Name: Genexpressieanalyses in menselijke follikels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Leer een efficiënte methode om menselijke ovariumfollikels te isoleren uit bevroren corticaal weefsel voor genexpressieanalyses. Deze gecontroleerde enzymatische en mechanische techniek behoudt follikelintegriteit voor reproductief onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een Excellence of Science (EOS) beurs (ID: 30443682). I.D. is associate researcher bij het Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

Dit project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Erasme Ziekenhuis (Brussel, België). De patiënt die in dit protocol was opgenomen, onderging cryopreservatie van ovariumweefsel (OTC) voor vruchtbaarheidsbehoud vóór blootstelling aan chemotherapie in 2000. De patiënte tekende schriftelijke toestemming om haar resterende ingevroren weefsel aan het einde van de bewaartermijn te doneren aan onderzoek.
1. Ontdooien van gecryopreserveerd eierstokweefsel
<ol><li>Maak een plaat met 6 putten met vijf ontdooioplossingen. De eerste put bevat 5 ml cryoprotectantoplossing bestaande uit Leibovitz-15-medium, 0,1 mol/l sucrose, 1,5 mol/l dimethylsulfoxide (DMSO) en 1% humaan serumalbumine (HSA). De volgende putjes bevatten 5 ml Leibovitz-15 medium met afnemende concentraties cryoprotectant: 1 mol/L, 0,5 mol/L en 2 x 0 mol/L DMSO. OPMERKING: De cryoprotectantoplossing kan verschillen volgens het protocol dat in de vruchtbaarheidskliniek wordt gebruikt.</li>
	<li>Verwijder een injectieflacon met een ovariële corticale fragment uit vloeibare stikstof in overeenstemming met de veiligheidsregels (cryogene handschoenen, beschermende bril en gesloten schoenen) en houd de buis gedurende 30 s op kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Week de injectieflacon gedurende 2 minuten in dubbel gedestilleerd water bij RT met zachte agitatie voordat u de injectieflacon onder een verticale kap opent en direct overbrengt in de eerste put van de 6-putplaat (op ijs).</li>
	<li>Breng het fragment achtereenvolgens over in elk putje van de 6-putplaat, waarbij elk een afnemende concentratie cryoprotectant bevat in 5 ml Leibovitz-15-medium. Roer het weefsel in elk medium voorzichtig gedurende 5 minuten (op ijs).</li>
</ol>2. Follikelisolatie
OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd met RNase-vrije materialen en onder een verticale kap.
<ol><li>Breng het ontdooide weefsel over in een 2 mm gerasterde petrischaal gevuld met 10 ml dissectiemedium (Leibovitz-15 medium, natriumpyruvaat [2 mmol / L], L-glutamine [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicilline G [30 μg / ml] en streptomycine [50 μg / ml]). Pas indien nodig de grootte van het weefsel aan met een scalpel. OPMERKING: Afhankelijk van het klinische protocol kan de grootte van het bevroren weefsel variëren van 8 mm x 4 mm x 1 mm tot 4 mm x 2 mm x 1 mm. Voor dit protocol zijn twee stroken van 4 mm x 2 mm x 1 mm gebruikt.</li>
	<li>Stapel de drie stukken van de weefselsnijder op, plaats het fragment tussen de twee blokken en snijd het fragment in tweeën met een mes, glijdend door de blokken om twee fragmenten van 0,5 mm dikte te verkrijgen.</li>
	<li>Gebruik de tissue chopper om het fragment te snijden en kleinere stukjes te verkrijgen. Snijd indien nodig de resterende stukjes handmatig met een scalpel totdat het weefsel volledig is verbrijzeld.</li>
	<li>Breng het gefragmenteerde weefsel over in een gerasterde petrischaal gevuld met 7 ml verteringsmedium (kweekmedium [McCoy's 5A-medium, 3 mmol / L glutamine, 0,1% HSA, 30 μg / ml penicilline G, 50 μg / ml streptomycine, 2,5 μg / ml transferrine, 4 ng / ml selenium en 50 μg / ml ascorbinezuur] aangevuld met 0,2% collagenase en 0,02% DNase).</li>
	<li>Zet de schaal in de couveuse bij 5% CO2 en 37 °C. Haal elke 10 minuten de petrischaal uit de couveuse en spoel het weefsel door op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Na 45 minuten incubatie in het verteringsmedium, plaatst u de schaal onder een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 5x-6,3x en haalt u de follikels op met behulp van een microcapillaire pipet. Selecteer de follikels van belang en isoleer ze door ze op te zuigen met een mondpipet. OPMERKING: Pipetteren in de mond moet zorgvuldig worden uitgevoerd om het verlies van materiaal in de pijp en verontreiniging te voorkomen.</li>
	<li>Als de follikels vast blijven zitten in een stuk cortex, isoleer ze dan mechanisch met twee spuiten van 27 G door de cortex af te scheuren met de punt van de spuiten om follikels uit het stroma vrij te maken. OPMERKING: Raak de follikels niet aan met de spuiten om beschadiging ervan te voorkomen.</li>
