Name: In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Leer in vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen. Deze methode kwantificeert myeline en onderzoekt axon-Schwann-celinteracties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Prof. Dr. Ralf Gold en PD Dr. Gisa Ellrichmann voor hun advies en steun.

Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschappen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.
1. Schwann celkweek
<ol><li>Coating voor Schwann celkweek<ol><li>Bedek de celkweekschalen onder steriele omstandigheden. Breng 2 ml 0,01% poly-L-lysine (PLL) aan op twee weefselkweekschalen (TC) van 60 mm en incubeer een nacht bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder de PLL, was de TC-vaat 2x met gedestilleerd water en incubeer met 2 ml 1 μg/cm2 laminine een nacht op 4 °C. Was de TC vaat 2x met aqua dest, en laat de borden aan de lucht drogen.</li>
	</ol></li>
	<li>Medium voorbereiding voor Schwann celkweek<ol><li>Bereid 50 ml Schwann-celmedium door 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 2 μM forskoline, 10 nM neureguline en 50 μg / ml gentamycine toe te voegen aan Dulbecco's Modified Eagle′s Medium (DMEM) / F-12 (hoge glucose) onder steriele omstandigheden.</li>
		<li>Bereid 70 ml Leibovitz L-15 medium met 50 μg/ml gentamycine onder steriele omstandigheden.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van de heupzenuw OPMERKING: Alle heupzenuwvoorbereidingsstappen worden uitgevoerd onder een schone bank.<ol><li>Bereid één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoude Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder Ca 2+ en Mg2+, één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoud L-15-medium van Leibovitz en één TC-schaal van 100 mm met 5 ml ijskoud Leibovitz's L-15-medium en 50 μg/ml gentamycine.</li>
		<li>Reinig alle instrumenten door autoclaveren. Spuit de instrumenten en het werkgebied met 70% ethanol.</li>
		<li>Euthanaseer vijf 3 weken oude mannelijke Sprague Dawley-ratten met behulp van CO 2-inhalatie en onthoofding. Spuit de romp van de rat in met 70% ethanol.</li>
		<li>Open de dorsale linkerondermaat met een schaar en verwijder voorzichtig de biceps femoris-spier. Maak de heupzenuw los door een gladde verhoging met een gebogen tang, zodat de zenuw niet wordt gekneusd.</li>
		<li>Houd het meest proximale deel van de zenuw vast met de gebogen tang om de zenuw recht te maken en klem de zenuw zo hoog mogelijk met een schaar. Knip vervolgens de zenuw dicht bij de sacrale plexus en de poot met een schaar. Herhaal stap 1.3.4-1.3.5 voor de rechterkant. OPMERKING: Zorg er bij het openen van de ledemaat voor dat u geen bloedvaten kneust.</li>
		<li>Plaats met een tang de linker- en rechterheupzenuwen in een TC-schaal van 100 mm met ijskoude DPBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Heupzenuw revisie<ol><li>Gebruik een tang om alle zenuwen over te brengen naar een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium en 50 μg / ml gentamycine. Blijf een stereomicroscoop gebruiken en verwijder vet, spieren en bloedvaten uit de zenuwen met twee paar fijne tangen. Pak de zenuwen vast met een tang en breng ze over op een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium.</li>
		<li>Identificeer de proximale en distale uiteinden van de heupzenuw. Verwijder het epineurium met één paar fijne tangen in een proximale tot distale richting, terwijl u het proximale zenuwuiteinde vasthoudt met het tweede paar fijne tangen.</li>
		<li>Breng de gezuiverde zenuwen over in een 100 mm TC-schaal met ijskoud Leibovitz's L-15 medium en 50 μg / ml gentamycine. Plaag de geïsoleerde zenuw fascikels om enkele zenuwvezels te scheiden en te isoleren met behulp van twee paar fijne tangen.</li>
		<li>Breng de zenuwvezels over in een buis van 50 ml met behulp van een serologische pipet van 10 ml en neem zo min mogelijk medium op. Voeg 50 ml Leibovitz's L-15 medium met 50 μg/ml gentamycine toe aan de zenuwvezels en sla een paar keer in de buis van 50 ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Enzymatische vertering van de heupzenuw OPMERKING: De volgende stappen (stappen 1.5-1.8, 2.1 en 2.2) worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.<ol><li>Bereid de enzymatische verteringsoplossing met 0,25% dispase II, 0,05% type I collagenase en 50 μg/ml gentamycine in 10 ml DMEM (hoge glucose).</li>
		<li>Centrifugeer de buis op 188 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant met een serologische pipet van 25 ml en breng de pellet met het resterende L-15-medium van Leibovitz over in een TC-schaal van 60 mm met behulp van een pipet van 1.000 ml.</li>
		<li>Spoel de buis van 50 ml met 10 ml van de enzymatische spijsverteringsoplossing en voeg deze toe aan de schaal met de zenuwvezels. Verdeel het weefsel in de schaal voorzichtig met de punt van een pipet om het toegankelijke oppervlak voor de spijsvertering te maximaliseren.</li>
		<li>Incubeer bij 37 °C en 5% CO 2 gedurende 18 uur en stop de vertering door 10 ml 40% FCS toe te voegen aan de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks, zonder Ca2 en Mg2+ (HBSS).</li>
	</ol></li>
	<li>Celscheiding<ol><li>Breng de verteerde zenuwen over in een buis van 50 ml met behulp van een serologische pipet en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 188 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 10 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine. Resuspensie van de pellet 20 keer vervolgensuspensie, met behulp van een pipetpunt van 10 ml, 5 ml, 2 ml, 1 ml en 200 μl.</li>
		<li>Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 100 μm en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 188 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet met 4 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine.</li>
		<li>Voeg 2 ml van de celsuspensie toe aan elk van de twee PLL- en laminine-gecoate 60 mm TC-schalen en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Laat de platen 2 dagen onaangeroerd in de incubator om de cellen te beschermen tegen mechanische stress en om de hechting te ondersteunen.</li>
	</ol></li>
	<li>Schwann cel differentiatie<ol><li>Verwijder na 2 dagen het medium en spoel de platen voorzichtig 2x af met DMEM (hoge glucose), 10% FCS en 50 μg/ml gentamycine. Voeg daarna 2 ml Schwann-celmedium toe. Vervang het Schwann-celmedium elke 2edag en observeer het uiterlijk en de samenvloeiing van de cel met een microscoop. OPMERKING: Schwann-cellen en DRG-explantaten moeten op een tijdige, gecoördineerde manier worden voorbereid voor de cocultuur. Zorg ervoor dat een rat met embryo's op E 13,5 beschikbaar is voor DRG-preparaat wanneer de Schwann-cellen dicht bij een samenvloeiing van 80% liggen.</li>
	</ol></li>
	<li>Celtrypsinisatie en magnetische scheiding OPMERKING: Voor voorbeeldige foto's van verschillende Schwann-celkweekstadia, zie aanvullende figuur 1.<ol><li>Wanneer de cellen een samenvloeiing van ongeveer 80% (6-12 dagen cultuur) bereiken, wast u de platen zorgvuldig 2x met 3 ml DPBS en incubeert u met 2 ml 0,05% Trypsine / EDTA (voorverwarmd tot 37 ° C) gedurende 3 minuten. Wanneer de cellen loskomen van de bodem van de plaat, inactiveer dan de spijsvertering door de toevoeging van 2 ml DMEM met 10% FCS en 50 μg / ml gentamycine. OPMERKING: Houd je aan een trypsinisatietijd van strikt 3 minuten en ga daarna snel te werk.</li>
