Name: Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer de whole-cell patch-clamptechniek voor spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten. Deze methode onderzoekt cardiotoxiciteit via ionkanaalmechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82130113) en het Key R &D and Transformation Program van de afdeling Wetenschap & Technologie van de provincie Qinghai (2020-SF-C33).

De commercieel verkregen H9c2 rat cardiomyocyten (zie de tabel van materialen) werden geïncubeerd in DMEM met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een 5% CO2 bevochtigde atmosfeer. De whole-cell patch-clamp techniek werd vervolgens gebruikt om de veranderingen in IKv in normale H9c2 cellen en 4-AP- of AC-behandelde cellen te detecteren (figuur 1 en figuur 2).
1. Oplossingsvoorbereiding
<ol><li>Bereid het DMEM-celkweekmedium met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid 1,5 M 4-AP-oplossing door 14,1165 mg 4-AP toe te voegen aan 100 μL DMSO-oplossing (zie materiaaltabel). Verdun 1,5 M 4-AP tot 1,5 mM door toevoeging van de extracellulaire oplossing (stap 1.5).</li>
	<li>Bereid 400 mM AC door 5 mg AC toe te voegen aan 19,36 μL DMSO-oplossing (zie materiaaltabel). OPMERKING: Alle bovenstaande oplossingen zijn bewaard in een koelkast van 4 °C en de eindconcentratie van de DMSO mag niet hoger zijn dan 0,1% (v/v).</li>
	<li>Bereid 50 ml intracellulaire oplossing door toevoeging van 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) en 0,1900 g EGTA (10,0 mM) in 50 ml dubbel gedestilleerd water (zie tabel 1 en tabel met materialen). OPMERKING: De pH-waarde van de intracellulaire oplossing werd aangepast tot 7,2 met behulp van 1 M KOH en werd gealiquoteerd in kleine volumes (1,5-2 ml) en bewaard bij −20 °C.</li>
	<li>Bereid 50 ml extracellulaire oplossing door toevoeging van 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) en 0,0990 g D-glucose (10,0 mM) tot 50 ml dubbel gedestilleerd water (zie tabel 1 en materiaaltabel). OPMERKING: De extracellulaire oplossing moet worden bereid voor onmiddellijk gebruik en de pH-waarde moet worden aangepast naar 7,4 met behulp van 1 M NaOH.</li>
</ol>2. Celkweek
<ol><li>Zodra het H9c2-kweekgerecht 80% confluent wordt, verteer je de cellen met 0,25% trypsine gedurende 30 s.</li>
	<li>Kweek 2 x 105 cellen/ml met normaal medium of geneesmiddelbevattend medium (25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM AC) in een schaal van 35 mm die gedurende 24 uur is bekleed met glasplaten bij 37 °C, met een CO2-atmosfeer van 5% en een relatieve vochtigheid van 70% tot 80% (zie materiaaltabel).</li>
</ol>3. Fabricage van micropipettes
<ol><li>Zet de micropipettetrekker aan (zie Materiaaltabel) en verwarm 30 minuten voor.</li>
	<li>Leg een capillair borosilicaatglas met een gloeidraad (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm lengte) op de micropipettetrekker. Selecteer het programma dat is ingesteld in stap 3.3 en klik op Enter op het configuratiescherm. Klik op het Ramp-programma in de rechterbovenhoek om de "Heat" -waarde van het glazen capillair te bepalen.</li>
	<li>Schrijf het programma voor het trekken van de elektrode volgens de waarde bepaald door de "Ramp" -test en gebruik de volgende stappen: "Heat" -waarde = "Ramp" -waarde, Pull = 0, Vel = trekstangbewegingssnelheid, Tijd = 200-250. Klik op Pull om te beginnen met het fabriceren van de pipetten. OPMERKING: Observeer de kleur van de droogmiddelen in de verzegelde container van de micropipettetrekker voordat u deze gebruikt. Als de kleur verandert van blauw naar roze, moeten de droogmiddelen worden vervangen. Om verontreiniging van de elektrodepunt te voorkomen, probeert u het middelste deel van het glazen capillair niet aan te raken tijdens de pipetvoorbereiding. Verwijder vervolgens voorzichtig de geproduceerde pipetten en plaats ze in een gesloten en verzegelde container.</li>
</ol>4. Instrument instellen
<ol><li>Schakel de overeenkomstige instrumenten in de volgende volgorde in: de digitaal-analoge converter, de signaalversterker, de micromanipulator, de microscoop en de camera (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Open de beeldbewerkingstoepassing, de signaalversterkersoftware en de data-acquisitiesoftware achtereenvolgens (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Het instrument moet sequentieel worden ingeschakeld; anders verschijnt de status "Demo Digitizer" na het openen van de software.</li>
</ol>5. IKv parameter instelling
<ol><li>Bewerk het protocol voor het opnemen van de IKv volgens de onderstaande stappen.<ol><li>Klik op Bewerken en selecteer Protocol bewerken in de software voor gegevensverzameling (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Bewerk het programma in de interface "Waveform": Epoch A (Eerste niveau = −60 mV, Deltaniveau = 0 mV, Eerste duur = 20 ms en Deltaduur = 0 ms); Tijdvak B (eerste niveau = −40 mV, deltaniveau = 10 mV, eerste duur = 150 ms en deltaduur = 0 ms) en tijdperk C (eerste niveau = −60 mV, deltaniveau = 0 mV, eerste duur = 30 ms en deltaduur = 0 ms).</li>
