Name: Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer een niet-waterige methode voor de isolatie en verrijking van klierachtige gesteelde en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Deze techniek gebruikt vloeibare stikstof en droog ijs voor hoogdoorvoer RNA-extractie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen de financiële steun van CannabiVar Ltd. Al het plantmateriaal werd genereus verstrekt door professor Hinanit Koltai van het Volcani Center, Israël.

OPMERKING: Het plantaardige materiaal dat in deze studie werd gebruikt, bestond uit vier C. sativa ARO-Volcani-stammen (CS-11, CS-12, CS-13 en CS-14) die werden gekweekt in het Volcani Center, Israël, zoals elders beschreven11. Glandulaire capitate stengel trichomen werden geïsoleerd uit volwassen bloeiwijzen, en glandulaire capitate sessile trichomen werden geïsoleerd uit grote waaierbladeren van volwassen niet-bloeiende moederplanten. Al het plantmateriaal werd vers geplukt en direct opgeslagen bij −80 °C.
LET OP: Droogijs en LN worden in het hele protocol gebruikt. Deze stoffen zijn uiterst gevaarlijk. De geïsoleerde trichomen kunnen droogijsdeeltjes bevatten die gevaarlijke gasdruk kunnen veroorzaken wanneer ze in afgesloten buizen worden geplaatst; Daarom moeten alle doppen met een naald worden doorboord. Het gebruik van een beschermende bril, geschikte laboratoriumkleding en handschoenen voor hantering bij extreem lage temperaturen wordt ten zeerste aanbevolen.
1. Opstelling voor de eerste scheiding van trichomen van het plantmateriaal
<ol><li>Verpletter een droogijsblok in kleine fijne vlokken met behulp van een hamer en een hard plat voorwerp in een plastic container van 5 L.</li>
	<li>Zeef de fijne droogijsvlokken (kleiner dan 5 mm) van het niet-gemalen droogijs met een grote zeef (via poriën kleiner dan 5 mm) in een andere plastic container van 5 L. Giet ongeveer 200 cm3 (200 ml merkteken) van de droogijsvlokken in een rechtopstaande glazen bekerglas van 1 L.</li>
	<li>Voeg tot 10 g bevroren C. sativa-bloeiwijzen (vanaf nu plantaardig materiaal genoemd) toe aan de eerste laag gemalen droogijs en dek af met een extra laag van 200 cm3 fijngemalen droogijs.</li>
	<li>Bedek de opening van het glazen bekerglas van 1 L met twee tot drie lagen klamboe van 1 mm hordeur en bevestig het met elastiekjes aan de buitenzijden van de glazen beker (figuur 1).</li>
	<li>Giet LN in een grote roestvrijstalen container met ronde bodem (zie materiaaltabel), waar de geïsoleerde trichomen worden verzameld.</li>
	<li>Steek een gaas van 350 μm in een zeef/zeefzeef om het zeefgaas van onderaf te bedekken (figuur 2). Als er een meelzeef met een afneembare plastic ring beschikbaar is, plaatst u het gaas van 350 μm zodat het onder het gaas van de meelzeef wordt bevestigd. Zo niet, bevestig dan het gaas van 350 μm met elastiekjes aan de omtrek van de meelzeef.</li>
	<li>Plaats de meelzeef boven de grote roestvrijstalen container met ronde bodem gevuld met LN (figuur 3). Zorg ervoor dat de breedte van de container groter is dan die van de meelzeef om het verlies van de gezeefde massa buiten de roestvrijstalen container met ronde bodem te minimaliseren.</li>
</ol>2. Scheiding van trichomen van het plantmateriaal
<ol><li>Schud het glas van 1 L met de opening naar beneden gericht in de richting van de bloemzeef alsof u een groot zoutvaatje gebruikt (figuur 4).</li>
	<li>Zet het glazen bekerglas van 1 L om de 2-3 minuten opzij om het gemalen droogijs en het plantaardige materiaal dat zich op de bloemzeef heeft opgehoopt, te kunnen zeven.</li>
	<li>Zeef de bloemzeef horizontaal om de doorgang van het plantmateriaal in de LN in de roestvrijstalen container met ronde bodem eronder te vergemakkelijken.</li>
	<li>Voeg LN toe aan de roestvrijstalen container en gemalen droogijs aan het glazen bekerglas van 1 L wanneer hun niveaus laag zijn. Vul het gebruikte plantmateriaal in het glazen bekerglas aan met nog eens 10 g vers plantmateriaal wanneer het plantmateriaal op de bloemzeef is uitgeput. De aanvulling hoeft meestal niet meer dan twee keer herhaald te worden.</li>
	<li>Herhaal stap 2.1-2.4 totdat een voldoende hoeveelheid verrijkte trichomen is verzameld in de roestvrijstalen container met ronde bodem. Over het algemeen is 20 g vers plantaardig materiaal voldoende voor RNA-extractie en transcriptoomanalyse.</li>
	<li>Controleer of er een witte poederachtige substantie (bestaande uit plantenresten, kliertrichomen en gemalen droogijs) op de bodem van de roestvrijstalen container onder water in de LN zit. Een microscopische observatie zal helpen om te bepalen of er voldoende trichomen zijn verzameld; Deze stap kan echter de stroom van het protocol belemmeren. Meestal volstaat 10-20 g initieel plantmateriaal voor de meeste isolaties; Er kunnen echter verschillen zijn in de trichoomdichtheid van de planten. OPMERKING: Vanaf dit punt kan het experiment worden onderbroken en later opnieuw worden gestart. Indien kort gepauzeerd, moeten voldoende hoeveelheden LN worden toegevoegd, zodat de trichomen onder water blijven. Als alternatief kunnen de trichomen worden verzameld en bewaard bij −80 °C gedurende maximaal 3 maanden voor later gebruik, zoals beschreven in stap 5.</li>
</ol>3. Scheiding van glandulaire capitate trichomen (gespreid en sessiel) van andere trichomentypen, zoals bolvormige en cystolithische trichomen en puin
