Bepaling van thermische limieten voor zoöplankton met behulp van een warmteblok

Naarmate de wereldwijde temperaturen blijven stijgen, zijn het kwantificeren van thermische limieten en de relatie met acclimatisatie en ontogenie van vitaal belang voor het bepalen van de kwetsbaarheid van soorten voor toekomstige opwarming. Voor mariene organismen met een complexe levensgeschiedenis kan het bepalen van thermische limieten logistiek een uitdaging zijn. Dit protocol introduceert een kleine voetafdruk, eenvoudig te bouwen methode om kritische temperaturen van kleine planktonorganismen te schatten.

Hoewel de methode is ontwikkeld voor klein, minder dan een millimeter groot plankton, kan het worden toegepast voor grotere mariene organismen die passen in scintillatieflacons van ongeveer 50 milliliter volume. Begin met het bedraden van de stripverwarmer naar de rheostat. Boor 60 gaten in een raster van zes bij 10 grootte om het aluminium blok van een grootte van 20,3 bij 15,2 bij vijf centimeter voor te bereiden en zorg ervoor dat de gaten twee centimeter van midden naar midden in beide richtingen zijn verdeeld.

Boor twee extra gaten tussen de eerste en tweede kolom en de negende en 10e kolom, passend bij de grootte van de temperatuurregelaarsondes. Om de elementen op hun plaats te houden en het voltooide warmteblok te isoleren, bouwt u een behuizing van heldere acrylplaten en zorgt u ervoor dat u twee lagen aan de achterkant van het verwarmingselement aanbrengt. Breng in de eindassemblage koelpasta aan om de warmtegeleiding van het verwarmingselement in het blok en van het blok naar het koelelement te maximaliseren.

Sluit het waterbad aan op Tygon-buizen en steek de thermostaatsonde in de gaten aan de zijkant van het aluminium blok. Plaats in alle gefreesde gaten 1,5 milliliter microcentrifugebuizen, tot de rand gevuld met leidingwater. Schakel de temperatuurregelaar in en stel de stopverwarmingstemperatuur van sonde één in op 35 tot 37 graden Celsius en sonde twee tot 21,5 tot 22,5 graden Celsius.

Draai de rheostat om het verwarmingselement in te schakelen en zet het op medium. Zet het waterbad aan en stel de temperatuur van de koelmachine in op 15 graden Celsius. Controleer met behulp van een thermokoppel met een elektrode van het K-type de temperatuur in elke microcentrifugebuis elke 10 minuten daarna.

Pas de waarden van de eindpunten aan door de instellingen van de temperatuurregelaar en het waterbad indien nodig te wijzigen. Zet het recirculerende waterbad en de kachel aan en stel ze in op respectievelijk 15 graden Celsius en 37 graden Celsius, om een temperatuurgradiënt van 19,5 graden Celsius tot 37 graden Celsius te genereren. Zodra de microcentrifugebuizen in gefreesde gaten zijn geplaatst en de temperatuur van het warmteblok is bereikt, controleert u de temperatuur in elke microcentrifugebuis met behulp van een thermokoppel met een K-type elektrode.

En noteer deze temperaturen. Vul een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met zeewater, gefilterd door een gaas van 0,45 micrometer. Concentreer de kweek van het onderzoeksorganisme met omgekeerde filtering, zodat de organismen op de bodem van het bekerglas blijven.

Spoel de geconcentreerde cultuur af met gefilterd zeewater en herhaal de omgekeerde filtering nogmaals om het monster te concentreren. Tel de kleine planktonorganismen onder een ontleedmicroscoop en breng een bekend aantal organismen over in halfgevulde microcentrifugebuizen met behulp van een glazen pasteurpipet. Voeg nu gefilterd zeewater toe totdat het uiteindelijke volume in deze buizen een milliliter bereikt.

Plaats deze buizen nu in paren in het verwarmingsblok, beginnend bij het koude uiteinde om de organismen geleidelijk te laten opwarmen tot de gewenste experimentele temperatuur. Wacht 10 minuten en verplaats de paren microcentrifugebuizen naar de aangrenzende geboorde gaten met warmere temperaturen. Plaats extra paar microcentrifugebuizen in elke rij aan het koude uiteinde en blijf ze in paren naar het warmere uiteinde verschuiven.

Zodra het hele blok is gevuld, incubeer het gedurende twee uur op de aangegeven temperatuur. Meet aan het einde van de incubatietijd de temperatuur in elke buis en noteer deze. Breng vervolgens alle buizen over naar de vooraf gelabelde houders en incubeer ze gedurende een uur op een vooraf bepaalde temperatuur om herstel mogelijk te maken.

Voor het opsommen van het levende organismegedeelte, brengt u de inhoud van een individuele microcentrifugebuis over in een petrischaaltje van 35 millimeter met behulp van een glazen pipet. Tel onder een ontleedmicroscoop de levende en dode organismen en noteer de getallen. Het waargenomen aantal organismen moet overeenkomen met het oorspronkelijk genomen organisme.

Als dit niet het geval is, controleer dan de zijkant van de microcentrifugebuizen en petrischaal, Genereer een gegevenstabel in CSV-formaat met de headers die de interessevariabele groeperen, de temperatuur van de buis in graden Celsius, het aantal in leven zijnde personen en het aantal dode personen. Om de gegevens te matchen met een logistische regressie, gebruikt u een gegeneraliseerd lineair model met een binomiale verdeling. Als u het model wilt uitvoeren, typt u source en gebruikt u het R-bestand modelloop.r.

Bereken de predictorwaarden waarbij 50% van de individuen overleefde, om de mediane bovenste thermische limiet te bepalen. Met behulp van dit protocol werd de overleving van larvale zanddollars gemeten, die over een temperatuurbereik van 19 tot 37 graden Celsius was, twee, vier en zes dagen na de bevruchting. Naarmate larvale zanddollars zich ontwikkelden, steeg de bovenste thermische limiet van 28,6 graden Celsius twee dagen na de bevruchting, tot 28,8 graden Celsius op vier dagen na de bevruchting en ongeveer 29 graden Celsius op zes dagen na de bevruchting.

Incubatie- en hersteltijden zijn soortspecifiek. Het is belangrijk om een voorlopige test uit te voeren om ervoor te zorgen dat de geselecteerde timing een betrouwbare schatting van leven versus dood oplevert.