Celkweektechnieken en -praktijken om besmetting door schimmels en bacteriën in het laboratorium voor onderzoekscelkweek te voorkomen

Celkweek is een delicate vaardigheid die nodig is voor het kweken van verschillende soorten cellen en weefsels in een gecontroleerde laboratoriumomgeving. De primaire zorg bij het uitvoeren van celkweekwerk is besmetting. Deze besmetting kan komen in de vorm van bacteriën, schimmels of mycoplasma.

De technieken en praktijken die allemaal in deze video worden beschreven, zorgen ervoor dat uw cellen levensvatbaar, gezond en besmettingsvrij blijven. Deze praktijken moeten strikt worden nageleefd en al het laboratoriumpersoneel moet minstens één keer per jaar een training krijgen. Draag voordat u aan het werk gaat een schone laboratoriumjas die alleen is bedoeld voor gebruik in de celkweekruimte.

Draag nieuwe handschoenen die geen andere oppervlakken hebben aangeraakt. Zorg ervoor dat de handschoenen goed aansluiten. Nitril poedervrije handschoenen zijn het beste.

De labjas en handschoenen hoeven niet steriel te zijn. Om je voor te bereiden op het werk, spuit je handschoenen, laboratoriumjasmouwen en de binnenkant van de biologische veiligheidskast met 70% ethanol. Spuit het werkoppervlak, de zijkanten, de achterkant, eventuele items in de kast en het voorste glaspaneel, zowel van binnen als van buiten.

Veeg het werkoppervlak en het glazen paneel droog met een pluisvrije papieren handdoek. Neem de tijd om de werkruimte in de kast in te delen. Houd waterbaden in de celkweekruimte en gebruik deze alleen voor celkweekdoeleinden, zoals het verwarmen van media of het ontdooien van cellen.

De waterbaden moeten eenmaal per week worden afgetapt en gewassen. Beperk de hoeveelheid items die in de kast worden gebracht en onderbreek de luchtstroom in de biologische veiligheidskast niet door de voorste of achterste roosters te blokkeren. Spuit alle items die in de kast zijn geplaatst met 70% ethanol en veeg ze droog.

Begin met het spuiten van de bovenkant van de mediafles en werk je een weg naar beneden. Begin met een schone papieren handdoek vanaf de bovenkant van de mediafles om deze droog te vegen en werk je geleidelijk een weg naar de bodem. Ga niet terug naar boven richting de dop.

De manier waarop deze kasten werken, is dat ze lucht uit de kamer en de kast zelf trekken via de voor- en achterroosters. De lucht gaat naar de achterkant van de kast en naar boven. Daar gaat vervuilde lucht door een hoop filters en wordt een deel van de gefilterde schone lucht naar beneden geduwd op het werkgebied in de kast.

Als de kast groot genoeg is om serologische pipetten te huisvesten, kunnen ze binnen worden geplaatst, anders kunnen ze worden opgeslagen in een recipiënt dat aan de buitenkant van de kast is gemonteerd. Het is een goede gewoonte om voor gebruik beide zijden van de ingekapselde pipet te controleren op gaten, scheuren of lekke banden in de verpakking. Scheur de verpakking niet af.

Schil in plaats daarvan voorzichtig de uiteinden van de verpakking. Steek de serologische pipet in een pipethulpmiddel en verwijder de wikkeling in één vloeiende beweging. Beweeg niet over open flessen of flacons.

Het is niet aan te raden om over een open fles of kolf te reiken of boven open kolven te werken. De luchtstroom in de kasten drukt op alles binnenin. Als je naar boven reikt, kan je mouw of handschoen bovenop items komen te zitten die mogelijk eventuele verontreiniging op je mouw kunnen duwen, bijvoorbeeld in je celcultuur.

Giet waar mogelijk geen vloeistoffen. Voeg ze in plaats daarvan toe met een serologische pipet. Meng de inhoud grondig en initialiseer de fles.

Schrijf op waar de media mee worden aangevuld. Als je met aanhangende culturen werkt en een plastic fles nodig hebt, spuit dan de hele verpakking en haal het erin. Wanneer je handschoenen zijn opgedroogd, spuit je ze opnieuw in met de ethanol.