<ol><li>Voeg een kleine hoeveelheid LN toe aan een schone kleine roestvrijstalen container met ronde bodem.</li>
	<li>Vouw een microzeef van 40 cm x 40 cm met een maaswijdte van 150 μm tweemaal om een vouw van 20 cm x 20 cm te verkrijgen en open deze. Zorg ervoor dat het lijkt op een kegelachtige vorm (figuur 5).</li>
	<li>Bevestig de gaaskegel aan de rand van de roestvrijstalen container met ronde bodem met een of twee wasknijpers, zodat het geopende deel van de kegel rechtop staat en het puntige deel gedeeltelijk in de LN is ondergedompeld.</li>
	<li>Giet de LN en de witte poederachtige substantie uit stap 2.6 voorzichtig in de microzeefkegel.</li>
	<li>Breng voorzichtig een brede borstel aan om het resterende plantmateriaal van de eerste container te verzamelen en over te brengen in de 150 μm gaaskegel.</li>
	<li>Voeg meer LN toe aan de eerste container en herhaal de borstelbeweging totdat al het plantmateriaal is overgebracht naar de microzeefkegel.</li>
	<li>Maak de wasknijper voorzichtig los van het deksel van de container en open de microzeefkegel zodat de trichomen zich in het midden van de geopende microzeef bevinden. Houd alle vier de hoeken van de microzeef bij elkaar zodat het middelste deel met de trichomen ondergedompeld blijft in de LN (figuur 6).</li>
	<li>Terwijl u alle vier de hoeken van de microzeef vasthoudt, dompelt u de microzeef voorzichtig in de LN in de stalen container alsof u een theezakje inbrengt. Ga door met deze dompel-/schudbeweging (verticaal en horizontaal) gedurende 1 minuut. Er is een afweging tussen de isolatiekwaliteit en kwantiteit. Langere dompelbewegingen kunnen resulteren in grotere hoeveelheden trichomen, maar hun isolatiegraad kan slechter zijn. Over het algemeen wordt 1 minuut aanbevolen als voldoende voor zowel kwaliteit als kwantiteit. OPMERKING: Deze zeefbeweging is het meest kritieke onderdeel van het protocol en moet dienovereenkomstig worden uitgevoerd.</li>
	<li>Optioneel: Schep de niet-gezeefde plantenresten en grotere trichomen (nog steeds ondergedompeld in de LN) die in het midden van de microzeef zijn gewikkeld in een reageerbuis van 13 ml of 50 ml en bewaar bij −80 °C voor toekomstig gebruik. LET OP: Om de ophoping van gas onder druk (van het droogijs en LN-residuen) te voorkomen, prikt u een gat in de dop van de reageerbuis met een gesteriliseerde naald. De dop kan worden vervangen zodra de druk is afgenomen, wat meestal na 24 uur is.</li>
</ol>4. Trichomen door microzeven met afnemende poriegrootte
<ol><li>Breng de gezeefde trichomen ondergedompeld in de LN op de bodem van de kleine roestvrijstalen container met ronde bodem achtereenvolgens over door microzeven met afnemende poriegroottes (105 μm, 80 μm, 65 μm en 50 μm), op dezelfde manier als gepresenteerd in stap 3.</li>
</ol>5. Verzameling van de gewenste trichomen
<ol><li>Verwijder de gewenste trichomen ondergedompeld in de LN en gewikkeld in de 50 μm microzeef met behulp van een voorgekoelde (in LN) lepel. Leg ze op een schoon bord. OPMERKING: In deze laatste isolatiefase worden de gewenste trichomen uit de zeef verzameld.</li>
	<li>Breng de poederachtige trichomen snel over in een gelabelde voorgekoelde buis van 1,5 ml via een voorgekoelde spatel of een scheplepel die in de buis wordt ingebracht (figuur 7). Bewaar de buisjes onmiddellijk bij −80 °C voor verder onderzoek. OPMERKING: Een schematisch werkstroomdiagram met het hele isolatieprotocol wordt gegeven in figuur 8.</li>
</ol>6. Observatie en analyse van de gezuiverde trichomen
<ol><li>Plaats een kleine hoeveelheid (10 mg) geïsoleerde trichomen op een microscoopglaasje met behulp van een voorgekoelde (via LN) spatel. Voeg een druppel water toe en observeer direct op een lichtmicroscoop zonder vlekken. Evalueer de algehele isolatie- en besmettingsgraad met behulp van lage (10x) en hoge (40x) vergrotingen. De verrijking wordt visueel geschat aan de hand van de relatieve hoeveelheid trichomen ten opzichte van niet-trichoomweefsel, zoals weergegeven in figuur 9.</li>
	<li>Voer RNA-extractie en kwaliteitsanalyse uit van 50 mg geïsoleerde C. sativa glandulaire capitulaire capitate gesteelde en sessiele trichomen. OPMERKING: Een commerciële extractiekit (zie tabel met materialen) met een poly-A-gebaseerde strategie van mRNA-zuivering werd gebruikt voor de RNA-extractie.<ol><li>Resuspendeer 50 mg van de geïsoleerde trichomen in de lysisoplossing, vortex gedurende 30 s, soniceer in een ijskoude ultrasone reinigingseenheid bij 35 kHz gedurende 5 minuten en extraheer het mRNA uit de monsters volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel met materialen).</li>
		<li>Om de integriteit van het RNA dat uit de trichomen wordt geëxtraheerd te schatten, bepaalt u de RNA-concentratie, de totale hoeveelheid en de RIN-waarden (RNA Integrity Number) met behulp van een lab-on-a-chip-systeem (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Voer RNAseq-analyse uit van de trichoomfracties (optioneel). RNAseq-analyse en bioinformatica-analyses van gesequencede reads kunnen worden uitgevoerd door standaard outsourcingdiensten</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+plant+trichome+biochemistry+for+the+production+of+useful+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal+for+Cell+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds.</a> Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).</li>