	<li>Breng de follikels met het microcapillair over in een 4-wellige plaat met druppels van 15 μL van het gekalibreerde kweekmedium bedekt met 500 μL oliecultuur (1 tot 10 follikels per druppel). Deze stap handhaaft de levensvatbaarheid van de follikel tijdens het verzamelproces. Spoel aan het einde van de procedure de follikels tweemaal gedurende 5 s telkens in twee druppels 15 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bedekt met 500 μL oliecultuur (op ijs).</li>
	<li>Verzamel 20 follikels met een minimale hoeveelheid PBS met behulp van de mondpipet (maximaal 10 μL) in een lege buis en houd de buis op ijs. OPMERKING: Voor RNA-stabiliteit is het cruciaal om stap 2.8 en stap 2.9 op ijs uit te voeren. Ongeveer 20 follikels (<75 μm) zijn nodig om voldoende RNA te hebben voor standaard RT-qPCR (SYBR Green).</li>
	<li>Na maximaal 90 minuten incubatie in het verteringsmedium stopt u de enzymatische reactie door in de petrischaal een overmaat aan koude (4 °C) blokkerende oplossing (7,5 ml) toe te voegen, bestaande uit kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). OPMERKING: De blokkerende oplossing kan worden toegevoegd zodra de experimentator follikels op de plaat ziet plakken of beschadigde follikels (asymmetrische vorm of donkerder gekleurde follikels). Het wordt geadviseerd om follikelisolatie uit te voeren binnen een maximale periode van 2,5 uur om folliculaire schade te voorkomen en om RNA-extractie onmiddellijk na isolatie uit te voeren.</li>
</ol>3. RNA-extractie
OPMERKING: RNA-extractie wordt uitgevoerd volgens de instructies die bij een RNA-extractiekit worden geleverd door de elutievolumes aan te passen.
<ol><li>Suspensie van de geïsoleerde follikels door 100 μL van de lysisoplossing die bij de RNA-extractiekit wordt geleverd, toe te voegen aan de buis met de follikels onder een chemische kap en vortex met een hoge snelheid (2.500 tpm / min) om de structuur van de follikels te breken. Voeg 50 μL ethanol (100%) toe aan de buis en draai kort met een hoge snelheid. OPMERKING: Aangezien de lysisbuffer 2-mercaptoethanol en thiocyaninezuur bevat, moet deze stap met voorzichtigheid worden uitgevoerd onder een chemische kap.</li>
	<li>Breng het totale volume van de buis (ongeveer 160 μL) over naar een microfilterpatroon bestaande uit een kolom en een opvangbuis en centrifugeer deze gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C. Was de kolom met 180 μL wasoplossing 1, meegeleverd met de kit, en centrifugeer de buis gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Voeg 180 μL wasoplossing 2/3, meegeleverd met de kit, toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C. Voer deze stap twee keer uit. Centrifugeer de buis nog een laatste keer gedurende 1 minuut om het filter te drogen en plaats een nieuwe opvangbuis onder de patroon.</li>
	<li>Voer de elutie van de nucleïnezuren uit in twee stappen:<ol><li>Voeg eerst 8 μL warme elutieoplossing (75 °C) toe aan het filter, wacht 1 minuut bij RT en centrifugeer gedurende 30 s bij 16,363 x g bij 4 °C.</li>
		<li>Herhaal deze stap met 7 μL elutieoplossing. OPMERKING: De buis met de geëlueerde nucleïnezuren moet op ijs worden bewaard. Om DNA-besmetting te voorkomen, wordt een aanvullende stap van DNA-degradatie sterk aanbevolen- stap 3.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer de buis met 2 IE DNase en 1x DNase buffer gedurende 20 min bij 37 °C. Blokkeer de enzymatische activiteit met 1/10 DNase inactivatiereagens gedurende 2 min bij RT.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 1,5 minuut bij 16,363 x g bij 4 °C. Verzamel ten slotte de suspensie die het RNA bevat en breng deze over naar een nieuwe buis.</li>
	<li>Beoordeel de hoeveelheid RNA in het monster met behulp van een spectrofotometer (NanoDrop 2000-software > Nucleic Acid > RNA). Gebruik 1 μL elutieoplossing als blanco en meet de RNA-hoeveelheid geëxtraheerd uit geïsoleerde follikels met 1 μL oplossing.</li>
	<li>Controleer de 260/280-verhouding op RNA-zuiverheid (ongeveer 2,0). Bewaar het monster bij −80 °C of schrijf het direct achteraf om RT-qPCR uit te voeren. OPMERKING: Om de RNA-integriteit te beoordelen, kan het monster worden verwerkt met een geautomatiseerd elektroforesesysteem met hoge resolutie voor of na het invriezen bij −80 °C. In dit werk werd, na retrotranscriptie, RT-qPCR uitgevoerd met de volgende cyclus: Houd fase vast met 20 s bij 50 °C en 10 min bij 95 °C 40 PCR-cycli met 15 s bij 95 °C en 1 min bij 60 °C Smeltcurvefase met 15 s bij 95 °C, 1 min bij 60 °C, 30 s bij 95 °C en 15 s bij 60 °C</li>
</ol>