		<li>Klik vervolgens op de interface Modus/Snelheid en stel de gegevens "Trial Hierarchy" in: Trial delay = 0 s, Runs = 1, Sweeps = 11 en Sweep duration = 0.22 s22,23. OPMERKING: Verkrijg de IKv-kanaalstromen door 150 ms depolariserende stappen toe te passen van −40 mV tot +60 mV met een toename van 10 mV bij een holdingpotentiaal van −60 mV onder controleomstandigheden. De totale tijd van het protocol moet groter zijn dan de tijd die is ingesteld in het programma "Waveform".</li>
	</ol></li>
	<li>Bewerk het P/N Leak Subtracction programma: klik op Edit Protocol om de Stimulus knop te selecteren, en stel het leak subtracction programma in het P/N Leak Subtracction dialoogvenster: aantal Subsweeps = 2-8 (4 in deze studie), Settle time = 100-1.000 ms (200 in deze studie), "Polarity" = "Opposite to waveform", holding level = −80 mV. OPMERKING: De P/N Leak-aftrekking moet een holdingniveau hebben dat lager is dan het "Eerste bedrijf" (−60 mV).</li>
</ol>6. Whole-cell patch-clamp opname van de I Kv in spanning-klem modus
<ol><li>Stel het pad voor gegevensopslag in: klik op Bestand en selecteer Namen van gegevensbestanden instellen in de software voor gegevensverzameling. Open het vastgestelde IKv-protocol (stap 5.1) door Bewerken te selecteren en op Open Protocol te klikken in de software voor gegevensverzameling. Klik ten slotte op de optie Extra en selecteer Membraantest om het protocol uit te voeren.</li>
	<li>Voeg de extracellulaire oplossing (stap 1.5) toe aan het celbad op het patchklemapparaat voor de hele cel (zie Materiaaltabel) en plaats de afdeksel omhoog met de H9c2-cellen (gekweekt in stap 2.1) in het bad.</li>
	<li>Vul 30% van de pipet (vervaardigd in stap 3) met de extracellulaire oplossing en installeer deze op de opname-elektrodehouder die in het patchklemapparaat is geïntegreerd. Draai de pipet aan met de o-ring rubberen pakking en plastic ring. Laat vervolgens de pipet in het bad vallen met de micromanipulator. Klik op de pipetverschuivingsinterface van de signaalversterkersoftware (zie Materiaaltabel) om de huidige basislijn van IKv op 0 pA te houden. OPMERKING: De intracellulaire oplossing (stap 1.4) moet in contact komen met het AgCl/Ag-gedeelte van de zilverdraad en de zilverdraad mag zich niet dicht bij de binnenwand van de pipet bevinden. De weerstand van de pipet moet 2-6 MΩ zijn. Om occlusie van de pipetpunt te voorkomen, moet een continue positieve druk op de pipet worden uitgeoefend met behulp van een spuit van 1,0 ml die via plastic buis24 op de opname-elektrodehouder is aangesloten.</li>
	<li>Lever handmatig een geschikte overdruk met een spuit van 1,0 ml die via een plastic buis op de opname-elektrodehouder is aangesloten. Beweeg de pipet iets door de micromanipulator in drie dimensies te manipuleren om contact te maken met de cel.</li>
	<li>Zodra de blokgolf van de membraantest met 1/3 tot 1/2 daalt nadat de pipet het celmembraan heeft geraakt, verwijdert u de overdruk en levert u handmatig een geschikte negatieve druk. Klik vervolgens op de Patch-interface van de data-acquisitiesoftware om het GΩ-zegel te vormen. Gebruik de signaalversterkersoftware "Cp Fast" en "Cp Slow" tijdens het afdichten van cellen om de snelle en langzame capaciteit te compenseren. OPMERKING: Wanneer de membraantest wordt ≥1 GΩ, wordt een celgebonden configuratie gevormd tussen de pipetpunt en de cel.</li>
	<li>Pas korte pulsen van negatieve druk toe om een stukje van het celmembraan te scheuren. OPMERKING: Een snelle vermindering van de membraanweerstand kenmerkt een succesvol opnamepatroon voor de hele cel. Als de toegangsweerstand (Ra) ≥30 MΩ, moeten de cellen opnieuw worden gekozen voor stap 6.3-6.6. Om de nauwkeurigheid van de geregistreerde IKv-gegevens te garanderen, moet de negatieve druk worden verwijderd nadat het celmembraan is verbroken.</li>
	<li>Voer compensatie van de hele celmembraancapaciteit uit door op de knop Hele cel van de signaalversterkersoftware te klikken. Sla ten slotte de gegevens op en neem deze op door op de knop Gegevensopname te klikken.</li>
	<li>Open de opgeslagen IKv-gegevens met de data-analysesoftware. Sla de stroomspanningsrelaties (I−V) op: klik op Analyseren om Statistieken te selecteren om het volgende te doen: selecteer het bereik als Cousors 1,2 voor gegevensanalyse; klik op de knoppen Piekamplitude en Gemiddelde en klik vervolgens op OK om de gegevens op de pagina Resultaten te bekijken. Kopieer ten slotte de kolom van IKv-gemiddeldegegevens naar de functietekensoftware (zie Materiaaltabel) voor verdere analyse.</li>
	<li>Sla de representatieve IKv huidige sporen op: klik op Bewerken om Traces overzetten te selecteren; selecteer vervolgens de volledige tracering in de regio die u wilt overbrengen; klik vervolgens op Selecteren in Trace selectie en selecteer IN 0 (pA) in Signalen; klik ten slotte op OK om de gegevens op de pagina "Resultaten" te bekijken en kopieer de totale gegevens naar de functietekensoftware om de huidige sporen te tekenen.</li>
	<li>Sla het IKv-protocol op: klik op Bewerken om Stimulus Waveform Signal maken te selecteren en selecteer OK. Voer vervolgens stap 6.9 opnieuw uit, behalve voor het selecteren van A0 # 0 (mA) in "Signalen".</li>
</ol>