		<li>Resuspendie van de celpellet in 2 ml magnetische celscheidingsbuffer met DPBS met 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 nM EDTA. Combineer 10 μL van de celsuspensie met 10 μL trypan blauw en tel de cellen met behulp van een kleurkamer.</li>
		<li>Centrifugeer de celsuspensie bij 188 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en resuspensie van de celkorrel in 90 μL magnetische celscheidingsbuffer per 1 x 107 cellen. Voeg 10 μL Thy-1 microbeads per 1 x 107 cellen toe. Suspendien de oplossing een paar keer en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 8 °C.</li>
		<li>Voeg 2 ml van de magnetische celscheidingsbuffer toe aan de celsuspensie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g . Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 500 μL magnetische celscheidingsbuffer.</li>
		<li>Bevochtig de magnetische celscheidingskolom met 1 ml van de magnetische celscheidingsbuffer. Plaats de magnetische celscheidingskolom in de magnetische celscheider. Breng de cellen aan op de magnetische celscheidingskolom. Verzamel de doorstroom en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. OPMERKING: Fibroblasten worden positief geselecteerd en blijven in de kolom, terwijl Schwann-cellen de kolom passeren. Fibroblasten kunnen worden verzameld met een stempel (bijvoorbeeld als een negatieve controle voor Schwann-celkleuringsprotocollen).</li>
		<li>Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 1 ml van het cocultuurmedium (zie stap 3.1.1). Tel de cellen na het kleuren met trypan blauw en een kleurkamer.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DRG explantatie cultuur
<ol><li>DRG groeimedium voorbereiding<ol><li>Bereid DRG-groeimedium voor door 2% B27, 2% paardenserum, 1% L-glutamine, 0,5% penicilline / streptomycine en 10 ng / ml zenuwgroeifactor (NGF) toe te voegen aan het neurobasale medium. Bewaar het groeimedium bij 4 °C. OPMERKING: Het groeimedium kan gedurende 2 dagen worden gebruikt.</li>
	</ol></li>
	<li>Coating voor DRG explants<ol><li>Incubeer de afdekstroken in 70% ethanol gedurende 1 uur en plaats ze in de putjes van 4-well schalen met behulp van een gebogen tang. Nadat de ethanol is opgedroogd, breng 300 μL van 0,2 mg / ml poly-D-lysine (PDL) per put aan en incubeer 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Was de coverslips 3x gedurende 5 min elk met DPBS achter elkaar. Verwijder de DPBS, breng 300 μL 1 μg/ml laminine aan op de coverslips en incubeer 's nachts bij 37 °C en 5% CO2.</li>
		<li>Vervang na drie wasstappen met DPBS gedurende 5 minuten de DPBS door 190 μL DRG-groeimedium. Plaats de 4-putplaten in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG-voorbereiding OPMERKING: Oogst de DRG van embryonale ratten onder een schone bank.<ol><li>Reinig voor de bereiding alle instrumenten met 70% ethanol. Vul 10 (twee per embryo) 35 mm TC-schalen met 2 ml ijskoude HBSS per schaal en twee 100 mm TC-schalen met 5 ml ijskoude HBSS per gerecht.</li>
		<li>Euthanaseer de zwangere ratten (volwassen vrouwelijke Sprague Dawley-ratten, E13.5) door CO 2-inademing en onthoofding.</li>
		<li>Spuit het lichaam met 70% ethanol en open de ventrale romp van de rat. Verwijder de baarmoeder voorzichtig en plaats deze in een 100 mm TC-schaal met ijskoude HBSS.</li>
		<li>Houd de baarmoeder vast met een gebogen tang en open de baarmoederwand met een fijne tang. Verwijder een vruchtzak en open deze voorzichtig door met een fijne tang in een gaatje te knijpen.</li>
		<li>Verwijder het embryo uit de omliggende weefsels, knip de navelstreng door en onthoofd het embryo met een fijne tang. Plaats de romp in een 100 mm TC-schaal gevuld met HBSS met behulp van een gebogen tang en een spatel.</li>
		<li>Verwijder snel alle embryo's uit de baarmoeder en breng ze over in één 100 mm TC-schaal gevuld met HBSS. Als er meer dan vijf embryo's zijn, bereid dan een extra 35 mm TC-schaal met 2 ml HBSS, volgens stap 2.3.1.</li>
		<li>Plaats voorzichtig een embryotorso in een 35 mm TC-schaal gevuld met HBSS met behulp van een spatel en een gebogen tang. Open onder een stereomicroscoop het dorsale deel van de romp om het embryo in twee helften te verdelen met behulp van een fijne tang en een microschaar. Draai de ene helft opzij en identificeer de streng DRG die zich in een lijn op het dorsale deel van het embryo bevindt.</li>
		<li>Knip de DRG als een hele streng uit met een fijne tang en een microschaar. Plaats de DRG in een verse TC-schaal van 35 mm gevuld met 2 ml HBSS en scheid een enkele DRG van het resterende weefsel met behulp van een fijne tang en een microschaar.</li>
	</ol></li>
	<li>DRG-celkweek<ol><li>Neem 4-putplaten met 190 μL DRG-groeimedium van de incubator naar de schone bank waar de DRG moet worden bereid. Breng een enkele DRG voorzichtig over in een put van een 4-well kweekplaat met behulp van een fijne tang en een spatel. Plaats de DRG in het midden van elke put, omdat een centrale positie belangrijk is voor de bevestiging van de DRG.</li>
		<li>Werk voortaan onder steriele omstandigheden. Plaats de explantatieculturen in de incubator bij 37 °C en 5% CO2. Voeg de volgende dag voorzichtig 50 μL van het DRG-groeimedium toe aan elke put met behulp van een pipet van 100 ml.</li>
		<li>Observeer drg-explantatietrouw en axonuitgroei dagelijks met een microscoop en gooi DRG-explantaten weg die los zijn gekomen van de dekslip of axonen niet zijn ontgroeid op dag 3 van de cultuur. OPMERKING: DRG-explantaten zijn erg kwetsbaar in de eerste dagen van de kweek en moeten met zorg worden behandeld, vooral bij het verplaatsen van de platen in en uit de incubator wanneer het medium wordt vervangen, of zelfs bij het sluiten van de incubatordeur. Het precieze volume van 190 μL medium per put is cruciaal om de DRG-explantaten op hun plaats te houden tijdens de eerste kweekdag. Losse DRG-explantaten kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens de dagelijkse controle, omdat ze in het medium zwemmen in plaats van zich aan de deklaag te hechten.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Cocultuur
<ol><li>Overdracht van Schwann-cellen naar de DRG-explantatiecultuur<ol><li>Bereid het cocultuurmedium door 0,1% ascorbinezuur toe te voegen aan het DRG-groeimedium.</li>
		<li>Vervang op dag 3 van de DRG-explantatiecultuur voorzichtig het DRG-groeimedium door 250 μL van het cocultuurmedium met 30.000 Schwann-cellen (vanaf stap 1.8) per put.</li>
		<li>Bewaar de cocultuur van de DRG-explantaten en Schwann-cellen maximaal 22 dagen. Vervang om de dag 250 μL van het cocultuurmedium zorgvuldig en observeer het uiterlijk van de cellen met een microscoop. OPMERKING: Voor een voorbeeld van DRG-axonen en Schwann-cellen in de cocultuur in de eerste dagen van de kweek, zie figuur 1.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunocytochemische kleuring OPMERKING: Ga uiterst voorzichtig om met de cocultuurmonsters tijdens de kleuringsprocedure, omdat ze gemakkelijk kunnen worden beschadigd.<ol><li>Om de cellen op de coverslips te bevestigen, verwijdert u het medium langzaam, wast u 3x met DPBS voorzichtig en incubeert u gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA). Vervang de PFA door DPBS en bewaar de vaste cellen bij 4 °C gedurende maximaal 1 week. LET OP: Draag bij het hanteren van 4% PFA de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
		<li>Was de coverslips 3x met DPBS gedurende 5 min, en blokkeer vervolgens met een blokkeeroplossing (10% geitenserum, 10% runderserumalbumine [BSA], 0,1% gelatine en 0,05% Triton X-100) in DPBS gedurende 1 uur. Verdun de primaire antilichamen βIII-tubuline (1:7.500) en myelinebasisch eiwit (MBP) (1:750) in de blokkerende oplossing en incubeer 's nachts bij 4 °C.</li>