Wanneer u met een aanhangende cellijn werkt, gebruikt u geautoclaveerde glazen pipetten of steriele plastic wegwerppipetten om media of wasoplossingen op te zuigen. Verwijder voorzichtig de metalen dop uit de opslagcontainer. Isoleer één glazen pipet door de container voorzichtig schud onder een hoek.

Wanneer u in de container reikt, mag u geen andere pipetten aanraken. Behandel de gekozen pipet slechts aan één uiteinde. Vervang doppen op flessen en flacons zo snel mogelijk.

Plaats doppen ondersteboven op het werkoppervlak, zodat de velg het werkoppervlak niet raakt. Pak de dop niet van de boven- of onderkant. Raak in plaats daarvan doppen aan vanaf de zijkanten.

Gebruik bij het aanzuigen van vloeistoffen een vacuümvangerkolf buiten de kast in een secundaire container op de vloer. Afval ontstaat tijdens het werken in de kast. Omdat het te vaak in en uit de kast bewegen van de handen de luchtstroom onderbreekt, is het prima om afval tijdelijk in de kast te laten.

Plaats het aan de zijkant, zodat het uw werk niet onderbreekt. Spuit handschoenen royaal met 70% ethanol wanneer ze droog worden. Wrijf je handen tegen elkaar zodat ze niet nat druipen.

Een korte opmerking over serologische pipetten. Als ze per ongeluk iets anders in de motorkap raken, aarzel dan niet om ze weg te gooien. Het is het beste om opnieuw te beginnen met een schone serologische pipet in plaats van er een te gebruiken die mogelijk besmet is.

Voordat u cellen in de couveuse plaatst, controleert u hoe ze er onder de microscoop uitzien. Enkele cellen moeten worden waargenomen. Dit geeft aan dat de cellen grondig zijn geresuspendeerd.

Spreek, nies, hoest of adem niet zwaar in de couveuses. Snel incubatordeuren openen en sluiten. Als u ze langer dan nodig open laat, kunnen verontreinigingen in de lucht de broedmachines binnendringen.

Zorg ervoor dat de doppen van alle flessen goed gesloten zijn voordat u ze uit de kast haalt. Media is lichtgevoelig. Het moet in het donker worden bewaard bij vier graden Celsius wanneer het niet in gebruik is.

Spuit de binnenkant van de kast opnieuw met 70% ethanol nadat het celkweekwerk is voltooid en veeg het oppervlak droog met een papieren handdoek. Leeg de biohazard afvalzak. Herhaal dit proces en vervang handschoenen bij het overschakelen naar een andere cellijn.

Wanneer u werkt met suspensieculturen die in glazen kolven zijn gekweekt, moet u ervoor zorgen dat handschoenen nat zijn. Raak de aluminiumfolie aan met uw natte handschoenen en spuit vervolgens alleen de bodem van de kolf voordat u deze in de biologische veiligheidskast plaatst. Wanneer u een monster neemt voor het tellen van cellen, verwijdert u slechts één buis van 1,5 ml uit de container.

Raak geen van de andere buizen aan. Plaats de dop ondersteboven op het werkoppervlak. Raak de binnenrand niet aan.

Behandel het met zorg vanaf de zijkanten en vervang het zodra je klaar bent. Verwijder bij het hanteren van ophangcellen en glazen kolven voorzichtig het dubbelgevouwen stuk aluminiumfolie dat de hele hals van de kolf bedekt. Trek voorzichtig aan alle vier de hoeken en plaats de folie ondersteboven op het werkoppervlak.

Behandel de glazen kolf alleen vanaf de bodem. Raak het niet aan vanuit de nek zodra de folie eraf is. Gebruik een serologische pipet van 1 ml om een monster te nemen voor het tellen van de cellen.

Laat geen media langs de zijkant van kolven druppelen. Als dat het geval is, spuit dan keukenpapier met 70% ethanol en maak het meteen schoon. Zorg ervoor dat de doppen of aluminiumfolie zijn aangedraaid voordat u flessen of kolven uit de biologische veiligheidskasten verwijdert.