<ol><li>Luan, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+transport+and+ion+channels+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Scientiarum+Naturalium+Universitatis+Intramongoljcae%22%5BJournal%5D)">Passive transport and ion channels in biofilms.</a> Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).</li>
<li>Lei, M., Sun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+mechanism+of+arrhythmia+induced+by+sodium+channel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease.</a> Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).</li>
<li>Varró, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+transmembrane+ion+channels+and+action+potentials%3A+Cellular+physiology+and+arrhythmogenic+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior.</a> Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).</li>
<li>Campuzano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+autopsy+and+sudden+cardiac+death%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Negative autopsy and sudden cardiac death.</a> International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).</li>
<li>Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sodium+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflu%CC%88gers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac sodium channelopathies.</a> Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).</li>
<li>Benitah, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+gated+Ca2%2B+currents+in+the+human+pathophysiologic+heart%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review.</a> Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).</li>
<li>Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+dissection+of+multiple+ionic+currents+in+single+cardiac+myocytes+under+action+potential-clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).</li>
<li>Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+functional+myocardial+potassium+channel+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Electrophysiology+Clinics%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity.</a> Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).</li>
<li>Grant, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac ion channels.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).</li>
<li>Olson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv1.5+channelopathy+due+to+KCNA5+loss-of-function+mutation+causes+human+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation.</a> Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).</li>
<li>Christophersen, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+KCNA5%3A+impact+on+the+atrial-specific+potassium+current+IKur+in+patients+with+lone+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation.</a> European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).</li>
<li>Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+knockout+of+the+transient+outward+current%2C+long-QT+syndrome%2C+and+cardiac+remodeling+in+mice+expressing+a+dominant-negative+Kv4+alpha+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit.</a> Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).</li>
<li>Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+ancillary+subunits+on+ventricular+repolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization.</a> Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).</li>
<li>Jia, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+studies+on+the+application+of+patch-clamp+technique+in+cellular+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Engineering+of+Chinese+Universities%22%5BJournal%5D)">Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology.</a> Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).</li>
<li>Leuthardt, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+electrocorticographic+speech+network+to+control+a+brain-computer+interface+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans.</a> Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).</li>
<li>Tian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+applying+progress+of+patch-clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Jilin+Medical+University%22%5BJournal%5D)">The applying progress of patch-clamp technique.</a> Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).</li>
<li>Wang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+shensong+yangxin+capsule+on+c-type+Kv1.4+potassium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel.</a> Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).</li>
<li>Huang, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+resveratrol+on+Kv2.1+potassium+channels+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Cardiac+Pacing+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes.</a> Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neferine+on+Kv4.3+channels+expressed+in+HEK293+cells+and+ex+vivo+electrophysiology+of+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine%3A+A+review+of+its+pharmacokinetics%2C+pharmacology%2C+toxicology+and+detoxification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification.</a> Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270(2022).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+efficacy+and+toxicity+of+aconitine%3A+A+new+frontier+for+the+ancient+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison.</a> Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).</li>
<li>An, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+tegaserod%2C+a+gastrokinetic+agent%2C+on+voltage-gated+K%2B+channels+in+rabbit+coronary+arterial+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells.</a> Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).</li>
<li>Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+Kv2.1+by+BACE1+decreases+potassium+current+and+reduces+neuronal+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis.</a> Neurochemistry International. 155, 105310(2022).</li>
<li>Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+and+multi-electrode+array+electrophysiological+analysis+in+acute+mouse+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100442(2021).</li>
<li>Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+pressure-clamped+patch-clamp+recording+at+the+node+of+Ranvier+of+rat+myelinated+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100266(2021).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+purity+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+electrophysiological+properties+of+action+potentials+and+ionic+currents%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).</li>
<li>Yoshimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+in+vivo+patch-clamp+technique+to+pharmacological+analysis+of+synaptic+transmission+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nihon+Yakurigaku+Zasshi.+Folia+Pharmacologica+Japonica%22%5BJournal%5D)">Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS.</a> Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).</li>
<li>Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+and+perforated+patch-clamp+recordings+from+acutely-isolated+murine+sinoatrial+node+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells.</a> Bio-protocol. 10 (1), 3478(2020).</li>
<li>Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+problems+with+in+vitro+screening+of+drugs+for+QT+interval+prolongation+using+HERG+K%2B+channels+expressed+in+mammalian+cell+lines+and+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+whole-cell+patch-clamp+configuration+on+the+pharmacological+assessment+of+the+hERG+channel%3A+Trazodone+as+a+case+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).</li>
<li>Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+in+vivo+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Remedies+%26+Clinics%22%5BJournal%5D)">The development of in vivo patch clamp technique.</a> Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).</li>
<li>Lin, Y. F., Ouyang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Strait+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Research progress and application of patch clamp technique.</a> Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+current+advances+on+pharmacology%2C+pharmacokinetics%2C+toxicity+and+detoxification+of+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115(2022).</li>
<li>Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chinese+herbal+medicines+revisited%3A+A+Hong+Kong+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective.</a> Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).</li>
<li>Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+updated+meta-analysis+based+on+the+preclinical+evidence+of+mechanism+of+aconitine-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity.</a> Frontiers in Pharmacology. 13, 900842(2022).</li>
<li>Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Shenyang+Pharmaceutical+University%22">Shenyang Pharmaceutical University</a>. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aconitine+blocks+HERG+and+Kv1.5+potassium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ethnopharmacology%22%5BJournal%5D)">Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels.</a> Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).</li>
<li>Campbell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+kinetics+and+selectivity+of+sodium+channels+in+frog+skeletal+muscle+fibers+treated+with+aconitine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine.</a> The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).</li>
<li>Huang, X. Y., Ying, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+specific+protein+1+on+Kv2.1+potassium+channel+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electrocardiology+and+Circulation%22%5BJournal%5D)">The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes.</a> Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).</li>
<li>Cao, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+patch+clamp+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Yuncheng+University%22%5BJournal%5D)">Development and application of patch clamp technique.</a> Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De patch-clamp elektrofysiologische techniek wordt voornamelijk gebruikt om de elektrische activiteit en functionele kenmerken van ionkanalen op het celmembraan te registreren en weer te geven25. Op dit moment omvatten de belangrijkste opnamemethoden van de patch-clamp-techniek eenkanaalsopname en hele celopname26. Voor de hele celmodus worden de glasmicro-elektrode en negatieve druk gebruikt om een zeer resistente afdichting te vormen tussen een klein deel van het celmembr...

