorgt voor een robuuste verandering in de placenta-genexpressie vroeg in de ontwikkeling. Het gebruik van RNA-interferentie in vivo is schaars gebruikt in de placenta. Het inbrengen van shRNA-plasmiden kan op dezelfde manier worden uitgevoerd als de CRIPSR-techniek die in dit artikel wordt beschreven. Dit is gedaan bij E13.5 om met succes de PlGF-expressie in de placenta te verminderen, met gevolgen voor de hersenvasculatuurvan nakomelingen 17.
Naast technieken die voornamelijk worden gebruikt voor knock-out of knockdown, wordt het induceren van overexpressie vaak uitgevoerd met adenovirussen of het inbrengen van een exogene eiwit. De technieken die worden gebruikt voor overexpressie hebben verschillende succespercentages en zijn meestal later in de zwangerschap uitgevoerd. Om de rol van insuline-achtige groeifactor 1 (IGF-1) in de placentafunctie te onderzoeken, werd een adenoviraal-gemedieerde placentale genoverdracht uitgevoerd om de overexpressie van het IGF-1-gen 18,19 te induceren. Dit werd laat in de dracht van de muis uitgevoerd op E18,5 via directe placenta-injectie. Om extra opties te bieden en mogelijke mislukkingen van gevestigde placentale genetische manipulaties te omzeilen, zoals Cre-Lox-combinatiefouten, de mogelijke toxiciteit van adenovirussen en de off-target effecten van shRNA, kan in vivo directe CRISPR-manipulatie van de placenta worden gebruikt20,21,22. Dit model is ontwikkeld om het gebrek aan overexpressiemodellen aan te pakken en een model met flexibiliteit te creëren.
Deze techniek is gebaseerd op het werk van Lecuyer et al., waarin shRNA- en CRISPR-plasmiden in vivo direct op muis-placenta's werden gericht om de PlGF-expressie te veranderen17. Deze techniek kan worden gebruikt om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-manipulatie op meerdere tijdstippen; voor dit werk is gekozen voor E12.5. De placenta is op dit punt gerijpt en is groot genoeg om te manipuleren, waardoor een specifiek CRISPR-plasmide op E12.5 kan worden ingebracht, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op de foetale ontwikkeling van midden tot laat in de zwangerschap23,24. In tegenstelling tot transgene benaderingen, maar vergelijkbaar met virale inducties of RNA-interferentie, maakt deze techniek overexpressie of knock-out op bepaalde tijdstippen mogelijk met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak, waardoor mogelijke verminderde placentatie of embryonale letaliteit van eerdere veranderingen wordt vermeden. Omdat slechts enkele placenta's het experimentele of controleplasmide in een nest ontvangen, maakt de aanpak twee soorten interne controles mogelijk. Deze controles zijn die geïnjecteerd en geëlektropoeerd met het juiste controleplasmide en die geen directe manipulatie ontvangen. Deze techniek werd geoptimaliseerd om een overexpressie van het IGF-1-gen in de placenta van de muis te creëren via een synergetische activeringsmediator (SAM) CRISPR-plasmide. Het IGF-1-gen werd gekozen, omdat IGF-1 een essentieel groeihormoon is dat aan de foetus wordt afgegeven en dat voornamelijk vóór de geboorte in de placenta wordt geproduceerd25,26. Deze nieuwe placenta-gerichte CRISPR-techniek maakt directe manipulatie mogelijk om het verband tussen de placentafunctie en de foetale ontwikkeling te helpen definiëren.