<ol><li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+follicular+development%3A+From+activation+of+resting+follicles+to+preovulatory+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Annales+d%27Endocrinologie%22%5BJournal%5D)">Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation.</a> Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).</li>
<li>Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+human+ovarian+folliculogenesis+and+its+implications+in+assisted+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).</li>
<li>Rosewell, K. L., Curry, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ovarian+matrix+metalloproteinase+mRNAs+by+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization.</a> Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).</li>
<li>Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+localisation+of+c-kit+and+KITL+in+the+adult+human+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary.</a> Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+primordial+follicles+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue.</a> Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).</li>
<li>Bonnet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+of+sheep+granulosa+cells+and+oocytes+during+early+follicular+development+obtained+by+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection.</a> BMC Genomics. 12, 417(2011).</li>
<li>Chiti, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+and+tailored+human+follicle+isolation+procedure+improves+follicle+recovery+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival.</a> Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).</li>
<li>Kim, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+follicle+isolation+methods+for+mouse+ovarian+follicle+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro.</a> Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+follicle+isolation+for+bioengineering+of+human+artificial+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary.</a> Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).</li>
<li>Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+isolation+methods+reveal+plasticity+of+granulosa+cell+steroidogenic+capacity+during+mouse+in+vitro+follicle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth.</a> Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).</li>
<li>McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+small+preantral+follicles+from+the+bovine+ovary+using+a+combination+of+fragmentation%2C+homogenization%2C+and+serial+filtration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration.</a> Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).</li>
<li>Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+%28IVG%29+of+human+ovarian+follicles+in+frozen+thawed+ovarian+cortex+tissue+culture+supplemented+with+follicular+fluid+under+hypoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Gynecology+and+Obstetrics%22%5BJournal%5D)">In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+grown+human+ovarian+follicles+from+cancer+patients+support+oocyte+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth.</a> Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).</li>
<li>Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preliminary+experience+of+ovarian+tissue+cryopreservation+procedure%3A+Alternatives%2C+perspectives+and+feasibility%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility.</a> Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).</li>
<li>Demeestere, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+function+and+spontaneous+pregnancy+after+combined+heterotopic+and+orthotopic+cryopreserved+ovarian+tissue+transplantation+in+a+patient+previously+treated+with+bone+marrow+transplantation%3A+Case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report.</a> Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).</li>
<li>Gougeon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+follicular+growth+in+the+human%3A+A+model+from+preliminary+results%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results.</a> Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).</li>
<li>Grosbois, J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+PI3K+and+Hippo+signaling+pathways+during+in+vitro+human+follicle+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation.</a> Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).</li>
<li>Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructure+and+intercellular+contact-mediated+communication+in+cultured+human+early+stage+follicles+exposed+to+mTORC1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor.</a> Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).</li>
<li>Oktay, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+function+and+oocyte+retrieval+after+autologous+transplantation+of+ovarian+cortical+strips+to+the+forearm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm.</a> Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).</li>
<li>Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+cryopreservation+versus+ovarian+tissue+cryopreservation+for+adult+female+oncofertility+patients%3A+A+cost-effectiveness+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).</li>
<li>Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+follicle+health+and+development+in+cultured+cryopreserved+ovarian+cortical+tissue%3A+A+study+of+ovarian+tissue+from+patients+undergoing+fertility+preservation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Fertility%22%5BJournal%5D)">Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation.</a> Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).</li>
<li>Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ovarian+follicle+growth%3A+A+comprehensive+analysis+of+key+protocol+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables.</a> Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).</li>
<li>Rice, S., Ojha, K., Mason, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ovarian+biopsies+as+a+viable+source+of+pre-antral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles.</a> Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).</li>
<li>Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pre-antral+follicles+from+human+ovarian+medulla+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue.</a> Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).</li>
<li>Dong, F. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+research+on+the+isolation+methods+of+frozen-thawed+human+ovarian+preantral+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).</li>
<li>Lierman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicles+of+various+maturation+stages+react+differently+to+enzymatic+isolation%3A+a+comparison+of+different+isolation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biomedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols.</a> Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+isolated+early+human+follicles+cultured+in+collagen+gels+for+24+hours%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours.</a> Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+study+of+fully+and+partially+isolated+early+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Morphological study of fully and partially isolated early human follicles.</a> Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).</li>
<li>McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+II+oocytes+from+human+unilaminar+follicles+grown+in+a+multi-step+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).</li>
<li>Abir, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+and+in+vitro+growth+of+preantral+and+small+antral+human+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles.</a> Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).</li>
<li>Vanacker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+isolation+of+human+primordial+and+primary+ovarian+follicles+with+Liberase+DH%3A+Protocol+for+application+in+a+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting.</a> Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).</li>
<li>Amargant, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+stiffness+increases+with+age+in+the+mammalian+ovary+and+depends+on+collagen+and+hyaluronan+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices.</a> Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