<li>Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-volatile+natural+products+in+plant+glandular+trichomes%3A+chemistry%2C+biological+activities+and+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Reports%22%5BJournal%5D)">Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis.</a> Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).</li>
<li>Fairbairn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+trichomes+and+glands+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22UN+Bulletin+on+Narcotics%22%5BJournal%5D)">The trichomes and glands of Cannabis sativa L.</a> UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).</li>
<li>Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpene+synthases+from+Cannabis+sativa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Terpene synthases from Cannabis sativa.</a> PLoS One. 12 (3), 0173911(2017).</li>
<li>Yerger, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolating+glandular+trichomes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolating glandular trichomes.</a> Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).</li>
<li>Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+histochemical+localization+of+monoterpene+biosynthesis+in+the+glandular+trichomes+of+spearmint+%28Mentha+spicata%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata).</a> Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).</li>
<li>Gershenzon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+secretory+cells+from+plant+glandular+trichomes+and+their+use+in+biosynthetic+studies+of+monoterpenes+and+other+gland+products%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products.</a> Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).</li>
<li>Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Cannabis+sativa+glandular+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome.</a> PLoS One. 16 (4), 0242633(2021).</li>
<li>Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+novel+transcription+factors+involved+in+cannabinoid+biosynthesis+in+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L.</a> Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).</li>
<li>Slone, J. H., Kelsey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+glandular+secretory+cells+from+Artemisia+tridentata+%28ssp.+vaseyana%29+by+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation.</a> American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).</li>
<li>Namdar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terpenoids+and+Phytocannabinoids+Co-Produced+in+Cannabis+Sativa+Strains+Show+Specific+Interaction+for+Cell+Cytotoxic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity.</a> Molecules. 24 (17), 3031(2019).</li>
<li>McDowell, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+functional+genomic+analysis+of+Solanum+glandular+trichome+types%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types.</a> Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).</li>
<li>Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+as+a+signal+to+sort+developing+glandular+trichomes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 949(2016).</li>
<li>Livingston, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabis+glandular+trichomes+alter+morphology+and+metabolite+content+during+flower+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation.</a> The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gland+distribution+and+cannabinoid+content+in+clones+of+Cannabis+sativa+L%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L.</a> American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).</li>
<li>Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+cannabinoids+in+individual+glandular+trichomes+of+Cannabis+sativa+L.+%28Cannabaceae%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae).</a> American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).</li>
<li>Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+glandular+hairs+of+Cannabis+sativa+from+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy.</a> American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).</li>
<li>Marks, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+isolating+large+quantities+of+Arabidopsis+trichomes+for+transcriptome%2C+cell+wall%2C+and+other+types+of+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses.</a> The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).</li>
<li>Huebbers, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+method+for+the+release%2C+enrichment+and+purification+of+high-quality+Arabidopsis+thaliana+rosette+leaf+trichomes+enables+profound+insights+into+the+trichome+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome.</a> Plant Methods. 18 (1), 12(2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Ten opzichte van de momenteel beschikbare trichomenisolatieprotocollen worden in dit protocol twee belangrijke wijzigingen beschreven. Deze omvatten het losmaken van de trichomen van het plantmateriaal met behulp van droogijs in de eerste stap en het vervangen van LN door het veelgebruikte vloeibare buffermedium. De eerste modificatie voor C. sativa trichomenzuivering is gebaseerd op een eerder protocol dat het gebruik van gemalen droogijs introduceerde om de trichomen los te maken van geraniumpedicels<sup class...