Ionkanalen zijn speciale geïntegreerde eiwitten ingebed in de lipide bilayer van het celmembraan. In aanwezigheid van activatoren vormen de centra van dergelijke speciale geïntegreerde eiwitten zeer selectieve hydrofiele poriën, waardoor ionen van de juiste grootte en lading op een passieve transportmanier kunnen passeren1. Ionkanalen vormen de basis van celexcitabiliteit en bio-elektriciteit en spelen een sleutelrol in een verscheidenheid aan cellulaire activiteiten2. Het hart levert bloed aan andere organen door regelmatige samentrekkingen als gevolg van een excitatie-contractie-gekoppeld proces geïnitieerd door actiepotentialen3. Eerdere studies hebben bevestigd dat het genereren van actiepotentialen in cardiomyocyten wordt veroorzaakt door de verandering in intracellulaire ionenconcentratie, en de activering en inactivatie van Na+, Ca2+ en K+ ionkanalen in menselijke cardiomyocyten leiden tot de vorming van actiepotentialen in een bepaaldevolgorde 4,5,6. Verstoorde spanningsafhankelijke kalium (Kv) kanaalstromen (IKv) kunnen het normale hartritme veranderen, wat leidt tot aritmieën, die een van de belangrijkste doodsoorzaken zijn. Daarom is het opnemen van de IKv van cruciaal belang voor het begrijpen van de mechanismen van geneesmiddelen voor de behandeling van levensbedreigende aritmieën7.
Het Kv-kanaal is een belangrijk onderdeel van het kaliumkanaal. De coördinatiefunctie van het Kv-kanaal speelt een belangrijke rol in de elektrische activiteit en myocardiale contractiliteit van het zoogdierhart 8,9,10. Bij cardiomyocyten zijn de amplitude en de duur van de actiepotentialen afhankelijk van de cogeleiding van uitgaande K+-stromen door meerdere Kv-kanaalsubtypen11. De regulatie van de Kv-kanaalfunctie is erg belangrijk voor de normale repolarisatie van het cardiale actiepotentiaal. Zelfs de kleinste verandering in Kv-geleiding heeft een grote invloed op cardiale repolarisatie en verhoogt de kans op aritmie12,13.
Vertegenwoordigend een fundamentele methode in cellulair elektrofysiologisch onderzoek, kan een hoge weerstandsafdichting tussen een klein deel van het celmembraan en een pipetpunt voor de registratie van de hele cel patchklem worden vastgesteld door een negatieve druk toe te passen. De continue onderdruk zorgt ervoor dat het celmembraan in contact komt met de pipetpunt en op de binnenwand van de pipet blijft plakken. Het resulterende volledige elektrische circuit maakt het mogelijk om elke enkele ionkanaalstroom over het oppervlak van het celmembraan te registreren14. Deze techniek heeft een zeer hoge gevoeligheid voor de ionkanaalstroom van het celmembraan en kan worden gebruikt om stromen in alle ionkanalen te detecteren, en de toepassingen zijn extreem breed15. Bovendien heeft patch-clamp, in vergelijking met fluorescerende etikettering en radioactieve etikettering, een hogere autoriteit en nauwkeurigheid16. Op dit moment is de whole-cell patch-clamp-techniek gebruikt om de traditionele Chinese medicijncomponenten te detecteren die werken op Kv-kanaalstromen 17,18,19. Wang et al. gebruikten bijvoorbeeld de whole-cell patch-clamp-techniek en bevestigden dat de effectieve component van het lotuszaad de remming van het Kv4.3-kanaal zou kunnen bereiken door de geactiveerde toestandskanalen19 te blokkeren. Aconitine (AC) is een van de effectieve en actieve ingrediënten van Aconitum-soorten, zoals Aconitum carmichaeli Debx en Aconitum pendelbusch. Talrijke studies hebben aangetoond dat overdoses van AC aritmieën en zelfs hartstilstand kunnen veroorzaken20. De interactie tussen AC- en spanningsafhankelijke ionkanalen leidt tot de verstoring van intracellulaire ionhomeostase, het belangrijkste mechanisme van cardiotoxiciteit21. Daarom wordt in deze studie de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van AC op de IKv van cardiomyocyten te bepalen.