<table><tbody><tr><td>1.5 ml Tubes</td><td>USA Scientific Inc</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J61899.AP</td><td></td></tr><tr><td>96 Well plate</td><td>Cornings</td><td>3598</td><td>For BCA kit</td></tr><tr><td>Absorbent Underpads</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-206-62</td><td></td></tr><tr><td>Activation Control Plasmid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-437275</td><td>Dnase-free water provided for dilution</td></tr><tr><td>AMV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0277L</td><td>Use for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Anesthetic Gas Vaporizor</td><td>Vetamac</td><td>VAD-601TT</td><td>VAD-compact vaporizer</td></tr><tr><td>Artifical Tear Gel</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-162-35</td><td></td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td>Protein quantification</td></tr><tr><td>Biovortexer</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>198050000</td><td>Hand-held tissue homogenizer</td></tr><tr><td>CellSens Software</td><td>Olympus</td><td>V4.1.1</td><td>Image processing to FISH images.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628168</td><td>Plate centrifuge</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67241-AP</td><td>RNA isolation</td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>ProAdvantage</td><td>77100</td><td>Sterilize before use</td></tr><tr><td>CRISPR/Cas9 Control Plasmid</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-418922</td><td>Dnase-free water provided for dilution</td></tr><tr><td>CryoStat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Microscope</td><td>Leica</td><td>M125 C</td><td>Used for post-necroscopy imaging</td></tr><tr><td>Dissolvable Sutures</td><td>Med Vet International</td><td>J385H</td><td></td></tr><tr><td>Distilled Water</td><td>Gibco</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)</td><td>Thermo fisher Scientific</td><td>14190144</td><td>(-) Calcium; (-) Magnesium</td></tr><tr><td>ECM 830 Electro Electroporator (Electroporation Machine)</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0662</td><td>Generator only</td></tr><tr><td>Electric Razor</td><td>Wahl</td><td>CL9990</td><td>Kent Scientific</td></tr><tr><td>Electroporation paddles/Tweezertrodes</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td>3 mm diameter paddles; wires included</td></tr><tr><td>Embedding Cassette: 250 PK</td><td>Grainger</td><td>21RK94</td><td>Placenta embedding cassettes</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>268280010</td><td></td></tr><tr><td>F-Air Canisters</td><td>Penn Veterinary Supply Inc</td><td>BIC80120</td><td>Excess isoflurane filter</td></tr><tr><td>Fast Green Dye FCF</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td>Dissolve to 1 &mu;g/ml and filter; protect from light</td></tr><tr><td>Filter-based microplate photometer (plate reader)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14377576</td><td>Can be used for BCA and ELISA</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td>Fine tips, straight, serrated</td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillaries - Borosilicate Glass (Micropipette)</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-10</td><td>O.D.: 1.5 mm, I.D.: 0.86 mm, 10 cm length</td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphotase inhibitor cocktail (100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861281</td><td>Protein homogenization buffer</td></tr><tr><td>Heating Pad</td><td>Thermotech</td><td>S766D</td><td>Digitial Moist Heating Pad</td></tr><tr><td>Hemostats</td><td>VWR</td><td>10806-188</td><td>Fully surrated jaw; curved</td></tr><tr><td>Hot Water Bath</td><td>Fisher Scientific</td><td>20253</td><td>Isotemp 205</td></tr><tr><td>Igf-1 SAM Plasmid (m1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-421056-ACT</td><td>Dnase-free water provided for dilution</td></tr><tr><td>Induction Chamber</td><td>Vetamac</td><td>941443</td><td>No specific liter size required</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Limited</td><td>NDC 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>Isoproponal/2-Proponal</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-4</td><td>RNA isolation</td></tr><tr><td>Ketamine HCl 100mg/ml</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-114-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2/Magneisum Chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63069-100ML</td><td>1M. Protein homogenization buffer</td></tr><tr><td>MicroAmp&trade; Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode</td><td>Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>Barcoded plates not required</td></tr><tr><td>Microcapillary Tip</td><td>Eppendorf</td><td>5196082001</td><td>Attached to BTX Microinjector</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0766</td><td>Stainless Steel Pipette Holder, 130 mm Length, for 1 to 1.5 mm Pipettes</td></tr><tr><td>Microject 1000A (Injection Machine)</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0751</td><td>MicroJect 1000A Plus System</td></tr><tr><td>Micropipette Puller Model P-97</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Flaming/Brown type micropipette puller</td></tr><tr><td>Microplate Mixer (Plate Shaker)</td><td>scilogex</td><td>822000049999</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Quantikine ELISA Kit</td><td>R &amp; D Systems</td><td>MG100</td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD - Becton, Dickson, and Company</td><td>305106</td><td>30 Gx 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td></tr><tr><td>Nitrogen Tank</td><td>Linde</td><td>7727-37-9</td><td>Any innert gas</td></tr><tr><td>Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drug (NSAID)</td><td>Norbrook Laboratories Limited</td><td>NDC 55529-040-10</td><td>Analesgic such as Meloxicam</td></tr><tr><td>Nose Cone</td><td>Vetamac</td><td>921609</td><td>9-14 mm</td></tr><tr><td>Opal 620 detection dye</td><td>Akoya Biosciences</td><td>SKU FP1495001KT</td><td>Used for FISH</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Compound</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Tank</td><td>Linde</td><td>7782 - 44 - 7</td><td>Medical grade oxygen</td></tr><tr><td>Pestles</td><td>USA Scientific Inc</td><td>14155390</td><td></td></tr><tr><td>Povidone-Iodine Solution, 5%</td><td>Avrio Health L.P.</td><td>NDC 67618-155-16</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR&trade; Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4367659</td><td>Use for qPCR</td></tr><tr><td>Random Hexamers (Random Primers)</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td>Use for cDNA synthesis</td></tr><tr><td>Razor Blade</td><td>Grainger</td><td>26X080</td><td></td></tr>