		<li>Was de cellen 3x met DPBS gedurende 5 min. Gebruik fluorescerende kleurstof-geconjugeerde secundaire antilichamen in een verdunning van 1: 1.000 in blokkerende oplossing en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Was de cellen 3x met DPBS gedurende 5 minuten en monteer de cellen op microscopische glaasjes met fluorescentiemontagemedium, inclusief 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI). Bewaar de dia's in het donker bij 4 °C tot microscopische documentatie. LET OP: Draag bij het hanteren van fluorescentiebevestigingsmedium de aanbevolen persoonlijke beschermingsmiddelen.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse<ol><li>Maak foto's van acht gedefinieerde gebieden rond de DRG-explant in het midden met behulp van een omgekeerde microscoop.</li>
		<li>Gebruik een softwaretoepassing voor beeldanalyse om de gebieden van βIII-tubulinepositieve axonen en myelinisatie gekleurd door MBP te kwantificeren.</li>
		<li>Bereken het percentage myelinisatie als een verhouding van de gemyeliniseerde axonen en niet-gemyeliniseerde axonen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+cell+body+size%2C+axon+size%2C+and+signal+conduction+velocity+for+individually+labelled+dorsal+root+ganglion+cells+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).</li>
<li>Taveggia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells-axon+interaction+in+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Schwann cells-axon interaction in myelination.</a> Current Opinion in Neurobiology. 39, 24-29 (2016).</li>
<li>Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+regeneration+and+muscle+reinnervation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve regeneration and muscle reinnervation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8652(2020).</li>
<li>Nocera, G., Jacob, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Schwann+cell+plasticity+involved+in+peripheral+nerve+repair+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (20), 3977-3989 (2020).</li>
<li>Modrak, M., Talukder, M. A. H., Gurgenashvili, K., Noble, M., Elfar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+nerve+injury+and+myelination%3A+Potential+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Peripheral nerve injury and myelination: Potential therapeutic strategies.</a> Journal of Neuroscience Research. 98 (5), 780-795 (2020).</li>
<li>Salzer, J. L., Bunge, R. P., Glaser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+Schwann+cell+proliferation.+III.+Evidence+for+the+surface+localization+of+the+neurite+mitogen%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies of Schwann cell proliferation. III. Evidence for the surface localization of the neurite mitogen.</a> The Journal of Cell Biology. 84 (3), 767-778 (1980).</li>
<li>Wood, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+sensory+axons+are+mitogenic+for+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells.</a> Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).</li>
<li>Eldridge, C. F., Bunge, M. B., Bunge, R. P., Wood, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+axon-related+Schwann+cells+in+vitro.+I.+Ascorbic+acid+regulates+basal+lamina+assembly+and+myelin+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of axon-related Schwann cells in vitro. I. Ascorbic acid regulates basal lamina assembly and myelin formation.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (2), 1023-1034 (1987).</li>
<li>Paivalainen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+mouse+dorsal+root+ganglion%2FSchwann+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 37 (3), 568-578 (2008).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140 (4), 898-913 (2017).</li>
<li>Taveggia, C., Bolino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRG+neuron%2FSchwann+cells+myelinating+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRG neuron/Schwann cells myelinating cocultures.</a> Methods in Molecular Biology. 1791, 115-129 (2018).</li>
<li>Andersen, N. D., Srinivas, S., Pinero, G., Monje, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+versatile+method+for+the+isolation%2C+purification+and+cryogenic+storage+of+Schwann+cells+from+adult+rodent+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A rapid and versatile method for the isolation, purification and cryogenic storage of Schwann cells from adult rodent nerves.</a> Scientific Reports. 6, 31781(2016).</li>
<li>Pitarokoili, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+triamcinolone+acetonide+exerts+anti-inflammatory+effects+on+Lewis+rat+experimental+autoimmune+neuritis+and+direct+anti-oxidative+effects+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Intrathecal triamcinolone acetonide exerts anti-inflammatory effects on Lewis rat experimental autoimmune neuritis and direct anti-oxidative effects on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 58(2019).</li>
<li>Grüter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+and+anti-oxidative+effect+of+the+direct+TRPV1+receptor+agonist+capsaicin+on+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory and anti-oxidative effect of the direct TRPV1 receptor agonist capsaicin on Schwann cells.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 145(2020).</li>
<li>Lehmann, H. C., Höke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cells+as+a+therapeutic+target+for+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+%26+Neurological+Disorders+-+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Schwann cells as a therapeutic target for peripheral neuropathies.</a> CNS & Neurological Disorders - Drug Targets. 9 (6), 801-806 (2010).</li>
<li>Joshi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Schwann+cell+plasticity+in+chronic+inflammatory+demyelinating+polyneuropathy+%28CIDP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Loss of Schwann cell plasticity in chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP).</a> Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 255(2016).</li>
<li>Klimas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+immunomodulatory+effects+of+bortezomib+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Communications%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent immunomodulatory effects of bortezomib in experimental autoimmune neuritis.</a> Brain Communications. 3 (4), (2021).</li>
<li>Szepanowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LPA1+signaling+drives+Schwann+cell+dedifferentiation+in+experimental+autoimmune+neuritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">LPA1 signaling drives Schwann cell dedifferentiation in experimental autoimmune neuritis.</a> Journal of Neuroinflammation. 18 (1), 293(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Hier presenteren we een snel en gemakkelijk protocol voor het genereren van in vitro myelinisatie door twee afzonderlijke celtypeculturen, Schwann-cellen en dorsale wortelganglionexplantaten, samen te voegen.
Een cruciale stap van het protocol is de teelt van DRG-explantaten, vooral in de eerste dagen van de teelt. DRG zijn zeer kwetsbaar voordat een sterk axonaal netwerk wordt gebouwd en moeten zeer voorzichtig worden behandeld, bijvoorbeeld wanneer ze uit de incubator worden gehaald...