De cryopreservatie van eierstokweefsel is een veelbelovende aanpak voor het behoud van de vruchtbaarheid van kankerpatiënten. In de kliniek wordt ontdooid corticale weefsel na remissie terug in de patiënt geënt, waardoor de ovariële functie en vruchtbaarheid kunnen worden hervat19,20. Naast klinisch gebruik kunnen resterende ovariumfragmenten ook worden gedoneerd voor onderzoek aan het einde van de opslagperiode om de mechanismen te bestuderen die folliculogenese...

De eierstok is een complex orgaan dat bestaat uit functionele en structurele eenheden, waaronder de follikels in de cortex en het stroma. Folliculogenese, het proces van follikelactivering, groei en rijping van een primordiale rusttoestand naar een volwassen follikel die kan worden bevrucht en om de vroege embryonale ontwikkeling te ondersteunen, wordt op grote schaal bestudeerd in onderzoek1. Het ontrafelen van de mechanismen die dit fenomeen veroorzaken, zou de vruchtbaarheidszorg voor vrouwenkunnen verbeteren 2. Analyses op vast menselijk weefsel maken de beoordeling van eiwitexpressie en genlokalisatie binnen de functionele eenheden van de eierstokmogelijk 3,4. Er zijn echter specifieke technieken nodig om de follikels te dissociëren van de omliggende cortex om de genexpressieniveaus in de ovariële follikels nauwkeurig te beoordelen. Daarom werd in een eerdere studie een follikelisolatietechniek ontwikkeld om analyses van genexpressie rechtstreeks vanuit de functionele eenheid van de eierstok5 mogelijk te maken. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, zoals enzymatische spijsvertering en / of mechanische isolatie, evenals laservangstmicrodissectie, die follikelisolatie in eenstuk weefsel 6,7,8,9 mogelijk maken. Follikelisolatie wordt veel gebruikt, hetzij met menselijk of dierlijk eierstokweefsel, om de genexpressieprofielen van follikels in alle stadia van ontwikkeling te evalueren10,11,12. Een optimale isolatieprocedure moet echter rekening houden met de fragiele structuur van de follikel in de dichte cortex en moet daarom met zorg worden uitgevoerd om schade te voorkomen7. Dit manuscript beschrijft een procedure, aangepast van een protocol beschreven door Woodruff's laboratorium, om menselijke follikels te isoleren uit bevroren ontdooide ovariële cortex om genexpressieanalyses uit te voeren13.
De eerste stap van ovariële follikelisolatie van bevroren menselijk weefsel is de ontdooiingsprocedure. Dit proces wordt uitgevoerd op basis van het klinische protocol dat wordt gebruikt voor het enten van gecryopreserveerd ovariumweefsel, zoals eerder beschreven14,15. Het proces is gericht op het verwijderen van de cryoprotectieve middelen door de ovariële cortex te spoelen in afnemende concentraties van het medium. Vervolgens wordt het weefsel gefragmenteerd voordat enzymatische en mechanische isolatie plaatsvindt om de follikels op te halen. Follikels in verschillende stadia kunnen worden onderscheiden met behulp van een stereomicroscoop met hoge vergroting en optica van goede kwaliteit om de interessante te isoleren. Elke geïsoleerde follikel wordt gemeten met behulp van een liniaal geïntegreerd in de microscoop, en de follikels kunnen worden samengevoegd volgens hun ontwikkelingsstadium: primordiale follikels (30 μm), primaire follikels (60 μm), secundaire follikels (120-200 μm) en antrale follikels (>200 μm)16. Verdere classificatie kan worden uitgevoerd volgens de morfologie van de follikels: primordiale follikels hebben één laag afgeplatte granulosacellen (GC's), primaire follikels hebben één laag kubusvormige GC's, secundaire follikels hebben ten minste twee lagen kuboïdale GC's en de aanwezigheid van een holte tussen de GC's kenmerkt het antrale stadium. Wanneer follikels van belang worden geselecteerd, wordt RNA-extractie uitgevoerd. De hoeveelheid en kwaliteit van RNA worden geëvalueerd voorafgaand aan de real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) (figuur 1).