<table><tbody><tr><td>4-Aminopyridine</td><td>Sigma</td><td>MKCJ2184</td><td></td></tr><tr><td>Aconitine</td><td>Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd</td><td>DSTDW000602</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>Sartorius</td><td>124S-CW</td><td></td></tr><tr><td>ATP Na2</td><td>Solarbio</td><td>416O022</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)&nbsp;</td><td>Sutter Instrument</td><td>163225-5</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (100 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (35 mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>3012022</td><td></td></tr><tr><td>Clampex software</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Version 10. 5</td><td></td></tr><tr><td>Clampfit software</td><td>Molecular Devices, LLC.</td><td>Version 10. 6. 0. 13</td><td>data acqusition software</td></tr><tr><td>D-(+)-glucose</td><td>Rhawn</td><td>RH289133</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instrument</td><td>Axon digidata 1550B</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (1x)</td><td>Gibco</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Biofroxx</td><td>EZ6789D115</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-1000</td><td></td></tr><tr><td>H9c2 cells</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0111</td><td></td></tr><tr><td>HCImageLive</td><td>Hamamatsu</td><td>4.5.0.0</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd</td><td>2106081</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd</td><td>20210221</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020082501</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2020112601</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute</td><td>20160408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>Chengdu Colon Chemical Co., Ltd</td><td>2021020101</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285A</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Microscope cover glass (20 &times; 20 mm)</td><td>Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd</td><td>80340-0630</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd</td><td>Milli-Q IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B commander</td><td>Axon Instrument</td><td>MultiClamp commander 2.0</td><td>signal-amplifier software&nbsp;</td></tr><tr><td>OriginPro 8 software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>PH&nbsp;meter&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>S201K</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25% (1x)</td><td>HyClone</td><td>J210045</td><td></td></tr></tbody></table>

spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op h9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique

Kaliumkanalen op het myocardiale celmembraan spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celelektrofysiologische activiteiten. Omdat het een van de belangrijkste ionkanalen is, zijn voltage-gated kalium (Kv) -kanalen nauw verbonden met sommige ernstige hartaandoeningen, zoals door geneesmiddelen geïnduceerde myocardiale schade en een hartinfarct. In deze studie werd de whole-cell patch-clamp techniek gebruikt om de effecten van 1,5 mM 4-aminopyridine (4-AP, een breedspectrum kaliumkanaalremmer) en aconitine (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM en 200 μM) op de Kv-kanaalstroom (IKv) in H9c2-cardiomyocyten te bepalen. Het bleek dat 4-AP de IKv met ongeveer 54% remde, terwijl het remmende effect van AC op de IKv een dosisafhankelijke trend vertoonde (geen effect voor 25 μM, 30% remmend tarief voor 50 μM, 46% remmend tarief voor 100 μM en 54% remmend tarief voor 200 μM). Vanwege de kenmerken van hogere gevoeligheid en precisie, zal deze techniek de verkenning van cardiotoxiciteit en de farmacologische effecten van etnomedicine gericht op ionkanalen bevorderen.

Dit protocol maakte de opname van de IKv mogelijk volgens de parameters die zijn ingesteld in de hele-cel patch-clamp techniek. De IKv werd geactiveerd door 150 ms depolariserende pulsstimulus van −40 tot +60 mV bij een houdpotentiaal van −60 mV (figuur 3A). De IKv van de H9c2 rat cardiomyocyten verscheen eerst rond -20 mV, en daarna nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. De gemiddelde relatie tussen de IKv en de membraanpotentiaal werd be...

Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor de real-time en dynamische acquisitie van voltage-gated kalium (Kv) kanaalstromen in H9c2 cardiomyocyten met behulp van de whole-cell patch-clamp techniek.

Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Potassium channels on the myocardial cell membrane play an important role in the regulation of cell electrophysiological activities. Being one of the main ...

Dit protocol registreert met succes de effecten van de aconitine op de IKv van H9C2-cellen. Het bevorderen van nieuwe fasen voor het onderzoeken van het mechanisme van cardiotoxiciteit van geneesmiddelen vanuit het perspectief van ionkanalen. De whole-cell patch-clamp techniek is de gouden standaard van ionkanaalonderzoek met een hoge gevoeligheid, hoge precisie en hoge specificiteit.De whole-cell patch-clamp-techniek kan worden gebruikt om de farmacologische of toxische mechanismen van juxta gating specifieke ionkanalen voor multisysteemziekten, zoals het cardiovasculaire systeem en het zenuwstelsel, te verkennen. Om te beginnen, verteer de cellen met 0,25% trypsine gedurende 30 seconden, zodra de H9C2-cultuurschaal 80% samenvloeiend wordt. Kweek 2 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter met normaal medium of medicijn bevattend medium in een schaal van 35 millimeter bedekt met glasplaten gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius, met een 5% koolstofdioxideatmosfeer en 70 tot 80% relatieve vochtigheid.Zet de micropipettetrekker aan en verwarm 30 minuten voor. Plaats vervolgens een borosilicaatglas capillair met een gloeidraad op de micropipettetrekker. Selecteer het programma en klik op enter op het configuratiescherm.Klik op het oprijplaatprogramma in de rechterbovenhoek om de warmtewaarde van het glazen capillair te bepalen. Schrijf het programma voor het trekken van de elektrode volgens de waarde die wordt bepaald door de ramptest en klik op pull om te beginnen met het fabriceren van de pipetten. Schakel de digitale analoge converter, de signaalversterker, de micromanipulator, de microscoop en de camera in.Open de imaging applicatie, de signaalversterker software en de data acquisitie software in volgorde. Klik op acquire en selecteer edit protocol in de data acquisitie software. Bewerk het programma in de golfvorminterface.Voer waarden in voor het eerste niveau, deltaniveau, de eerste duur en de deltaduur voor tijdperk A, tijdperk B en tijdperk C.Klik vervolgens op de interface voor de modussnelheid en stel de gegevens van de proefhiërarchie in. Klik vervolgens op protocol bewerken om de stimulusknop te selecteren en stel het lekaftrekprogramma in het dialoogvenster PM-lekaftrek in. Om het pad voor gegevensopslag vast te stellen, klikt u op bestand en selecteert u namen van gegevensbestanden instellen in de software voor gegevensverzameling.Open vervolgens het gevestigde lKv-protocol door acquire te selecteren en op open protocol te klikken in de data-acquisitiesoftware. Klik ten slotte op de optie tools en selecteer membraantest om het protocol uit te voeren. Voeg de extracellulaire oplossing toe aan het celbad op het patchklemapparaat voor de hele cel en plaats de afdekselslip omhoog met de H9C2-cellen in het bad.Vul 30% van de pipet met de extracellulaire oplossing en installeer deze op de opname-elektrodehouder die in het patchklemapparaat is geïntegreerd. Draai de pipet vast met de opname-elektrodehouder. Laat de pipet vervolgens met de micromanipulator in het bad vallen.Klik op de pipet offset interface van de signaalversterker software om de lKv stroom baseline op nul picoamps te houden. Lever handmatig een geschikte overdruk met een spuit van 1,0 milliliter, aangesloten op de opname-elektrodehouder, via een plastic buis. Beweeg de pipet iets door de micromanipulator in drie dimensies te manipuleren om contact te maken met de cel.Zodra de membraantest de blokgolf met een derde tot de helft daalt nadat de pipet het celmembraan heeft aangeraakt, verwijdert u de positieve druk en levert u handmatig een geschikte negatieve druk. Klik vervolgens op de patchinterface van de data-acquisitiesoftware om de gigaseal te vormen. Gebruik de capaciteitscompensatie snel en capaciteitscompensatie langzame signaalversterkersoftware tijdens het celplafond om de snelle en langzame capaciteit te compenseren.Pas korte pulsen van negatieve druk toe om een stukje van het celmembraan te scheuren. Voer compensatie voor het membraan van de hele cel uit door op de knop voor de hele cel van de signaalversterkersoftware te klikken. Sla ten slotte de gegevens op en neem deze op door op de knop gegevensregistratie te klikken.Open de opgeslagen lKv-gegevens met de data-analysesoftware. Sla de huidige spanningsrelaties op. Klik op analyseren om statistieken te selecteren.Selecteer het bereik als Cursors 1 2 voor gegevensanalyse, klik op de knoppen piekamplitude en gemiddelde en klik vervolgens op OK om de gegevens op de resultatenpagina te bekijken. Kopieer ten slotte de kolom met lKv-gemiddelde gegevens naar de functietekensoftware voor verdere analyse. Sla de representatieve lKv-stroomsporen op.Klik op bewerken om overdrachtssporen te selecteren en selecteer vervolgens de volledige tracering in de regio die u wilt overbrengen. Klik vervolgens op selecteren in traceerselectie en selecteer IN 0 in signalen. Klik ten slotte op ok om de gegevens op de resultatenpagina te bekijken en kopieer de totale gegevens naar de functietekensoftware om de huidige sporen te tekenen.Sla het lKv-protocol op. Klik op bewerken om stimulusgolfvormsignaal maken te selecteren en ok te selecteren. Herhaal vervolgens de stap voor het tekenen van stroomsporen zonder het signaal te selecteren.De lKv werd geactiveerd door 150 milliseconden depolariserende pulsstimulus van min 40 tot plus 60 millivolt bij een potentieel van min 60 millivolt. De lKv van de H9C2 rat cardiomyocyten, verscheen eerst rond min 20 millivolt, en vervolgens nam de amplitude toe met verdere depolarisatie. In vergelijking met de controlegroep was de lKv-amplitude waarneembaar verminderd na de vijf minuten behandeling met 1,5 millimolar 4-AP.Bovendien daalde de lKv significant bij membraanpotentialen van 10 tot 60 millivolt op een dosisafhankelijke manier, na de 24 uur AC-behandeling. De individuele cel na het opnemen van het ionkanaal, kan worden gebruikt voor verdere eencellige omics-beoordeling, zoals single-cell genomics, transcriptomics, proteomics en de metabolomics.