muis in vivo placenta-gerichte crispr-manipulatie

Mouse In Vivo Placental Targeted CRISPR Manipulation

De placenta is een essentieel orgaan dat de ontwikkeling van zoogdieren in de baarmoeder reguleert en in stand houdt. De placenta is verantwoordelijk voor de overdracht van voedingsstoffen en afvalstoffen tussen moeder en foetus en de productie en afgifte van groeifactoren en hormonen. Placenta-genetische manipulaties bij muizen zijn van cruciaal belang voor het begrijpen van de specifieke rol van de placenta in de prenatale ontwikkeling. Placenta-specifieke Cre-expressing transgene muizen hebben verschillende effectiviteit, en andere methoden voor placentale genmanipulatie kunnen nuttige alternatieven zijn. Dit artikel beschrijft een techniek om placentale genexpressie direct te veranderen met behulp van CRISPR-genmanipulatie, die kan worden gebruikt om de expressie van gerichte genen te wijzigen. Met behulp van een relatief geavanceerde chirurgische aanpak ondergaan zwangere moederdieren een laparotomie op embryonale dag 12.5 (E12.5) en wordt een CRISPR-plasmide afgeleverd door een glazen micropipette in de individuele placenta's. Het plasmide wordt na elke injectie onmiddellijk geëlektropoeerd. Na damherstel kunnen de placenta's en embryo's zich verder ontwikkelen tot beoordeling op een later tijdstip. De evaluatie van de placenta en nakomelingen na het gebruik van deze techniek kan de rol van tijdspecifieke placentafunctie in de ontwikkeling bepalen. Dit type manipulatie zal een beter begrip mogelijk maken van hoe placentale genetica en functie de foetale groei en ontwikkeling in meerdere ziektecontexten beïnvloeden.

Algemene procedureresultaten (figuur 6) In de studie waren er drie gemanipuleerde groepen. Deze omvatten placenta's geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide (Cas9 Control), een activeringscontrole CRISPR-plasmide (Act Control) of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide (Igf1-OE). De Cas9 Control is beter geschikt voor knock-out plasmiden en de activatiecontrole is beter geschikt voor overexpressie/activatie plasmiden. Om de levensvatb...

Hier beschrijven we een tijdspecifieke methode om kritische ontwikkelingspaden in de placenta van de muis in vivo effectief te manipuleren. Dit wordt uitgevoerd door de injectie en elektroporatie van CRISPR-plasmiden in de placenta's van zwangere moederdieren op embryonale dag 12.5.

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

The placenta is an essential organ that regulates and maintains mammalian development in utero. The placenta is responsible for the transfer of nutrients ...