Glandulaire trichomen zijn haarachtige structuren die aanwezig zijn in planten die veel secundaire metabolietenbevatten 1 en een waardevolle bank van nieuwe biosynthetische genen en enzymen2 vertegenwoordigen. In cannabis is de biosynthese van de belangrijke secundaire metabolieten, cannabinoïden3 en terpenen4, gelokaliseerd in de trichomen. Gezien de rol van trichomen bij het bepalen van de kwaliteit van cannabis, zowel voor medicinaal als recreatief gebruik, is de studie van trichomengenexpressie van belang. Om de expressie van trichomenspecifieke genen te karakteriseren, moeten de trichomen van belang eerst worden geïsoleerd. Trichoomisolatieprotocollen werden voor het eerst beschreven in 19925, en hun nieuwste ontwikkelingen zijn onlangs beoordeeld2. Over het algemeen kunnen protocollen voor het extraheren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering worden onderverdeeld in twee verschillende opeenvolgende stappen. De eerste stap omvat een grondige fysieke scheiding van de trichomen van het plantenweefsel. Deze stap kan worden uitgevoerd met droogijs5, glasparels met een commercieel apparaat6,7, het vermalen van het plantmateriaal tegen een gaaszeef8, of het vortexen van het plantenweefsel in een isolatiebuffer9. De tweede stap omvat een meer verfijnde scheiding van de trichomen van belang van de microscopische plantenresten en / of andere trichoomsoorten. Deze stap kan worden uitgevoerd met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie 8,10 of zeven van verschillende groottes 7,9. Vanwege de extreme gevoeligheid van RNA in bewerkte weefsels voor afbrekende middelen, worden deze twee opeenvolgende stappen meestal uitgevoerd in het ijskoude isolatiemedium, vaak in aanwezigheid van eiwitremmers4.
Conventionele trichoomisolatieprotocollen vereisen, naast de ijskoude temperaturen, grote hoeveelheden isolatiemedium om een efficiënte extractieprocedure te garanderen. De combinatie van deze componenten resulteert in een moeizaam, tijdrovend isolatieproces dat een hoge doorvoer belemmert. Het presenteren van een eenvoudig, gebruiksvriendelijk alternatief trichome-isolatieprotocol is daarom waarschijnlijk gunstig voor verschillende aspecten die verband houden met trichoomkarakterisering. Het huidige artikel heeft tot doel een alternatief protocol aan te bieden voor het isoleren van gestalkte en sessiele glandulaire capitate trichomen van Cannabis sativa door verschillende elementen uit de conventionele protocollen te combineren en te integreren. Deze elementen omvatten droogijs5, het passeren van de trichomen door verschillende microzeven met afnemende poriegroottes 7,9 en het vervangen van vloeibare stikstof (LN) voor het isolatiemedium8.
De nieuwigheid van het huidige trichomenisolatieprotocol, in vergelijking met conventionele protocollen, presenteert zich op een aantal manieren. Dit protocol is handig, omdat het geen gevaarlijke componenten vereist. De procedure kan in het laboratorium worden uitgevoerd met minimale voorzorgsmaatregelen en vergemakkelijkt een hoge doorvoer. Het vervangen van LN door het standaard vloeibare isolatiemedium zorgt voor de integriteit van de trichomen gedurende het hele isolatieproces, waardoor daaropvolgende transcriptomische analyse mogelijk is. Bij sublimatie van de LN en droogijs blijven de geïsoleerde trichomen vrij van schadelijke resten. Verder maakt de neiging van LN om te sublimeren bij kamertemperatuur het royale gebruik ervan in het hele protocol mogelijk. Het gebruik van grote hoeveelheden conventioneel isolatiemedium levert daarentegen praktische problemen op bij de hantering ervan. Ten slotte vermindert het protocol de scheiding van de schijfcel van de resterende fragiele hoofdstructuur van het glandulaire trichome, waardoor de inhoud van de hoofdruimte behouden blijft.
Dit protocol wordt gepresenteerd op een gedetailleerde stap-voor-stap manier ontworpen om de technische praktijk van het isoleren van C. sativa glandulaire capitate trichomen te ondersteunen. Het protocol biedt een beheersbare workflow die resulteert in geïsoleerde trichomen met een hoge concentratie en zuiverheid die geschikt zijn voor downstream moleculaire analyse.