In het perifere zenuwstelsel (PNS) wordt snelle informatietransductie gemedieerd door met myeline omwikkelde axonen. De myelinisatie van axonen is essentieel om de snelle voortplanting van elektrische impulsen mogelijk te maken, omdat de geleidingssnelheid van de zenuwvezels correleert met de axondiameter en myelinedikte1. Sensorische signalering van de periferie naar het centrale zenuwstelsel (CZS) is afhankelijk van de activering van sensorische neuronen van de eerste orde die zich bevinden in vergrotingen van de dorsale wortel, genaamd dorsale wortelganglia (DRG). Voor de vorming en het onderhoud van myeline is continue communicatie tussen axonen en Schwann-cellen, de myeliniserende Glia-cellen in de PNS, verplicht2.
Veel ziekten van de PNS verstoren de transductie van informatie door primaire axonale of demyeliniserende schade, wat resulteert in hypesthesie of dysesthesie. Sensorische neuronen van de eerste orde hebben het vermogen om tot op zekere hoogte te regenereren na neuronale schade, door een complexe interactie tussen het neuron en de omliggende Schwann-cellen3. In dit geval kunnen Schwann-cellen cellulaire herprogrammering ondergaan om zowel axonaal als myeline-puin te verwijderen en axonale regeneratie te bevorderen, wat resulteert in remyelinisatie4. Het begrijpen van de mechanismen van myelinisatie in gezondheid en ziekte is belangrijk om mogelijke behandelingsopties te vinden voor demyeliniserende aandoeningen van de PNS. Myeline kan ook worden beschadigd door acuut neurotrauma en benaderingen om myelinisatie te bevorderen om functioneel herstel na perifeer zenuwletsel te bevorderen, worden onderzocht5.
Onze kennis van perifere myelinisatie heeft grotendeels geprofiteerd van myeliniserende coculturen van Schwann-cellen en sensorische neuronen. Sinds de eerste benaderingen werden toegepast 6,7,8, is myelinisatie intensief bestudeerd met behulp van verschillende cocultuursystemen9,10,11. Hier bieden we een snel en gemakkelijk protocol voor robuuste in vitro myelinisatie van dorsale wortelganglion axonen. Het protocol voor Schwann-celpreparatie is gebaseerd op het protocol van Andersen et al.12, eerder gepubliceerd in Pitarokoili et al.13. We gebruiken Schwann-cellen afkomstig van juveniele ratten en embryonale DRG-explantculturen voor de cocultuur, waarbij myelinisatie optreedt rond dag 14. Het doel van de methode is om een systeem te bieden om de vorming van myeline als gevolg van directe axon-Schwann-celinteractie te onderzoeken en om modulatoren van PNS-myelinisatie te bestuderen. In vergelijking met gedissocieerde neuronale celculturen zijn DRG-explantaten anatomisch meer bewaard gebleven en vormen ze lange axonale processen. Kwantificering van het gemyeliniseerde axongebied biedt een voldoende uitlezing voor myelinisatie in de cocultuur. De methode is een waardevol hulpmiddel om therapeutische verbindingen te screenen op hun potentiële effect op PNS-myelinisatie en kan ook worden gebruikt naast in vivo studies in diermodellen14.

