Efficiënte en consistente generatie van retinale pigmentepitheel / choroïde flatmounts uit menselijke ogen voor histologische analyse

Deze methode helpt om fenotypische verschillen van RP-cellen over het hele menselijke netvlies te begrijpen. De dissectietechniek die Davide Ortolan heeft ontwikkeld is zeer reproduceerbaar in het genereren van een loslating tussen RP en het netvlies. En de REShAPE-software is echt merkbaar in het analyseren van grote afbeeldingen van RP-flat mounts.

De methode die Davide heeft ontwikkeld, kan worden gebruikt om regionale verschillen in het RP-fenotype te bestuderen van patiënten met verschillende soorten retinale degeneratieve ziekten. Snijd om te beginnen de conische buis van 50 milliliter iets onder de 5 millilitermarkering. Bevestig met behulp van hete lijm de buispunt aan de bodem van de weegboot.

Meng vervolgens de twee componenten van de siliconenelastomeerkit in een verhouding van 10 op 1, waardoor lucht niet wordt ingesloten. Giet het mengsel in de weegboot met dit bolvormige stuk van de ronde onderbuis. Laat de siliconen een nacht op kamertemperatuur uitharden.

Verwijder de weegboot en de ronde onderbuis uit de uitgeharde siliconen mal. Vul eerst een spuit van 1 milliliter met 1700 millimol D-Mannitol-oplossing en bevestig deze aan een naald van 21 gauge. Steek de naald door de pars plana om te voorkomen dat de voorste oogkamer wordt doorboord en injecteer 400 microliter van de oplossing in het glasvocht.

Laat het oog 45 minuten op kamertemperatuur staan. Knip met een fijne schaar en tang de voorste kamer open ter hoogte van de pars plana. Vul de achterste oogkamer met DPBS die calcium en magnesium bevatten.

Onder de stereomicroscoop lokaliseer je de macula gevisualiseerd als een gele vlek op het netvlies. Snijd het oog in kwadranten, namelijk nasaal, temporeel, superieur en inferieur, terwijl u ervoor zorgt dat het maculagebied behouden blijft. Verwijder de naalden als ze in de weg zitten.

Breng de vlinder over naar de achterste oogkamer in een petrischaaltje van 100 millimeter met DPBS met calcium en magnesium. Voordat u het netvlies verwijdert, markeert u het bloemblad dat de macula bevat door een V-vormige snede in de ciliaire marge te maken. Til en snijd al het glasvocht dat op het netvlies ligt.

Snijd het netvlies van de ciliaire marges in alle bloemblaadjes om ervoor te zorgen dat de RPE niet krabt. Plaats het weefsel in 4% PFA en incubeer gedurende een uur. Was drie keer met DPBS dat calcium en magnesium bevat.

Breng het weefsel over in een container gevuld met dezelfde buffer en bewaar het bij 4 graden Celsius. Breng het monster vervolgens over naar een petrischaaltje van 100 millimeter met DPBS met calcium en magnesium. Pons de oogzenuwkop uit met een biopsiestoot van 1,5 millimeter.

Verzamel het netvlies en bewaar het in dezelfde buffer bij 4 graden Celsius. Om de sclera uit het RPE-vaatvlies te verwijderen, tilt u de RPE-vaatvlieslaag voorzichtig uit de periferie. Knip vervolgens met een paar Vannas Spring Scissors de choroïdale vaten en het bindweefsel die zich tussen de sclera en de RPE bevinden.

Na volledige scheiding van de sclera, verzamel de RPE-vaatvlieslaag. Breng het weefsel over in een container gevuld met DPBS met calcium en magnesium en bewaar het bij 4 graden Celsius. Breng het RPE-vaatvlies over in een putje van een zesputtenplaat.

Blok en permeabiliseer het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur. Incubeer het monster gedurende één uur bij kamertemperatuur met falloidine geconjugeerd met 647 fluorofoor bij een verdunning van 1 tot 250 in de permeabilisatiebuffer. Was drie keer in DPBS met calcium en magnesium.