<table><tbody><tr><td>Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip</td><td>Agilent, Duitsland</td><td>Bestelnummer 5067-1513</td><td>Lab-on-a-chip systeem&nbsp;</td></tr><tr><td>Transsonic-310</td><td>Elma, Duitsland</td><td>D-78224</td><td>Ultrasoon reinigingsapparaat&nbsp;</td></tr><tr><td>TruSeq RNA Sample Prep Kit v2</td><td>Illumina, VS</td><td>RS-122-2001</td><td>Sample voorbereiding voor RNA sequencing bibliotheek</td></tr><tr><td>Spectrum Plant Total RNA Kit&nbsp;</td><td>SIGMA-ALDRICH, VS</td><td>STRN50-1KT</td><td>Plant Total RNA Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met een maaswijdte van 350 &micro;m (40 x 40 cm of groter dan de omtrek van de bloemzeef)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0350n350210</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met maaswijdte van 150 &micro;m (maat 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0150n360465</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met maaswijdte van 105 &micro;m (maat 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0105n320718</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met maaswijdte van 80 &micro;m (maat 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0080n370465</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met maaswijdte van 65 &micro;m (maat 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0065n340715</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Nylon micro-zeef met maaswijdte van 50 &micro;m (maat 30 x 30 cm)</td><td>Sinun Tech, Israël</td><td>r0080n370465</td><td>Nylon&nbsp;schermopening</td></tr><tr><td>Tot 10 g bevroren plantmateriaal (opgeslagen in -80 oC of vloeibare stikstof)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geschikte handschoenen voor het hanteren van lage temperaturen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsbril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mm schermdeurlijst (mug) maas (strook van 30 x 100 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote zeef (kokhals) met gaten van ongeveer 5 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L glazen beker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 blok droog ijs (0,5-1 kg)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamer en hard vlak object</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee 5 L plastic containers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elastieke banden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grote bloemzeef of zeefzeef - bij voorkeur een met een afneembare plastic ring op de omtrek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meerdere grote en kleine roestvrijstalen containers met ronde bodem. Een van hen moet groter zijn dan de omtrek van de bloemzeef (ongeveer 40 cm in diameter), om het verlies van de gezeefde massa buiten de roestvrijstalen container met ronde bodem te minimaliseren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voorgekoelde (via vloeibare stikstof) roestvrijstalen lepel, spatel en schep</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schoon bord</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meerdere wasklemmen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Voorgekoelde (via vloeibare stikstof) gelabelde 1,5 mL buisjes met gaten in het deksel geprikt met een steriele naald</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Twee containers vloeibare stikstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 cm brede schildersborstel</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van cannabis sativa