Gebruik aparte incubators voor verschillende celtypen. Dit voorkomt kruisbesmetting van verschillende celtypen. Het wordt aanbevolen om de vacuümvangerkolf voor het verzamelen van vloeibaar afval buiten de kast op de vloer in een secundaire container met het label afval te plaatsen.

De slang wordt aangesloten op een filter dat maandelijks wordt vervangen. De slang gaat via de zijkant van de kast naar binnen. Verwijder de biohazard-prullenbak zodra het werk is voltooid.

Houd een glaswasprotocol op de muur bij de gootsteen. Week eerst de afgedankte cellen met 10% bleekmiddel gedurende ongeveer vijf minuten. Gooi vervolgens het bleekmiddelmengsel weg en spoel de kolf grondig af met water.

Voeg zeep toe met water, schrob het met een borstel heel goed, spoel af met meer water. En dan is de laatste stap om het glaswerk af te spoelen met het DI-water op de kraan aan de rechterkant. Was glasflessen zo snel mogelijk, schrob het glaswerk goed.

Sf9-cellen zullen deze rand van dode cellen verlaten als deze niet goed wordt geschrobd. Gebruik deze kolven alleen voor celkweek, autoclaafcelkweekglaswerk in plaats van het naar een glaswasgelegenheid te sturen. Gebruik de vacuümcyclus op de autoclaaf gedurende 40 minuten gesteriliseerde tijd en 40 minuten droogtijd.

Houd het gescheiden van glaswerk in het hoofdgedeelte van het lab. Organiseer de celkweekruimte zo dat alle benodigdheden zich in één gebied bevinden, waardoor laboratoriumleden de celkweekruimte niet hoeven te verlaten op zoek naar benodigdheden. Etiketteer alle plastic flessen die worden gebruikt om cellen te oogsten en die daarna worden hergebruikt in celkweek, alleen voor celkweekgebruik.

Gebruik de aangewezen celkweekflessen voor één specifiek celtype. Bewaar deze flessen in de celkweekruimte voor gemakkelijke toegang. Voor culturen die in suspensie worden gekweekt, wordt schimmel in de media herkend als zwevende ballen.

Wat bacteriële besmetting betreft, zal het de media wit en troebel maken. Evenzo kan schimmelbesmetting voor aanhangende cellen gemakkelijk worden herkend als wazige vlekken. Bacteriële besmetting zal normaal heldere media maken, wit en troebel.

Veel soorten mycoplasma kunnen betrouwbaar worden geïdentificeerd met behulp van een PCR-gebaseerde test. De band aan de linkerkant toont de moleculaire gewichtsnormen voor DNA. De vier banden aan de rechterkant zijn positieve controles.

Er verschijnen geen banden onder geteste celtypen omdat mycoplasma niet werd gedetecteerd. Celkweekmedia veranderen van kleur van rood naar geel als pH-indicatoren aanwezig zijn. De gele kleur geeft aan dat de pH laag is en dat de media moeten worden vervangen.

Als andere gezwellen of celvormen onder de lichtmicroscoop worden waargenomen tijdens het uitvoeren van celtellingen, kan dit een indicator zijn van besmetting. Merk op dat een grondige reiniging van de hemocytometer moet worden uitgevoerd voorafgaand aan het tellen van de cel, omdat dit type puin alleen op de hemocytometer aanwezig kan zijn en niet in de celcultuur zelf. Hoewel besmetting een van de belangrijkste zorgen is bij het uitvoeren van celkweekwerk, kunnen deze risico's worden beperkt door de praktijken en technieken te volgen die in deze video worden beschreven.

Als er elke maand een maandelijkse mycoplasma-test wordt uitgevoerd, laboratoriumpersoneel jaarlijks wordt getraind en deze praktijken strikt worden nageleefd, blijven uw cellen gezond en besmettingsvrij. Dit zal ook helpen de kosten te verlagen die gepaard gaan met de aankoop van dure celkweekmedia, de aankoop van nieuwe cellen en het zal de uitvaltijd van de decontaminatie van de incubator verminderen. Vergeet niet dat de sleutel tot een succesvolle celkweek vroege actie is om besmetting in de eerste plaats te voorkomen.