<table><tbody><tr><td>2 mm gridded Petri dish</td><td>Corning</td><td>430196</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer instrument</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>2100 Expert software</td><td>Agilent</td><td>version B.02.08.SI648</td><td></td></tr><tr><td>4-wells plate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6789</td><td></td></tr><tr><td>6-wells plate</td><td>Carl Roth</td><td>&nbsp;EKX5.1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent total RNA 6000 pico kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>LifeTechnologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4527-10kU</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GoScript reverse transcriptase</td><td>Promega</td><td>A5003</td><td></td></tr><tr><td>HSA</td><td>CAF DCF&nbsp;</td><td>LC4403-41-080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz-15</td><td>LifeTechnologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&rsquo;s 5A + bicarbonate + Hepes</td><td>LifeTechnologies</td><td>12330-031</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Stoelting</td><td>51350</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary RI EZ-Tips 200 &micro;m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2200/1</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillary RI EZ-Tips 75 &micro;m</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-2075/1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c operating software</td><td>ThermoFisher</td><td>version 1.6</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>ThermoFisher</td><td>2000/2000c</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>PowerTrack SYBR green master mix</td><td>ThermoFisher</td><td>A46109</td><td></td></tr><tr><td>Primers: GDF9</td><td></td><td></td><td>F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG</td></tr><tr><td>Primers: HPRT</td><td></td><td></td><td>F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA</td></tr><tr><td>Primers: Kit Ligand</td><td></td><td></td><td>F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT</td></tr><tr><td>Real-Time qPCR Quantstudio 3</td><td>ThermoFisher</td><td>A33779</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous-micro total RNA isolation kit</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II&nbsp; water-jacketed CO2&nbsp;incubators</td><td>ThermoFisher</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Stadie-Riggs tissue slicer</td><td>Thomas Scientific</td><td>6727C10</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Roche&nbsp;</td><td>10652202001</td><td></td></tr></tbody></table>

genexpressieanalyses in menselijke follikels

Gene Expression Analyses in Human Follicles

De eierstok is een heterogeen orgaan dat bestaat uit verschillende celtypen. Om de moleculaire mechanismen te bestuderen die optreden tijdens folliculogenese, kan de lokalisatie van eiwitten en genexpressie worden uitgevoerd op vast weefsel. Om de genexpressieniveaus in een menselijke follikel goed te kunnen beoordelen, moet deze complexe en delicate structuur echter worden geïsoleerd. Daarom is een aangepast protocol ontwikkeld dat eerder door het laboratorium van Woodruff is beschreven om follikels (de eicel en de granulosacellen) te scheiden van hun omgeving. Het eierstokschorsweefsel wordt eerst handmatig verwerkt om kleine fragmenten te verkrijgen met behulp van twee hulpmiddelen: een weefselsnijder en een weefselhakselaar. Het weefsel wordt vervolgens enzymatisch verteerd met 0,2% collagenase en 0,02% DNase gedurende ten minste 40 minuten. Deze verteringsstap wordt uitgevoerd bij 37 °C en 5% CO2 en gaat gepaard met mechanisch pipetteren van het medium om de 10 min. Na incubatie worden de geïsoleerde follikels handmatig verzameld met behulp van een gekalibreerde microcapillaire pipet onder microscoopvergroting. Als er nog follikels aanwezig zijn in de stukjes weefsel, wordt de procedure voltooid met handmatige microdissectie. De follikels worden verzameld op ijs in een kweekmedium en worden tweemaal gespoeld in druppeltjes fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Deze verteringsprocedure moet zorgvuldig worden gecontroleerd om verslechtering van de follikel te voorkomen. Zodra de structuur van de follikels aangetast lijkt te zijn of na maximaal 90 min, wordt de reactie gestopt met een 4 °C blokkerende oplossing die 10% foetaal runderserum bevat. Een minimum van 20 geïsoleerde follikels (kleiner dan 75 μm) moet worden verzameld om een voldoende hoeveelheid totaal RNA te verkrijgen na RNA-extractie voor real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Na extractie bereikt de kwantificering van totaal RNA uit 20 follikels een gemiddelde waarde van 5 ng/μL. Het totale RNA wordt vervolgens achteraf getranscribeerd in cDNA en de genen van belang worden verder geanalyseerd met behulp van RT-qPCR.