Non-Aqueous Isolation and Enrichment of Glandular Capitate Stalked and Sessile Trichomes from Cannabis sativa

Dit artikel presenteert een protocol voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. De biosynthetische routes voor cannabinoïde en vluchtig terpeenmetabolisme zijn voornamelijk gelokaliseerd in de Cannabis trichomen, en geïsoleerde trichomen zijn gunstig voor transcriptoomanalyse. De bestaande protocollen voor het isoleren van glandulaire trichomen voor transcriptomische karakterisering zijn onhandig en leveren gecompromitteerde trichoomkoppen en een relatief lage hoeveelheid geïsoleerde trichomen. Bovendien vertrouwen ze op dure apparaten en isolatiemedia die eiwitremmers bevatten om RNA-afbraak te voorkomen. Het huidige protocol stelt voor om drie individuele modificaties te combineren om een grote hoeveelheid geïsoleerde glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen te verkrijgen van respectievelijk C. sativa volwassen vrouwelijke bloeiwijzen en waaierbladeren. De eerste wijziging omvat het vervangen van vloeibare stikstof door het conventionele isolatiemedium om de doorgang van trichomen door de microzeven te vergemakkelijken. De tweede wijziging omvat het gebruik van droogijs om de trichomen los te maken van de plantenbron. De derde modificatie houdt in dat het plantmateriaal achtereenvolgens door vijf microzeven van afnemende poriegroottes wordt geleid. Microscopische beeldvorming toonde de effectiviteit van de isolatietechniek voor beide trichoomtypen. Bovendien was de kwaliteit van RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde trichomen geschikt voor downstream transcriptomische analyse.

De belangrijkste wijziging in dit protocol ten opzichte van conventionele trichoomisolatieprotocollen is het vervangen van het standaard isolatiemedium door LN. Het gebruik van LN als isolatiemedium maakt een ontspannen workflow mogelijk, want zolang de monsters worden ondergedompeld in LN, is metabole degradatie waarschijnlijk niet opgetreden. Bovendien, omdat het protocol de gevaarlijke componenten (d.w.z. aurintricarbonzuur en β-mercaptoethanol) vermijdt die worden gebruikt in traditioneel trichoomisolatiemedium, is h...

Er wordt een protocol gepresenteerd voor de handige en high-throughput isolatie en verrijking van glandulaire capitate stalked en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Het protocol is gebaseerd op een droge, niet-bufferextractie van trichomen met alleen vloeibare stikstof, droogijs en nylonzeven en is geschikt voor RNA-extractie en transcriptomische analyse.

Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa

This paper presents a protocol for the convenient and high-throughput isolation and enrichment of glandular capitate stalked and sessile trichomes from ...

Het belang van het protocol ligt in het gemak ervan in de korte tijd die nodig is voor de voltooiing ervan. Dit maakt een hoge doorvoer, een hoge concentratie en een hoge mate van isolatie van de gesteelde en sessiele trichomen mogelijk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de rechtlijnigheid.Tijdens deze techniek moet men rekening houden met de trichoomdichtheid van de plantenbron en de isolatiegraad bij elke stap met een microscoop inspecteren terwijl het protocol voor de eerste keer wordt uitgevoerd. Deze techniek wordt gedemonstreerd door Nurit Shalev, een expert op het gebied van cannabis van Volcani Center. Begin met het verpletteren van een droogijsblok in kleine, fijne vlokken met behulp van een hamer en een hard, plat voorwerp in een plastic container van vijf liter.Gebruik een grote zeef en zeef de fijne droogijsvlokken van het niet-gemalen droogijs in een andere plastic container van vijf liter. Giet ongeveer 200 kubieke centimeter van de droogijsvlokken in een rechtopstaande glazen beker van één liter. Voeg tot 10 gram bevroren cannabis sativa bloeiwijzen toe aan de eerste laag gemalen droogijs en bedek deze met een extra laag van 200 kubieke centimeter fijng