<table><tbody><tr><td>Anti-MBP, konijn</td><td>Novus Biologicals, Centannial, USA</td><td>ABIN446360</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&szlig;III-tubulin, muis&nbsp;</td><td>Biolegend, San Diego, USA</td><td>657402</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinezuur&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>A4403-100MG</td><td></td></tr><tr><td>B27-supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tip, 100 &micro;L</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Duitsland&nbsp;</td><td>70760212</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tip, 1250 &micro;L</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Duitsland&nbsp;</td><td>701186210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tip, 20 &micro;L</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Duitsland&nbsp;</td><td>701114210</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Filter Tip, 300 &micro;L</td><td>Sarstedt, N&uuml;mbrecht, Duitsland&nbsp;</td><td>70765210</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland&nbsp;</td><td>8076.4</td><td></td></tr><tr><td>Celzevener, 100 &micro;M</td><td>BD Bioscience, Heidelberg, Duitsland</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810-R</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duitsland</td><td>5811000015</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator Heracell</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Duitsland&nbsp;</td><td>51017865</td><td></td></tr><tr><td>Dekglasjes 12 mm</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Duitsland&nbsp;</td><td>P231.1</td><td></td></tr><tr><td>Gebogene fijne pincetten&nbsp;</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland</td><td>11370-42</td><td></td></tr><tr><td>DAPI fluoromount-G(R)</td><td>Biozol, Eching, Duitsland</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water (Water Purification System)&nbsp;</td><td>Millipore, Molsheim, Frankrijk</td><td>ZLXS5010Y</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>31331093</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (geen Ca2+ en geen Mg2+)</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>D8537-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol&nbsp;</td><td>VWR, Radnor, VS&nbsp;</td><td>1009862500</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>F7524</td><td>FCS moet getest zijn voor Schwann cel cultuur</td></tr><tr><td>Fijne pincetten (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>F6886-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>G1393-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland</td><td>5710064</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>A11036</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (geen Ca2+ en geen Mg2+)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>14170138</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Incubator</td><td>Heraeus Instruments, Hanau, Duitsland&nbsp;</td><td>51017865</td><td></td></tr><tr><td>Heraguard ECO 1.2</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>51029882</td><td></td></tr><tr><td>Paarden serum</td><td>Pan-Biotech, Aidenbach, Duitsland</td><td>P30-0712</td><td></td></tr><tr><td>Image J Software</td><td>HIH, Bethesda, VS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laminine</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&acute;s L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>MACS Multistand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130042303</td><td></td></tr><tr><td>Microschaar</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Duitsland</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Motic, Wetzlar, Duitsland</td><td>Motic BA 400</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Axio observer 7</td><td>Zeiss, Oberkochen, Duitsland&nbsp;</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglas</td><td>VWR, Radnor, VS&nbsp;</td><td>630-1985</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS separator</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130091632</td><td></td></tr><tr><td>MS kolommen</td><td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Duitsland</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer telkamer&nbsp;</td><td>Assistant, Erlangen, Duitsland</td><td>40441 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neuregulin</td><td>Peprotech, Rocky Hill, VS</td><td>100-03</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>N1408</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Biozol, Eching, Duitsland</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon &Delta; multidishes, 4 wel</td><td>Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Duitsland&nbsp;</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Acros Organics, New Jersey, VS&nbsp;</td><td>10342243</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Duitsland&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Duits

in vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en schwann-cellen

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

Het proces van myelinisatie is essentieel om een snelle en voldoende signaaltransductie in het zenuwstelsel mogelijk te maken. In het perifere zenuwstelsel gaan neuronen en Schwann-cellen een complexe interactie aan om de myelinisatie van axonen te beheersen. Verstoringen van deze interactie en afbraak van de myelineschede zijn kenmerken van inflammatoire neuropathieën en komen secundair voor bij neurodegeneratieve aandoeningen. Hier presenteren we een cocultuurmodel van dorsale wortelganglionexplantaten en Schwann-cellen, dat een robuuste myelinisatie van perifere axonen ontwikkelt om het proces van myelinisatie in het perifere zenuwstelsel te onderzoeken, axon-Schwann-celinteracties te bestuderen en de potentiële effecten van therapeutische middelen op elk celtype afzonderlijk te evalueren. Methodologisch werden dorsale wortelganglions van embryonale ratten (E13.5) geoogst, gedissocieerd van hun omringende weefsel en gedurende 3 dagen als volledige explantaten gekweekt. Schwann-cellen werden geïsoleerd van 3 weken oude volwassen ratten en ischiaszenuwen werden enzymatisch verteerd. De resulterende Schwann-cellen werden gezuiverd door magnetisch geactiveerde celsortering en gekweekt onder neureguline- en forskoline-verrijkte omstandigheden. Na 3 dagen dorsale wortel ganglion explantatiecultuur werden 30.000 Schwann-cellen toegevoegd aan één dorsale wortelganglionexplant in een medium dat ascorbinezuur bevat. De eerste tekenen van myelinisatie werden gedetecteerd op dag 10 van cocultuur, door verspreide signalen voor myeline basisch eiwit in immunocytochemische kleuring. Vanaf dag 14 werden myelineschedes gevormd en verspreid langs de axonen. Myelinisatie kan worden gekwantificeerd door myeline basiseiwitkleuring als een verhouding van het myelinisatiegebied en het axongebied, om rekening te houden met de verschillen in axonale dichtheid. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van perifere myelinisatie in vitro te bestuderen, wat cruciaal is voor het begrijpen van de pathologie van en mogelijke behandelingsmogelijkheden voor demyelinisatie en neurodegeneratie bij inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel.

