Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Dit protocol registreert met succes de effecten van de aconitine op de IKv van H9C2-cellen. Het bevorderen van nieuwe fasen voor het onderzoeken van het mechanisme van cardiotoxiciteit van geneesmiddelen vanuit het perspectief van ionkanalen. De whole-cell patch-clamp techniek is de gouden standaard van ionkanaalonderzoek met een hoge gevoeligheid, hoge precisie en hoge specificiteit.

De whole-cell patch-clamp-techniek kan worden gebruikt om de farmacologische of toxische mechanismen van juxta gating specifieke ionkanalen voor multisysteemziekten, zoals het cardiovasculaire systeem en het zenuwstelsel, te verkennen. Om te beginnen, verteer de cellen met 0,25% trypsine gedurende 30 seconden, zodra de H9C2-cultuurschaal 80% samenvloeiend wordt. Kweek 2 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter met normaal medium of medicijn bevattend medium in een schaal van 35 millimeter bedekt met glasplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius, met een 5% koolstofdioxideatmosfeer en 70 tot 80% relatieve vochtigheid.

Zet de micropipettetrekker aan en verwarm 30 minuten voor. Plaats vervolgens een borosilicaatglas capillair met een gloeidraad op de micropipettetrekker. Selecteer het programma en klik op enter op het configuratiescherm.

Klik op het oprijplaatprogramma in de rechterbovenhoek om de warmtewaarde van het glazen capillair te bepalen. Schrijf het programma voor het trekken van de elektrode volgens de waarde die wordt bepaald door de ramptest en klik op pull om te beginnen met het fabriceren van de pipetten. Schakel de digitale analoge converter, de signaalversterker, de micromanipulator, de microscoop en de camera in.

Open de imaging applicatie, de signaalversterker software en de data acquisitie software in volgorde. Klik op acquire en selecteer edit protocol in de data acquisitie software. Bewerk het programma in de golfvorminterface.

Voer waarden in voor het eerste niveau, deltaniveau, de eerste duur en de deltaduur voor tijdperk A, tijdperk B en tijdperk C.Klik vervolgens op de interface voor de modussnelheid en stel de gegevens van de proefhiërarchie in. Klik vervolgens op protocol bewerken om de stimulusknop te selecteren en stel het lekaftrekprogramma in het dialoogvenster PM-lekaftrek in. Om het pad voor gegevensopslag vast te stellen, klikt u op bestand en selecteert u namen van gegevensbestanden instellen in de software voor gegevensverzameling.

Open vervolgens het gevestigde lKv-protocol door acquire te selecteren en op open protocol te klikken in de data-acquisitiesoftware. Klik ten slotte op de optie tools en selecteer membraantest om het protocol uit te voeren. Voeg de extracellulaire oplossing toe aan het celbad op het patchklemapparaat voor de hele cel en plaats de afdekselslip omhoog met de H9C2-cellen in het bad.

Vul 30% van de pipet met de extracellulaire oplossing en installeer deze op de opname-elektrodehouder die in het patchklemapparaat is geïntegreerd. Draai de pipet vast met de opname-elektrodehouder. Laat de pipet vervolgens met de micromanipulator in het bad vallen.

Klik op de pipet offset interface van de signaalversterker software om de lKv stroom baseline op nul picoamps te houden. Lever handmatig een geschikte overdruk met een spuit van 1,0 milliliter, aangesloten op de opname-elektrodehouder, via een plastic buis. Beweeg de pipet iets door de micromanipulator in drie dimensies te manipuleren om contact te maken met de cel.

Zodra de membraantest de blokgolf met een derde tot de helft daalt nadat de pipet het celmembraan heeft aangeraakt, verwijdert u de positieve druk en levert u handmatig een geschikte negatieve druk. Klik vervolgens op de patchinterface van de data-acquisitiesoftware om de gigaseal te vormen. Gebruik de capaciteitscompensatie snel en capaciteitscompensatie langzame signaalversterkersoftware tijdens het celplafond om de snelle en langzame capaciteit te compenseren.

Pas korte pulsen van negatieve druk toe om een stukje van het celmembraan te scheuren. Voer compensatie voor het membraan van de hele cel uit door op de knop voor de hele cel van de signaalversterkersoftware te klikken. Sla ten slotte de gegevens op en neem deze op door op de knop gegevensregistratie te klikken.

Open de opgeslagen lKv-gegevens met de data-analysesoftware. Sla de huidige spanningsrelaties op. Klik op analyseren om statistieken te selecteren.

Selecteer het bereik als Cursors 1 2 voor gegevensanalyse, klik op de knoppen piekamplitude en gemiddelde en klik vervolgens op OK om de gegevens op de resultatenpagina te bekijken. Kopieer ten slotte de kolom met lKv-gemiddelde gegevens naar de functietekensoftware voor verdere analyse. Sla de representatieve lKv-stroomsporen op.

Klik op bewerken om overdrachtssporen te selecteren en selecteer vervolgens de volledige tracering in de regio die u wilt overbrengen. Klik vervolgens op selecteren in traceerselectie en selecteer IN 0 in signalen. Klik ten slotte op ok om de gegevens op de resultatenpagina te bekijken en kopieer de totale gegevens naar de functietekensoftware om de huidige sporen te tekenen.

Sla het lKv-protocol op. Klik op bewerken om stimulusgolfvormsignaal maken te selecteren en ok te selecteren. Herhaal vervolgens de stap voor het tekenen van stroomsporen zonder het signaal te selecteren.

De lKv werd geactiveerd door 150 milliseconden depolariserende pulsstimulus van min 40 tot plus 60 millivolt bij een potentieel van min 60 millivolt. De lKv van de H9C2 rat cardiomyocyten, verscheen eerst rond min 20 millivolt, en vervolgens nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. In vergelijking met de controlegroep was de lKv-amplitude waarneembaar verminderd na de vijf minuten behandeling met 1,5 millimolar 4-AP.

Bovendien daalde de lKv significant bij membraanpotentialen van 10 tot 60 millivolt op een dosisafhankelijke manier, na de 24 uur AC-behandeling. De individuele cel na het opnemen van het ionkanaal, kan worden gebruikt voor verdere eencellige omics-beoordeling, zoals single-cell genomics, transcriptomics, proteomics en de metabolomics.