Dit protocol is belangrijk omdat het tijdspecifieke gerichte manipulatie van muis placenta's met behulp van CRISPR mogelijk maakt. Dit zal onderzoekers in staat stellen om specifieke genfuncties tijdens de midden- tot late zwangerschap op te helderen. Genetische manipulaties die overexpressie in de placenta van de muis veroorzaken, zijn zeer zeldzaam.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een reeks genexpressieveranderingen in de placenta mogelijk maakt. Raak niet ontmoedigd als voorlopige termijnen deze techniek niet succesvol zijn. Omdat deze techniek uitdagend is, kost het nogal wat tijd om te oefenen om onder de knie te krijgen.Om te beginnen, plaats de verdoofde damrug met een neuskegel voor het handhaven van anesthesie in het voorbereidingsgebied. Scheer de buik van de moeder grondig. Om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen, plaatst u kunstmatige traangel over beide ogen van de moeder.Gebruik vervolgens steriele applicatoren met katoenpunt om de chirurgische plaats te desinfecteren met ten minste drie afwisselende rondes van een povidon-jodiumoplossing, gevolgd door 70% ethanol met een laatste laag povidon-jodiumoplossing. Verplaats na de voorbereiding de dam met de neuskegel van de anesthesie naar het aangewezen operatiegebied. Voor de baarmoederlaparotomie plaatst u de damrug op de operatietafel en zet u de neuskegel op zijn plaats met tape.Plaats een verwarmingskussen onder een absorberende pad dat is ingesteld op 45 graden Celsius. Nadat u de anesthesiediepte hebt bevestigd door gebrek aan teenknijpreflux, gebruikt u een tang en een schaar om een incisie van ongeveer twee centimeter middellijn door de tentvormige huid te maken. Maak vervolgens een verticale incisie door het buikvlies met behulp van een steriele tang, voorzichtig weg van de baarmoederhoorns.Masseer beide baarmoederhoorns door met de vingers op beide zijden van de buik te drukken om ze te begeleiden. Plaats de blootgestelde baarmoeder bovenop steriele chirurgische gordijnen die over de onderbuik zijn geplaatst en houd deze indien nodig vochtig met druppels warme steriele zoutoplossing. Zodra de baarmoeder is blootgesteld, selecteert u drie paar placenta's voor manipulatie.Noteer de locatie van placentamanipulaties en de organisatie van de embryo's in de baarmoederhoorns. Voor de placenta-injectie van het controleplasmide laadt u een voldoende hoeveelheid van het juiste controleplasmide voor drie injecties met behulp van een gekalibreerde micropipette. Voer alle injecties uit tussen de decidua en de junctionele zone op een diepte van ongeveer 0,5 millimeter lateraal in de placenta.Na injectie, maar onmiddellijk voorafgaand aan elektroporatie, bedek de plaatsen van contact met steriele zoutoplossing en breng de zoutoplossing precies aan op de drie plaatsen op de baarmoederwand en de peddels met een druppelaar of spuit. Voer binnen twee minuten na injectie elektroporatie uit met behulp van een paar peddels van drie millimeter die aan een elektroporatiemachine zijn bevestigd. Om de efficiëntie van de CRISPR-integratie en de levensvatbaarheid van embryo's te garanderen, stelt u de instellingen in op 30 volt, 30 milliseconde puls, twee pulsen, 970 milliseconde puls uit en unipolair.Druk de elektroporatiepeddels voorzichtig over de baarmoederwanden aan de zijkanten van de placenta. Plaats de anodepeddel over de injectieplaats en de kathode recht tegenover. Druk op de puls op de elektroporatiemachine en wacht tot de twee pulsen zijn voltooid voordat u de elektroporatiepeddels verwijdert.Ga vervolgens verder met placenta-injectie van het experimentele plasmide zoals eerder aangetoond. Voer elektroporatie uit van alle drie de experimentele geïnjecteerde placenta's binnen twee minuten na de injectie zoals uitgevoerd voor de controlegroep. Zodra de placentamanipulatie is voltooid, masseert u de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte met alleen vingers om de baarmoederhoorns direct te manipuleren.Voer onderbroken hechtingen uit op de peritoneumlaag met behulp van 45 centimeter lange gecoate en gevlochten oplosbare hechtingen met een cirkelnaaldlegering van 13 millimeter, drie achtsten. Na het hechten van de peritoneumlaag, hecht u de huid met oplosbare hechtingen met hetzelfde type oplosbare hechtingen die worden gebruikt voor het peritoneum. Zodra het hechten is voltooid, brengt u weefsellijm aan op de hechtingen op de huid.Wanneer de weefsellijm is opgedroogd, schakelt u de verdamper uit en brengt u de dam over van het operatiegebied naar een ondersteunende kooi op de rug. Placenta's werden geïnjecteerd met een algemeen CRISPR Cas9-controleplasmide en activeringscontrole-CRISPR-plasmide of een IGF-1 SAM-activeringsplasmide. De representatieve post-obductiebeelden toonden geen merkbare schade of verandering in het fenotypische uiterlijk in behandelingsgroepen.De overlevingskans van de onbehandelde embryo's in gemanipuleerde nesten daalde tot een gemiddelde van 79,05%, terwijl er een significante afname was in de overleving van de gemanipuleerde embryo's van gemiddeld 55,56%Er was geen significant verschil in het placentagewicht van een groep. Er was geen significant verschil in maternale gewichtstoename onmiddellijk na de operatie in vergelijking met schijnoperaties. Veel zwangere moederdieren vertoonden de dag na de ingreep een lichte afname of geen verandering in gewicht, waarschijnlijk als gevolg van verstoord eten tijdens en kort na de operatie.De meeste moederdieren vertoonden een verhoogd gewicht op E14,5, maar af en toe werd nog steeds een gewichtsafname waargenomen. De qPCR toonde een significante toename in IGF-1-expressie in de IGF-1-overexpressie placenta's versus de controleplacenta's. De ELIZA-beoordeling van de E14.5-placenta's toonde een significante toename van IGF-1-eiwitniveaus in de IGF-1-overexpressie placenta's versus de controleplacenta's.Groene autofluorescentie toonde de subregio's van de placentale maternale foetale interface met rode Cas9-etikettering in alleen de IGF-1-overexpressie placenta, wat wijst op succesvolle CRISPR-opname in alle drie de subregio's van de placenta. De fluorescerende in C2-hybridisatie-etikettering bevestigde de opname van het IGF-1-activeringsplasmide zonder migratie naar onbehandelde placenta's. De deciduale en labyrintzone kon worden geïdentificeerd rond de rode junctionele zone gemarkeerd door Prl8a8-kleuring.Vergeet niet om het manipulatietype en de locatie van placenta's en bijbehorende embryo's vast te leggen. Het vastleggen van de locatie van de baarmoederhals en embryo's in de baarmoederhoorns wordt ten zeerste aanbevolen. Na deze procedure kan analyse van de placenta, het embryo en de moeder worden uitgevoerd.Dit zal een beter begrip mogelijk maken van genen placentale specifieke rollen in zwangerschap, placentafunctie en embryonale ontwikkeling.