Myelinisatie in de cocultuur werd beoordeeld op dag 10, 12, 14, 16, 18 en 20. De DRG-explantaten en Schwann-cellen werden gekleurd voor MBP, βIII-tubuline en DAPI. Het axonale netwerk in de cocultuur was dicht en veranderde niet zichtbaar in het tijdsverloop van de waarneming. De eerste tekenen van myeline, in de vorm van kleine fragmenten, waren detecteerbaar op dag 10 en namen toe op dag 12 (figuur 2). De MBP-positieve gebieden namen in de loop van de tijd toe tot dag 20 van cultuur. De my...

In het cocultuursysteem van dorsale wortelganglia en Schwann-cellen kan myelinisatie van het perifere zenuwstelsel worden bestudeerd. Dit model biedt experimentele mogelijkheden om perifere myelinisatie te observeren en te kwantificeren en om de effecten van interessante verbindingen op de myelineschede te bestuderen.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Dit model biedt experimentele mogelijkheden om verschillende aspecten van myelinisatie van het perifere zenuwstelsel in vitro te bestuderen. Het maakt myelinekwantificering en het onderzoek van Axon-Schwann celinteracties mogelijk. De co-cultuur ontwikkelt vanaf dag 14 een robuuste myelinisatie.De DRG-explantculturen bieden het voordeel van intacte structurele architectuur in vergelijking met gedissocieerde neuronale culturen. Deze methode is beschikbaar om te screenen op tropotische verbindingen voor inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten van het perifere zenuwstelsel. Om te beginnen, steriliseer het werkgebied in de romp van de geëuthanaseerde rat met 70% ethanol.Open de dorsale linkerondermaat van de rat met een schaar en verwijder voorzichtig de femoreuze spier van de biceps. Maak de heupzenuw los door een gladde verhoging met een gebogen tang, zodat de zenuw niet wordt gekneusd. Breng met behulp van een tang de geknipte zenuwen over naar een weefselkweekschaal met ijskoud Leibovitz's L-15-medium met 50 microgram per milliliter gentamycine.Verwijder vervolgens met behulp van een stereomicroscoop het vet, de spieren en de bloedvaten uit de zenuwen met twee paar fijne tangen. Identificeer de proximale en distale uiteinden van de heupzenuw en verwijder het epineurium met één paar fijne tangen in proximale tot distale richting terwijl u het proximale zenuwuiteinde vasthoudt met het tweede paar fijne tangen. Na het overbrengen van de gezuiverde zenuwen naar een andere weefselkweekschaal met ijskoud Leibovitz's L-15-medium met Gentamycine, plaagt u de geïsoleerde zenuwfascikels om enkele zenuwvezels te scheiden en te isoleren met behulp van twee paar fijne tangen.Breng de zenuwvezels over in een buis van 50 milliliter met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter en neem zo min mogelijk medium op. Voeg vervolgens een paar keer 50 milliliter L 15-medium van leibovitz met gentamycine toe aan de zenuwvezels. Centrifugeer de buis met de zenuwvezels op 188 G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.Na het verwijderen van het supernatant, breng de pellet met het resterende Leibovitz's L-15 medium over in een 60 millimeter weefselkweekschaal. Spoel de buis van 50 milliliter af met 10 milliliter van de enzymatische spijsverteringsoplossing en voeg deze toe aan de schaal met zenuwvezels. Verdeel de zenuwvezels voorzichtig in de schaal met de punt van een pipet.Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 18 uur. En stop de enzymatische vertering door 10 milliliter bij 40% FCS in HBSS toe te voegen. Breng de verteerde zenuwen over in een buis van 50 milliliter om gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius te centrifugeren bij 188 G.Na het weggooien van het supernatant, suspensie de pellet opnieuw in 10 milliliter DMEM met 10% FCS en 50 microgram per milliliter gentamycine. Filter vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 100 micrometer. na het centrifugeren bij 188 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, de pellet opnieuw suspenderen met vier milliliter DMEM die FCS en gentamycine bevat.Voeg twee milliliter van de celsuspensie toe aan elk van de twee met polylysine en laminine bedekte 60 millimeter weefselkweekschalen. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, waarbij de platen twee dagen onaangeroerd in de incubator blijven. Centrifugeer de Schwann-celsuspensie bij 188 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en suspensie de celpellet opnieuw in 90 microliter magnetische celscheidingsbuffer per één maal 10 tot de zevende cel.Voeg vervolgens 10 microliter ti1 microkralen per één keer 10 toe aan de zevende cellen. Incubeer de geresuspendeerde oplossing gedurende 15 minuten in het donker bij acht graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter in de magnetische celscheidingsbuffer toe aan de celsuspensie.Na het centrifugeren bij 300 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius, suspensie de pellet opnieuw in 500 microliter magnetische celscheidingsbuffer. Plaats de magnetische celscheidingskolom in de celscheider en bevochtig de kolom met één milliliter van de magnetische celscheidingsbuffer. Breng vervolgens de cellen erop aan om de stroom door te vangen voor centrifugatie.Verwijder voorzichtig de baarmoeder van een geëuthanaseerde zwangere rat en plaats deze in een weefselkweekschaal van 100 millimeter met ijskoude HBSS. Houd de baarmoeder vast met een gebogen tang en open de baarmoederwand met een fijne tang. Verwijder een vruchtwaterzak en open deze voorzichtig door met een fijne tang in een gaatje te knijpen.Verwijder snel alle embryo's uit de baarmoeder en breng ze over in een schaal gevuld met HBSS. Plaats voorzichtig een embryotorso in een schaal van 35 millimeter gevuld met HBSS. onder een stereomicroscoop, Open het dorsale deel van de romp om het embryo in twee helften te verdelen.Draai de ene helft naar de zijkant en identificeer de streng van dorsale wortelganglia, of DRG, gelegen in de lijn bij het dorsale deel van het embryo. Knip de DRG als een hele streng uit met een fijne tang en een microschaar. Na het plaatsen van de DRG in een verse schaal gevuld met twee milliliter HBSS, scheidt u een enkele DRG van het resterende weefsel met behulp van een fijne tang en een microschaar.Neem een 4-putplaat met 190 microliter DRG-groeimedium in elke put en breng voorzichtig een enkele DRG over in het midden van elke put met behulp van een fijne tang en een spatel. Plaats vervolgens de DRG-explantculturen in de incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Voeg de volgende dag voorzichtig 50 microliter van het DRG-groeimedium toe aan elke put en observeer drg-explantatietrouw en axonuitgroei dagelijks met een microscoop.Voor co-kweek op dag drie van de DRG-explantatiecultuur, vervangt u het DRG-groeimedium zorgvuldig door 250 microliter van het co-kweekmedium met 30.000 schwann-cellen per put. Voor het uitvoeren van immunocytochemische kleuring, fixeert u de cellen op de afdekstroken door de DPBS-gewassen cellen gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde te incuberen. Maak foto's van de immunocytochemisch gekleurde monsters op acht gedefinieerde gebieden rond de DRG-explant in het midden met behulp van een omgekeerde microscoop.Het uiterlijk van schwanncellen met een langwerpige en spilvormige morfologie en de dunne DRG-axonen in een co-cultuur wordt hier afgebeeld. Myelinisatie in de co-cultuur werd op verschillende dagen beoordeeld door de DRG-explantaten en Schwann-cellen te kleuren voor myelinebasiseiwit of MBP, bèta-drie tubuline en DAPI. Het axonale netwerk in de cocultuur was dicht en veranderde niet zichtbaar in het tijdsverloop van de waarneming.De eerste tekenen van myelinisatie waren zichtbaar op dag 10 en 12 van de co-cultuur. Vanaf dag 14 was het MVP-signaal meer uitgesproken en werden met myeline omwikkelde axonen gedetecteerd. De myelinisatie nam toe met de co-cultuurtijd tot dag 20.De myelinisatie werd gekwantificeerd als een verhouding van de MVP en bèta drie tubuline positieve gebieden. Een significante toename van myelinisatie werd waargenomen op dag 18 en 20 in vergelijking met dag 10. DRG-explantculturen zijn kwetsbaar en moeten zorgvuldig worden behandeld.Bijvoorbeeld wanneer het uit de couveuse wordt gehaald of tijdens mediumwissel en fixatie. Genexpressieanalyse van co-cultuurmonsters kan worden gevormd om myeline in meer detail te onderzoeken. Hier ontdekten we de myelinemarkers PMP22, MAG, Oct6, Egr2, Olig1 op dag 22.