Met behulp van deze isolatieprocedure kan de experimentator follikels uit de stromale omgeving halen om specifieke genexpressieanalyses uit te voeren. Op basis van de grootte en morfologie van de follikels is het mogelijk om de verschillende stadia van folliculogenese te onderscheiden. De experimentator kan follikels van belang selecteren op basis van hun grootte met behulp van een aangepaste microcapillaire pipet. Door een microcapillair van maximaal 75 μm te gebruiken, is het mogelijk om primordiale en primaire follike...

Hier beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe menselijke ovariële follikels kunnen worden geïsoleerd uit bevroren ontdooid corticale weefsel om genexpressieanalyses uit te voeren.

Genexpressieanalyses in menselijke follikels

The ovary is a heterogeneous organ composed of different cell types. To study the molecular mechanisms occurring during folliculogenesis, the localization ...

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om ovariële follikels te isoleren van de omliggende stromacellen om genexpressieanalyses op deze geslachtscellen te beoordelen. Deze techniek, met behulp van gecontroleerde enzymatische en mechanische isolaties, maakt het mogelijk om follikels op te halen met behoud van hun integriteit. Volgens dit protocol kan de onderzoeker specifieke genexpressies van deze cellen beoordelen.De techniek kan worden gebruikt om het tekort aan genexpressie in de follikels gerelateerd aan ziekten die de ovariële functie beïnvloeden of na blootstelling aan toxische agentia verder te begrijpen. Begin met het bereiden van een plaat met zes putten door vijf milliliter cryoprotectantoplossing toe te voegen aan de eerste put en vijf milliliter Leibovitz 15-medium met afnemende concentraties cryoprotectant aan de volgende vier putten. Verwijder een injectieflacon met een ovariumschorsfragment uit vloeibare stikstof in overeenstemming met de veiligheidsregels.Na 30 seconden bij kamertemperatuur, of RT, week de injectieflacon gedurende twee minuten in dubbel gedestilleerd water. In een verticale kap, voorzichtig roeren en openen van de ovarium corticale fragment injectieflacon voordat u de inhoud overbrengt in de eerste put van de zes-put plaat geplaatst op ijs. Breng vervolgens het ovariële corticale fragment in de eerste put achtereenvolgens over in elke put van de zesputplaat met afnemende concentraties cryoprotectant in vijf milliliter Leibovitz 15-medium.Roer het weefsel in elk medium voorzichtig gedurende vijf minuten. Voor follikelisolatie brengt u het ontdooide eierstokweefsel over in een twee millimeter gerasterde petrischaal gevuld met 10 milliliter dissectiemedium, 30 microgram per milliliter penicilline G en 50 microgram per milliliter streptomycine. Pas indien nodig de weefselgrootte aan met het scalpel.Stapel de drie stukjes van de weefselsnijder op en plaats het ovariumfragment tussen de twee blokken. Snijd het fragment doormidden met een mes en schuif door de blokken om twee fragmenten van 0,5 millimeter dikte te verkrijgen. Snijd het weefsel met behulp van de tissue chopper om de kleinere stukjes te verkrijgen.Snijd indien nodig de resterende stukjes handmatig met het scalpel totdat het weefsel is gebroken. Zodra het weefsel is gebroken, brengt u het gefragmenteerde weefsel over in een gerasterde petrischaal gevuld met zeven milliliter verteringsmedium voordat u de schaal in de couveuse plaatst met 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Neem de petrischaal elke 10 minuten uit de couveuse.Spoel het weefsel door het verteringsmedium op en neer te pipetteren met een pipet van één milliliter. Na 45 minuten incubatie in het verteringsmedium, plaatst u de schaal onder een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van vijf tot 6,3 keer en haalt u de follikels op met behulp van een microcapillaire pipet. Selecteer de follikels van belang en isoleer ze door ze op te zuigen met een mondpipet.Als de follikels vast blijven zitten in een stuk cortex, isoleer ze dan mechanisch met twee 27-gauge spuiten door de cortex af te scheuren met de punt van de spuiten en follikels uit het stroma vrij te maken. Breng met behulp van het microcapillair de geïsoleerde follikels over naar een plaat met vier putten die 15 microliter van het gekalibreerde kweekmedium bevat, bedekt