Isolatie van kernen uit flash-bevroren leverweefsel voor eencellige multiomics

Dit eenvoudige en reproduceerbare protocol werd met succes gebruikt om hoogwaardige kernen te isoleren van gezonde en zieke muismodellevers, evenals levers van menselijke en niet-menselijke primaten. Deze methode vereist slechts een kleine hoeveelheid bevroren weefselmateriaal. Ook geeft dichtheidsgraad-incentivisatie een zeer schone nucleaire suspensie met alle belangrijke celtypen in de lever bewaard in de uiteindelijke nucleaire voorbereiding.

Deze methode van kernextractie kan worden gebruikt in bio-gearchiveerde menselijke levermonsters die worden opgeslagen in biobanken. Begin de weefselhomogenisatie door een blokstuk van 2230 milligram of vijf millimeter uit een leverweefsel te snijden dat in de petrischaal op droogijs is geplaatst met behulp van een vooraf gekoeld scalpel. Breng de petrischaal onmiddellijk over op nat ijs en voeg een milliliter homogenisatiebuffer toe.

Gebruik het koude scalpel om het weefsel zoveel mogelijk te hakken, zodat het kan aspirateren met een een milliliter brede openingpunt. Verzamel de weefselsuspensie en breng deze over in een voorgekoelde twee milliliter glazen dounce homogenisator. Was de petrischaal met een extra homogenisatiebuffer van 0,521 milliliter en verzamel alle resterende stukjes weefsel terwijl alles op ijs wordt bewaard.

Voer langzaam en voorzichtig vijf slagen uit met losse stamper A op ijs zonder bubbels te creëren. Zorg ervoor dat de stamper bij elke slag voorzichtig van de bovenkant naar de onderkant van de homogenisator beweegt. Voer vervolgens 10 tot 15 langzame slagen uit met strakke stamper B op ijs zonder bubbels te creëren.

Als u klaar bent, filtert u het homogenaat door een 50 micrometer celzeef terwijl u het overbrengt in een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter. Gebruik meer dan één filter of buis voor homogenaten die een grote hoeveelheid bindweefselklonten bevatten. Spoel de homogenisator en de filters af met een extra 0,521 milliliter homogenisatiebuffer om alle weefselhomogenaten grondig te verzamelen vóór de dichtheidsgradiëntcentrifugatie.

Voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie centrifugeert u het gefilterde homogenaat in een voorgekoelde centrifuge met vaste hoek bij 1000 G gedurende acht minuten bij vier graden Celsius. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, bereidt u een buis van 1,5 milliliter met 250 microliter 50% iodixanolverdunning en een buis van twee milliliter met 500 microliter 29% iodixanolverdunning. Leg beide buisjes op ijs.

Vervolgens uit de centrifugesuspensie het supernatant zuigen zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. Suspensie de pellet opnieuw in 250 microliter homogenisatiebuffer met behulp van de één milliliter brede opening pipetpunt. Breng vervolgens 250 microliter van de kernsuspensie over in een voorgekoelde buis van 1,5 milliliter met 250 microliter 50% jodidinenol en meng deze voorzichtig en grondig om een 25% iodixanol-kernenuspensie te genereren.

Breng vervolgens 500 microliter van de 25% iodixanol-kernenuspensie over in een voorgekoelde buis milliliterbuis met 500 microliter 29% iodixanolverdunning. Centrifugeer de buis in een voorgekoelde zwenkbakcentrifuge op 12.500 G gedurende 20 minuten, met de pauze uitgeschakeld. Net voordat de centrifugatiestap is voltooid, voegt u de RNA-remmers toe aan de kernopslagbuffer of NSB terwijl u doorgaat naar de RNA-sequencingpijplijnen met één kern.

Na voltooiing van de centrifugatie, aspirateer het supernatant zonder de pellet te verstoren met behulp van een vacuümpomp. Suspensie de pellet voorzichtig opnieuw in 100 tot 300 microliter NSB met behulp van de één milliliter brede opening pippet tip en breng de kernen suspensie over in een schone voorgekoelde buis van 1,5 milliliter. Tel de kernen met behulp van trypan blue oplossing met een handmatige hemocytometer en gebruik onmiddellijk de verkregen kernensuspensie voor de single nucleus genomics assay.

Voor flowcytometrie gebaseerde celsortering filtert u de kernensuspensie door een filter van 50 micrometer in een voorgekoelde vijf milliliter fluorescentie geactiveerde celsortering of faxbuis. Gebruik een flowcytometriesorteerder uitgerust met een mondstuk van 100 micrometer en laad de faxbuis op de sorteerder voordat u een voorbeeld van het monster bekijkt. Stel de gatingstrategie in voor het sorteren van kernen, te beginnen met een spreidingspoort door het voorwaartse spreidingsgebied uit te zetten versus het zijverstrooiingsgebied, gevolgd door hoaxed hoogte versus hoaxed gebied, en vervolgens hoaxed breedte versus hoaxed gebied.

Visualiseer het ploïdieprofiel van de kernen op het hoaxed area histogram. Voor het sorteren in 96 of 384 putplaten, stelt u de druppelvertraging in en optimaliseert u de plaatuitlijning met behulp van de colormetrische methode. Stel de monsterkoeling en plaathouder in op vier graden Celsius met de monsterrotatie ingeschakeld bij 300 RPM.

Sorteer de afzonderlijke kernen met een monsterconcentratie van ongeveer één keer 10 tot de vijfde kernen per milliliter met een stroomsnelheid van 200 tot 500 gebeurtenissen per seconde. Het microscopisch onderzoek van de kernen geëxtraheerd uit bevroren levers toonde aan dat de dichtheidsgradiëntcentrifugatiestap de verwijdering van ongewenst cellulair en weefselafval aanzienlijk vergemakkelijkte. Deze methodologie behield alle niveaus van ploïdie, die werd gevalideerd en gekwantificeerd door cytometrische analyse.

Hoge kwaliteit statistieken werden waargenomen uit de gegevens verkregen met behulp van kernen extractie. Uniforme variëteitsbenadering en projectie vertegenwoordigden het aantal tellingen over alle kernen en de belangrijkste celtypen, die met vertrouwen alleen kunnen worden geïdentificeerd met het nucleaire transcriptoom en de relatief ondiepe sequencing. Deze aanpak maakte het onderzoek mogelijk van leverspecifieke transcriptiefactoren en downstream doelgenen die betrokken zijn bij het metabolisme van xenobiotica.

Het complementaire patroon van kenmerkende genen zoals de percentrale CYP2E1 en de periportale CYP2F2 toonde aan dat de geëxtraheerde kernen kritische informatie over leverdonatie behielden. De genexpressiebibliotheek van RNA werd gesequenced tot een diepte van 44.600 reads per kern en de ATAC-bibliotheek tot een diepte van 43.500 reads per nucleus. Een gewogen nearest neighbor-analyse uitgevoerd voor meerdere metingen van beide modaliteiten, RNA plus ATAC, met behulp van de Seurat- en Signac-pakketten maakte de identificatie en annotatie van de grote en kleine leverceltypen mogelijk zonder prominente vooroordelen vanwege celgrootte of nucleaire kwetsbaarheid.

De upstream transcriptionele regulatoren en de kenmerkende genen van leverdonatie werden ook gedetecteerd in deze methode. Het is belangrijk om te voorkomen dat er te veel bubbels ontstaan tijdens de homogenisatie van down bij het op en neer bewegen van de stampers en om vast te houden aan het aantal slagen dat in het protocol wordt aangegeven.