voltage-dependent-potassium-current-recording-on-h9c2-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

Metingen van KV7 (KCNQ) kaliumkanaal activiteit in geïsoleerde bloedvaten myocyten (met behulp van patch-clamp elektrofysiologische technieken), parallel met metingen van constrictor / dilatator reacties (met behulp van druk myografie) kunnen belangrijke informatie over de rol van KV7 kanalen in het gladde spierweefsel fysiologie en farmacologie.

Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Wij beschrijven de isolatie van menselijke atriale myocyten die kunnen worden gebruikt voor intracellulaire...

Isolatie van Human atriale Myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transients en Membraan Currents

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

We presenteren een protocol voor de evaluatie van de elektromechanische effecten van GtACR1 activering bij konijnencardiomyocyten. We geven gedetailleerde informatie over celisolatie, kweek- en adenovirale transductie, en over functionele experimenten met de patch-clamp en koolstofvezel technieken.

Elektromechanische beoordeling van optogenetisch gemoduleerde cardiomyocyteactiviteit

Door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten (hiPSC-CM's) zijn naar voren gekomen als een veelbelovend in vitro model voor door geneesmiddelen geïnduceerde cardiotoxiciteitsscreening en ziektemodellering. Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de contractiliteit en elektrofysiologie van hiPSC-CM's.

Technische toepassingen van micro-elektrode array en patchklemopnamen op door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten

Dit protocol beschrijft een snelle en efficiënte methode voor het isoleren van gladde spiercellen uit de basilaire slagader van de rat en het registreren van naar binnen gelijkrichtende kaliumkanaalstromen in deze cellen met behulp van de patchklemtechniek voor de hele cel. Het biedt een nieuwe benadering voor onderzoekers die de basilaire slagader en ionenkanalen bestuderen.

Registratie van naar binnen rectificerende K+- stromen in vers geïsoleerde gladde spiercellen van de arteria basilaris door middel van patch-clamp-techniek

Leer de whole-cell patch-clamptechniek voor spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten. Deze methode onderzoekt cardiotoxiciteit via ionkanaalmechanismen.

Spanningsafhankelijke kaliumstroomregistratie op H9c2-cardiomyocyten via de whole-cell patchklemtechniek

Meer video's verkennen