Breng het RPE-vaatvliesmonster over op een glasplaat van 50 x 75 millimeter en druk het plat. Snijd elk bloemblad in tweeën om het monster platter te maken. Teken een contour van de platte houder met een hydrofobe pen.

Om de lipofuscine-autofluorescentie te doven, voegt u 500 microliter van de autofluorescentie quencher-oplossing toe en incubeert u gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Was grondig in DPBS met calcium en magnesium. Verwijder de DPBS en voeg het montagemedium toe.

Plaats een afdekglas op de platte houder en sluit af met nagellak. Open de software. Selecteer op het tabblad mappen de invoer- en uitvoermappen.

Laat de software in de uitvoermap automatisch het pad naar de invoermap of het invoerproces wijzigen. U kunt ook de uitvoermap handmatig wijzigen. Als u heatmaps wilt genereren, selecteert u alles in het vervolgkeuzemenu op het tabblad Kleurenafbeeldingen maken.

Vink het vakje nee aan in de functie Handmatige limieten gebruiken om de software de minimum- en maximumwaarden te laten gebruiken die in elke afbeelding zijn gedetecteerd. Schakel het selectievakje ja in om het waardenbereik voor elke vorm metrische heatmap handmatig aan te passen. Klik vervolgens op de knop Limieten instellen en voeg waarden in de tekstvakvakken in om bereiken voor de afzonderlijke parameters te kiezen.

Nadat u de interessante waarden hebt gewijzigd, klikt u op opslaan. Klik op lage standaardwaarden om alle limieten opnieuw in te stellen. Als u een drempelwaarde voor celgrootte in een lagere celgrootte wilt selecteren, voegt u de grootte in van de kleinste cel die in de analyse moet worden opgenomen.

Voeg in de bovenste celgrootte de grootte in van de grootste cel die moet worden opgenomen. Bij het converteren van pixels naar echte eenheden, vinkt u nee aan om de analyse in pixeleenheden uit te voeren, vinkt u ja aan om de analyse in micrometers uit te voeren. Voer bij de lengte van de pixels van de schaalbalk de pixelwaarde in het tekstvak in.

Voer in de lengte van de schaalbalkmicron de overeenkomstige afstand in micrometers in. Om de analyse te starten, druk je erop. Dit protocol resulteert in een single-plane afbeelding van een flat mount waarbij de cellocatie wordt geïdentificeerd door reshape-gegenereerde segmentatie van de RPE-celranden.

Ook worden 30 vormstatistieken, waaronder het celgebied van de afzonderlijke RPE-cellen, gemeten voor elke correct geïdentificeerde RPE-cel. Zwarte tegels die het resultaat zijn van resterende stukjes netvlies of andere heldere objecten kunnen worden verwijderd door een van de filteropties te kiezen die beschikbaar zijn in het vervolgkeuzemenu RT-filter. Het gebruik van RBG-afbeeldingen voor de hervormanalyse zal volledig zwarte binaire afbeeldingen produceren.

Als dit gebeurt, worden de RGB-afbeeldingen geconverteerd naar grijswaarden correct gesegmenteerde binaire afbeeldingen opgeleverd. Als de kleuring niet optimaal is of als het monster wordt beschadigd door een kras, kunnen grote klonten cellen worden geïdentificeerd als een enkele zeer grote cel. In dit geval kunnen grote objecten worden uitgesloten van de analyse door de drempelwaarde voor celgrootte te wijzigen.

Om een plat weefsel te verkrijgen, moeten de RP en het vaatvlies van de sclera worden gescheiden, zelfs als deze stappen lang kunnen duren. Na het genereren van de RP flat mount is het mogelijk om extra RPE markers te beitsen, zodat u verschillende regio's van de RP monolayer kunt bestuderen. Met behulp van deze methode hebben we vijf verschillende RP-populaties ontdekt die differentieel gevoelig zijn voor verschillende retinale degeneratieve ziekten.