Detectie en kwantificering van calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) in menselijk plasma met behulp van een gemodificeerde enzymgebonden immunosorbent assay

Dit gemodificeerde ELISA-protocol maakt de zuivering en nauwkeurige kwantificering van CGRP in menselijk plasma mogelijk. Het heeft de nodige validatie-experimenten ondergaan en kan dienen om toekomstige kwantificeringsmethoden te standaardiseren. Dit protocol biedt de voordelen van het opnemen van monsterverwerking vóór significante proteaseafbraak, zuivering via vastefase-extractie en beperking van niet-specifieke binding door toepassing van blokkerende buffer op de microtiterplaten.

CGRP speelt een bestraffende rol in de pathofysiologie van migraine en misschien een kandidaat voor de status van biomarker. Het is ook betrokken bij cardiologische, dermatologische, virale en zelfs COVID-19-gerelateerde ziekteprocessen. Om te beginnen, verzamel 5 milliliter volbloed uit de antecubitale ader via standaard venapunctiemethoden in een 6 milliliter vacutainer EDTA-buis.

Om de lysis van het doelpeptide te blokkeren, voegt u 0,5 milliliter aprotinine competitieve serineproteaseremmer toe. Keer de buis 10 keer om en bewaar hem op ijs tot de volgende stap. Centrifugeer vervolgens de buis op 600 4g gedurende vier minuten bij 4 graden Celsius.

En breng de plasmafractie over in een 2 milliliter steriele cryoflacon met ronde bodem. Bewaar de cryo-injectieflacon onmiddellijk bij min 80 graden Celsius gedurende maximaal twee weken. Plaats voor het extraheren van het plasmamonster een extractiepatroon in een conische centrifugebuis van 15 milliliter.

Laat 5 milliliter 100% methanol en vervolgens 10 milliliter ultrapuur water door de patroon lopen om het te activeren. De vloeistof wordt verzameld in de buis terwijl deze door de patroon gaat door door de zwaartekracht aangedreven stroming. Gooi opgehoopte overtollige vloeistof weg om te voorkomen dat deze de cartridge overspoelt en zorg ervoor dat deze niet uitdroogt tijdens het experiment.

Verdun 250 microliter plasma in 750 microliter 4% azijnzuur en laat het langzaam door de patroon lopen. Was vervolgens de patroon met 10 milliliter azijnzuur. Zodra de overtollige vloeistof is verwijderd, brengt u de patroon over naar een nieuwe conische centrifugebuis van 15 milliliter.

Bereid 3 milliliter methanol-azijnzuuroplossing om het calcitonine-gengerelateerde peptide of CGRP te elueren. Laat 1 milliliter ervan door de patroon lopen en wacht 25 minuten tussen elke elutie. Na de laatste elutie bevat de buis 3 milliliter totaal eluant.

Breng 1 milliliter van het eluant over in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter en draai deze gedurende één seconde in een minicentrifuge om het eluant te laten bezinken. Droog het monster vervolgens in een vacuümcentrifuge bij 1, 400 RPM en 4 graden Celsius. Reconstitueer het gedroogde monster onmiddellijk voor de test met ontdooide enzymimmunoassay of EIA-buffer.

Voeg voor het blokkeren van de plaat 250 microliter TBS-visgelatineblokkeringsbuffer toe aan elke put. Leg een afdekvel over de plaat en incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Verwijder na incubatie het afdekblad en leeg de plaat door deze om te keren.

Dep de plaat vervolgens op een papieren handdoek om eventuele sporenvloeistof weg te gooien en droog deze gedurende 10 minuten in een laminaire stroomkap. Zodra de plaat zichtbaar droog is, plaatst u deze in een met een afsluiting van de folie afgesloten zakje met een silicagel droogmiddelzakje. Bewaar het bij min 20 graden Celsius gedurende 24 uur.

Voordat u de test uitvoert, ontdooit u alle monsters en bereide reagentia bij kamertemperatuur. Om de putjes van de blokplaat af te spoelen, voegt u 300 microliter wasbuffer toe en laat u deze 30 seconden zitten. Gooi vervolgens de wasbuffer weg en spoel vijf keer opnieuw.

Dep na de laatste spoeling de plaat zoals eerder aangetoond. Doseer vervolgens 100 microliter EIA-buffer aan de speciale twee niet-specifieke bindings- of NSB-putten. Voeg 100 microliter van de CGRP-normen toe, gevolgd door het gereconstitueerde monster en de kwaliteitscontrole in tweevoud in geschikte putten.

Voeg 100 microliter CGRP-tracer toe aan elke put, behalve de lege putten. Sluit ten slotte de plaat af met een transparant afdekvel, zorg ervoor dat de monsters en reagentia niet verdampen en incuber de plaat gedurende 16 tot 20 uur bij 4 graden Celsius. Wanneer de incubatietijd voorbij is, bereidt u het reagens van Ellman voor volgens de instructies van de fabrikant.

Zodra de plaat is gedecanteerd, wast u elke put drie keer zoals eerder is aangetoond. Schud de plaat na de laatste spoeling gedurende twee minuten bij 120 RPM. Nogmaals, spoel de plaat driemaal af en dep hem droog.

Tik op de omgekeerde plaat totdat de vloeistof zichtbaar uit de putjes is verwijderd. Voeg vervolgens 200 microliter van Ellman's reagens toe aan elke put, behalve lege putten. Zodra de plaat is bedekt, wikkelt u deze in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen en incubeert u deze in het donker bij kamertemperatuur gedurende een uur voordat u de absorptie registreert.

De huidige studie toonde aan dat de toevoeging van de blokkeringsstap, de herstelpercentages in elk CGRP-spikemonster binnen het aanvaardbare bereik lagen. Wanneer de blokkeringsstap echter werd uitgesloten, resulteerde de niet-specifieke binding in herstelpercentages die de bovengrens van 125% overschreden%Het is belangrijk om aprotinine toe te voegen om bloedmonsters kort na de verzameling vast te houden om CGRP-afbraak te beperken. Bovendien moet de blokkeringsbuffer voorafgaand aan ELISA aan de microtiterplaat worden toegevoegd om de niet-specifieke binding verder te verminderen.

Dit protocol kan dus worden gebruikt om de kandidatuur van CGRP als biomarker voor vestibulaire migraine te onderzoeken door de niveaus van CGRP te kwantificeren bij de plasmapatiënten met migraine en vestibulaire migraine versus controles.