Visualisatie van vroege infectieplaatsen van rijstontploffingsziekte (Magnaporthe oryzae) op gerst (Hordeum vulgare) met behulp van een basismicroscoop en een smartphone

Ons protocol is een vereenvoudigde methode waarmee onderzoekers vroege infectiestappen van wilde en genetische schimmelmutanten kunnen visualiseren zonder het gebruik van dure apparatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van basislaboratoriumbenodigdheden om complexe biologische vragen te beantwoorden en voor de snelle screening van schimmelmutanten voor verdere analyse. Een moeilijk onderdeel van deze techniek is de behandeling van de schede.

De schede is een dunne laag cellen die gemakkelijk kan worden beschadigd, dus zorgvuldige behandeling is essentieel voor een succesvol experiment. Selecteer om te beginnen de gerst die tot het tweede bladstadium is gegroeid. En knip met een steriele schaar de gerstplant net boven de grondlijn.

Snijd met behulp van een tang en een scalpel voorzichtig de schede van het eerste blad dat in de lengterichting open is. En verwijder het met behulp van de tang van de basis van het tweede blad. Snijd met behulp van een scalpel het grootste deel van het eerste blad weg van de schede, waardoor slechts 0,5 inch van het bladweefsel overblijft voor montage.

Leg het eerste blad plat in een steriele petrischaal van 60 millimeter met daarin een nat keukenpapier om de luchtvochtigheid in de plaat te behouden. Plak het bladweefsel vast aan de bodem van de petrischaal. Selecteer een negen tot 12 dagen oude Magnaporthe oryzae-kweekplaat en voeg er 0,5 tot twee milliliter steriel water aan toe.

Schraap met behulp van een steriele inentingslus voorzichtig de mycelia om de aangehechte conidia vrij te maken. Pipetteer de conidiale suspensie voorzichtig in een microcentrifugebuis met een klein stukje kaasdoek om grote stukken mycelium uit de conidiale suspensie te filteren. Verdun indien nodig de sporenconcentratie met steriel water tot vijf keer 10 tot de vierde sporen per milliliter, omdat een te hoge concentratie het in beeld brengen van individuele infectieplaatsen uitdagend maakt.

Afhankelijk van de grootte van de schede, pipetteer voorzichtig 25 tot 50 microliter van de conidiale suspensie in de gerolde bladschede. Vul vervolgens vier of vijf bekers van 500 milliliter met dubbel gedestilleerd water en verwarm tot het stomt. Houd het deksel van de petrischaal boven een van de dampende bekers om vocht in de plaat op te vangen.

Stapel de geïnfecteerde bladmantelplaten en omring ze met de resterende hete bekers, omdat het een vochtige, vochtige omgeving creëert voor de sporen om te ontkiemen. Bescherm deze opstelling tegen licht door deze te bedekken met een effen gekleurde rubberen of plastic doos en deze 48 uur of het gewenste tijdstip voor beeldvorming ongestoord te laten. Bereid de vlek door vers verdund 45% azijnzuur en 0,1% trypanblauw te mengen.

Aliquot één milliliter van de kleurstofoplossing in microcentrifugebuizen. Snijd met behulp van een scalpel de bladschede voorzichtig weg van de tape. Plaats de schede met een tang in de microcentrifugebuis en zorg ervoor dat deze volledig is ondergedompeld in de kleurstofoplossing.

Laat de buisjes twee uur staan in een warmteblok van 40 graden Celsius of waterbad zodat de kleurstof het blad kan binnendringen. Spoel vervolgens de bladmantels drie keer voorzichtig af in 60% verse glycerol om de extra kleurstof te verwijderen. Houd de schede in glycerol totdat u klaar bent om op dia's te monteren.

Leg de schede op een schone glazen plaat en voeg een paar druppels 60% glycerol toe. Gebruik een ontleedmicroscoop en twee paar tangen om de schede voorzichtig uit te rollen, waarbij het geënte midden naar boven gericht blijft. Houd de schede open met de tang en plaats de afdekslip bovenop om te voorkomen dat de schede krult en de infectieplaats blokkeert.

Sluit de afdeklaag af met nagellak voor langdurige opslag of tape voor kortdurende opslag. Observeer de dia's onder een samengestelde lichtmicroscoop. Maak basisfoto's met een smartphone door een mobiele telefoonadapter op de microscoop te monteren.

Voor Android-apparaten past u de instellingen van de cameratoepassing aan om uit te flitsen, schakelt u de bovenste opname uit, schakelt u de automatische aanpassing van helderheid en schaduwen uit en stelt u de fotoresolutie in op volledig. Maak na het monteren van de mobiele telefoon een afbeelding van een schaalmicrometer met een gewenst doel voor het verkrijgen van de gegevens. Pas de zoom van de telefoon aan tot 2,5 x en houd deze consistent om een consistente pixelgrootte te behouden.

Het midden van de schede herbergt de grootste concentratie sporen en infecterende appressoria. Streef daarom naar negen tot 12 afbeeldingen van elke schede om significante aantallen te verkrijgen voor statistische analyse. De infectieplaatsen van de schede werden in beeld gebracht met behulp van een smartphone- en smartphonemicroscoopadapter na kleuring met trypanblauw.

De hitte en azijnzuur in de kleuringsprocedure verzacht het bladweefsel zachtjes. De nakleuringsspoelingen in 60% glycerol verwijderen niet alleen de overtollige vlek, maar helpen ook de lichtverstrooiing veroorzaakt door het blad te verminderen en de beeldkwaliteit te verbeteren. Afwijkingen van het kleuringsprotocol kunnen resulteren in suboptimale resultaten, zoals hier afgebeeld.

Gerst geïnfecteerd met 4091 wild type produceerde met succes geïnfecteerde cellen geïdentificeerd door de aanwezigheid van geïnfecteerde schimmeldraden in het bladschedeweefsel. In het geval van de gemuteerde J99A-infectie werd een succesvolle ontwikkeling van appressoria en penetratiepennen opgemerkt, maar produceerde geen invasieve schimmeldraden. Timing is belangrijk voor op infectie gebaseerde assays.

Goed verouderde planten en schimmelsporen zijn essentieel voor succes. In deze studie hebben we gekeken naar de aan- of afwezigheid van de infectiestructuren. Aanvullende experimenten zouden vragen kunnen beantwoorden over het fenotype van de infectiestructuur en dat van de binnendringende schimmeldraden.

Onze methodologie is niet nieuw, maar een vereenvoudigde, toegankelijke versie van een complexer, duurder experiment.