mouse-in-vivo-placental-targeted-crispr-manipulation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

De microinjectie van muis oocyten wordt vaak gebruikt voor zowel klassieke transgenese ( dwz de willekeurige integratie van transgenen) en CRISPR-gemedieerde gen targeting. Dit protocol beoordeelt de nieuwste ontwikkelingen in microinjectie, met speciale nadruk op kwaliteitscontrole en genotyping strategieën.

Generatie van genetisch gemodificeerde muizen via de microinjectie van oocyten

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hier beschrijven we een snelle en directe in vivo CRISPR/Cas9 screeningsmethodologie met behulp van echogeleide in utero embryonale lentivirale injecties om tegelijkertijd functies van verschillende genen in de huid en mondholte van immunocompetente muizen te beoordelen.

In Vivo CRISPR/Cas9-screening om tegelijkertijd de genfunctie in de huid en mondholte van de muis te evalueren

In dit protocol beschrijven we hoe de vruchtwaterholte van de muis op E7.5 kan worden geïnjecteerd met lentivirus, wat leidt tot uniforme transductie van de gehele neurale plaat, met minimale schadelijke effecten op overleving of embryonale ontwikkeling.

Murine Neural Plate Targeting door In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) op Embryonale Dag 7.5

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Hier presenteren we een protocol voor het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde muismodellen met behulp van embryonale stamcellen, vooral voor grote DNA knock-in (KI). Dit protocol is afgestemd met behulp van CRISPR / Cas9-genoombewerking, wat resulteert in een aanzienlijk verbeterde KI-efficiëntie in vergelijking met de conventionele homologe recombinatie-gemedieerde lineaire DNA-targetingmethode.

CRISPR/Cas9-gemedieerde zeer efficiënte gentargeting in embryonale stamcellen voor het ontwikkelen van gen-gemanipuleerde muismodellen

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

Leer CRISPR-manipulatie van muizenplacenta via injectie en elektroporatie op embryodag 12.5. Deze methode maakt tijdsspecifieke genexpressieveranderingen mogelijk voor onderzoek naar placentaontwikkeling.

Muis in vivo placenta-gerichte CRISPR-manipulatie

Meer video's verkennen