non-aqueous-isolation-enrichment-glandular-capitate-stalked-sessile

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Antenne-installaties organen zijn beschermd door de cuticula, een supramoleculaire biopolyester-wax montage. We presenteren protocollen bij selectieve verwijdering van epi-en intracuticular was van tomaat fruit nagelriemen op moleculaire en microniveau door solid-state NMR en atomic force microscopie, respectievelijk te controleren, en om de verknoping capaciteit van gemanipuleerde cuticulair biopolyesters te beoordelen.

Isolatie en Biofysische Studie van Fruit nagelriemen

Plantklieren zijn gespecialiseerde structuren die verantwoordelijk zijn voor de biosynthese en secretie van veel verbindingen die betrokken zijn bij interacties met de biotische omgeving. Om studies naar hun moleculaire en biochemische kenmerken mogelijk te maken, werd een mechanische micropreparatietechniek ontwikkeld om enkele metabolisch actieve klieren te isoleren, hier van de vleesetende plant Nepenthes.

Isolatie van levensvatbare meercellige klieren uit weefsel van de vleesetende plant, Nepenthes

Lipide polyesters vormen de structurele componenten van twee celwandmodificaties, de plantencuticula en suberine-bevattende diffusiebarriers. In deze video beschrijven we een methode om cutine te depolymeriseren uit volledig ontvette bladeren. De methode kan worden toegepast op het onderzoeken van mutanten die beperkt zijn in de biosynthese van cutine of suberine.

Isolatie en analyse van de samenstelling van de Plant Nagelriem Lipid Polyester Monomeren

Dit protocol / manuscript beschrijft een gestroomlijnde werkwijze voor de productie van sporopollenin exine capsules (SEC) van Lycopodium clavatum sporen en voor het laden van hydrofiele stoffen in deze SEC.

Extractie van Plant-gebaseerde Capsules voor Micro-inkapseling Applications

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.

Voorbijgaande expressie in Nicotiana Benthamiana verlaat voor de productie van de Triterpene op een voorbereidende schaal

Ultrasoon-geassisteerde extractie (VAE) verhoogt de extractie-efficiëntie van oplosmiddelen en wanneer toegepast op Cannabis spp. biomassa vermindert het de tijd die nodig is voor extractie. Dit verlaagt de kosten en het potentiële verlies van cannabinoïden als gevolg van degradatie. Bovendien wordt de VAE beschouwd als een groene methode vanwege het lage gebruik van oplosmiddelen.

Ultrasoon-geassisteerde extractie van cannabidiolzuur uit cannabisbiomassa

Het huidige artikel heeft tot doel gedetailleerde en adequate protocollen te bieden voor de isolatie van plant-geassocieerde endofytische schimmels, langdurige bewaring van isolaten, morfologische karakterisering en totale DNA-extractie voor daaropvolgende moleculaire identificatie en metagenomische analyses.

Isolatie, karakterisering en totale DNA-extractie om endofytische schimmels in mycoheterotrofe planten te identificeren

We beschrijven een eenvoudige maar zeer reproduceerbare methode om extracellulair RNA te isoleren van het bladoppervlak en de apoplast van Arabidopsis-planten.

Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om extracellulaire vesikels (EV's) uit Arabidopsis thaliana-bladeren te isoleren ter ondersteuning van downstream moleculaire en functionele analyses.

Isolatie en zuivering van extracellulaire plantblaasjes uit Arabidopsis-bladeren met behulp van een geoptimaliseerde apoplastische wasverzamelmethode

Leer een niet-waterige methode voor de isolatie en verrijking van klierachtige gesteelde en sessiele trichomen van Cannabis sativa. Deze techniek gebruikt vloeibare stikstof en droog ijs voor hoogdoorvoer RNA-extractie.

Niet-waterige isolatie en verrijking van glandulaire capitate gestalkte en sessiele trichomen van Cannabis sativa

Meer video's verkennen