met 500 microliter oliecultuur. Na het overbrengen van één tot 10 follikels, spoel ze twee keer in twee druppels van 15 microliter PBS bedekt met 500 microliter oliecultuur gedurende vijf seconden elk.Verzamel met behulp van de mondpipet 20 follikels met minimale PBS in een lege buis en houd de buis op ijs. Na 90 minuten incubatie in het verteringsmedium stopt u de enzymatische reactie door een koudeblokkerende oplossing toe te voegen. Suspensie onder de chemische kap de geïsoleerde follikels in 100 microliter van de lysisoplossing die bij de RNA-extractiekit wordt geleverd.Vortex de geïsoleerde follikels met 2500 RPM per minuut om hun structuur te breken en voeg vervolgens 50 microliter 100% ethanol toe aan de buis. En kort vortex de buis op hoge snelheid. Breng na vortexing het totale volume van de buis over naar een microfilterpatroon, bestaande uit een kolom en een opvangbuis.En centrifugeer de assemblage gedurende 10 seconden bij 16, 363 g bij vier graden Celsius. Was de kolom met 180 microliter wasoplossing 1 die bij de kit is geleverd voordat u de buis gedurende 10 seconden centrifugeert. Na twee wasbeurten van 180 microliter wasoplossing 2, 3 aan de kolom, droogt u het filter door de buis nog een laatste keer te centrifugeren en plaatst u een nieuwe opvangbuis onder de patroon.Om de elutie van de nucleïnezuren uit te voeren, voegt u eerst acht microliter Elution Solution van 75 graden Celsius toe aan de filterassemblage. Centrifugeer de assemblage na één minuut gedurende 30 seconden. Herhaal deze stap met zeven microliter Elution Solution.Als u klaar bent, voegt u twee internationale eenheid DNase- en DNase-buffer toe aan de buis en incubeert u de buis gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Blokkeer de enzymatische activiteit met één bij 10 DNase-inactivatiereagens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 1,5 minuut bij 16, 363 g bij vier graden Celsius en breng de suspensie met het RNA over naar een nieuwe buis.Beoordeel met behulp van een spectrofotometer de hoeveelheid RNA in het monster. Gebruik één microliter Elution Solution als een blanco en één microliter oplossing van RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde follikels. Controleer of de 260/280-verhouding ongeveer 2,0 is voor RNA-zuiverheid.En bewaar het monster bij min 80 graden Celsius of schrijf het direct achteraf om RT-qPCR uit te voeren. Met behulp van dit protocol werden de twee gehomogeniseerde ovariumfragmenten van 4x2x1 millimeter van dezelfde patiënt verwerkt om de follikels te isoleren. RNA-kwantificering onthulde dat 4,8 nanogram per microliter totaal RNA werd geëxtraheerd uit follikels van minder dan 75 micrometer groot met een zuiverheidsverhouding van 1,89.Uit de minder dan 200 micrometer follikels werd 10,5 nanogram per microliter totaal RNA geëxtraheerd met een zuiverheidsverhouding van 1,74. Het RNA-integriteitsgetal, of RIN, waarden waren respectievelijk 7,1 en 7,9 in buisjes één en twee, wat de kwaliteit van het RNA uit onze monsters valideerde. Na het uitvoeren van een standaardcyclus op een real-time PCR-systeem, waren de cyclusdrempels, of CT, verkregen 30,87 en 29,56 voor HPRT, 33,5 en 31,77 voor kitligand en 30,71 en 30,57 voor GDF9.De enzymatische vertering van het weefsel is een kritiek punt. De experimentator moet de follikelintegriteit tijdens de reactie voortdurend evalueren en waarborgen door deze indien nodig te stoppen. Naast genexpressieanalyses worden geïsoleerde follikels gebruikt om experimentele systemen te ontwikkelen om de vruchtbaarheid van kankerpatiënten te behouden, zoals follikel-in-vitrocultuur of kunstmatige eierstokken.De isolatietechniek vereiste een leercurve voor het ophalen van een groot aantal intacte follikels. De onderzoekers wordt geadviseerd om ervoor te zorgen dat het weefsel goed verbrijzeld is voor de spijsvertering.

gene-expression-analyses-in-human-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft de primaire cultuur / co-cultuur van de muis eierstokweefsel, met behulp van de eierstokken van pasgeboren muizen en individuele ovariële follikels van prepuberale muizen. De kweektechnieken ondersteunen In een sterk fysiologische wijze, waardoor onderzoek naar het effect van extrinsieke middelen op de eierstok en interacties tussen ovariële follikels.