in-vitro-myelination-peripheral-axons-coculture-rat-dorsal-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een protocollen voor een embryonale hersenen van de rat totale cultuur-systeem is beschreven. Multipotente voorlopercellen in de aggregaten kunnen ontwikkelen en differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten.

Voorbereiding van de Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron en Glia Development Studies

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

The video demonstrates the co-culturing of dorsal root ganglion (DRG) neurons with Schwann cells. DRG neurons are first grown on a pre-stretched membrane for aligned axon growth. Schwann cells are then introduced, which attach to the axons, insulating them and promoting neural cell survival and function.

Co-Culture of Schwann Cells with DRG Neurons on a Pre-Stretched Membrane

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

This video demonstrates a method for isolating Schwann cells from mouse sciatic nerve fibers.

Magnetic Separation of Schwann Cells from Mouse Sciatic Nerves

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

We presenteren een in vitro model om olfactorisch verwarmend glia (OEG) neuroregeneratief vermogen te beoordelen, na neuraal letsel. Het is gebaseerd op een cocultuur van axotomized volwassen retinale ganglion neuronen (RGN) op OEG monolagen en daaropvolgende studie van axonale regeneratie, door het analyseren van RGN axonale en somatodendritische markers.

Cocultuur van Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons met Olfactory Ensheathing Glia, als een In Vitro Model van Volwassen Axonale Regeneratie

Dit protocol beschrijft methoden voor het vaststellen van hele berg en gedissocieerde culturen van muis Dorsal Root Ganglia (DRG) en hun gebruik om tumor-zenuwinteracties te beoordelen.

Opstellen van in-vitromodellen van dorsale wortelgangliacultuur: complementaire benaderingen voor het onderzoeken van overspraak tussen kanker en zenuw

Leer in vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen. Deze methode kwantificeert myeline en onderzoekt axon-Schwann-celinteracties.

In vitro myelinisatie van perifere axonen in een cocultuur van dorsale wortel ganglionexplantaten en Schwann-cellen

Meer video's verkennen