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

Dit manuscript beschrijft een experimentele aanpak om paardocyten morfologisch en biochemisch te karakteriseren. Specifiek illustreert het onderhavige werk hoe u onrijpe en volwassen paardocyten verzamelt door middel van ultrageluidgeleide ovumopname (OPU) en hoe u chromosoom-segregatie, spindemorfologie, globale histonacetylering en mRNA-expressie kunt onderzoeken.

Analyse van Chromosoom Segregatie, Histon Acetylatie, En Spindel Morfologie In Paard Oocyten

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Single molecule RNA fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH) is een methode om niveaus en lokalisatie van specifieke RNA's op het niveau van één cel nauwkeurig te kwantificeren. Hier rapporteren we onze gevalideerde laboratoriumprotocollen voor natte-bench verwerking, beeldvorming en beeldanalyse voor eencellige kwantificering van specifieke RNA's.

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Hier presenteren we protocollen voor de identificatie en zuivering van eierstokcellen uit antrale follikels. We werken uit over methoden voor het verwerken van hele eierstokken voor de cryopreservatie van corticale strips, terwijl we ook intacte antrale follikels oogsten die enzymatisch worden behandeld om meerdere follikel-residente celtypen vrij te maken, waaronder granulosa, theca, endotheel, hematopoietische en stromale cellen.

Extractie, etikettering en zuivering van afstammingsspecifieke cellen uit menselijke antrale follikels

Het bevorderen van de studie van preantrale folliculogenese vereist efficiënte methoden voor follikelisolatie van enkele eierstokken. Hier wordt een gestroomlijnd, mechanisch protocol gepresenteerd voor follikelisolatie van runderbitussen met behulp van een weefselhakselaar en homogenisator. Deze methode maakt het mogelijk om een groot aantal levensvatbare preantrale follikels uit een enkele eierstok te verzamelen.

Isolatie van kleine preantrale follikels uit de runder eierstok met behulp van een combinatie van fragmentatie, homogenisatie en seriële filtratie

In dit protocol werden de translating ribosome affinity purification (TRAP) methode en de isolatie van nuclei tagged in specific cell types (INTACT) methode geoptimaliseerd voor de gepaarde ondervraging van het celspecifieke ovariumtranscriptoom en epigenoom met behulp van het NuTRAP muismodel gekruist naar een Cyp17a1-Cre muislijn.

Celspecifieke gepaarde ondervraging van het ovarium-epigenoom en transcriptoom van de muis

Dit artikel presenteert een co-cultuurmodel van boviene theca- en granulosacellen. Deze methode heeft het potentieel om te dienen als een betrouwbare basis voor analyses die gericht zijn op de studie van paracriene communicatie en substraattransport tussen de somatische cellen in de follikel.

Een gemodificeerd co-cultuursysteem voor het begrijpen van granulosa-theca-celinteracties in de rundereierstok

Dit protocol schetst gestandaardiseerde methoden om follikelvloeistof, somatische cellen en onrijpe eicellen te isoleren en te verwerken uit IVF-procedures, waardoor moleculaire en cellulaire analyses van hoge kwaliteit mogelijk zijn. Deze benaderingen ondersteunen translationeel onderzoek naar vruchtbaarheid, reproductieve veroudering en ovariële disfunctie met behulp van materialen die doorgaans in de klinische zorg worden weggegooid.

Verzameling van menselijke follikelvloeistof, follikelsomatische cellen en onrijpe eicellen van personen die in-vitrofertilisatie ondergaan

We beschrijven een multi-target chromogene whole-mount in situ hybridisatie (MC-WISH) procedure in intacte Drosophila embryo's toestaan ​​gelijktijdige en specifieke detectie van drie verschillende mRNA distributie patronen door contrasterende kleur neerslagen.

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

Leer een efficiënte methode om menselijke ovariumfollikels te isoleren uit bevroren corticaal weefsel voor genexpressieanalyses. Deze gecontroleerde enzymatische en mechanische techniek behoudt follikelintegriteit voor reproductief onderzoek.

Genexpressieanalyses in menselijke follikels

Meer video's verkennen