Genexpressieanalyses in menselijke follikels

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode om ovariële follikels te isoleren van de omliggende stromacellen om genexpressieanalyses op deze geslachtscellen te beoordelen. Deze techniek, met behulp van gecontroleerde enzymatische en mechanische isolaties, maakt het mogelijk om follikels op te halen met behoud van hun integriteit. Volgens dit protocol kan de onderzoeker specifieke genexpressies van deze cellen beoordelen.

De techniek kan worden gebruikt om het tekort aan genexpressie in de follikels gerelateerd aan ziekten die de ovariële functie beïnvloeden of na blootstelling aan toxische agentia verder te begrijpen. Begin met het bereiden van een plaat met zes putten door vijf milliliter cryoprotectantoplossing toe te voegen aan de eerste put en vijf milliliter Leibovitz 15-medium met afnemende concentraties cryoprotectant aan de volgende vier putten. Verwijder een injectieflacon met een ovariumschorsfragment uit vloeibare stikstof in overeenstemming met de veiligheidsregels.

Na 30 seconden bij kamertemperatuur, of RT, week de injectieflacon gedurende twee minuten in dubbel gedestilleerd water. In een verticale kap, voorzichtig roeren en openen van de ovarium corticale fragment injectieflacon voordat u de inhoud overbrengt in de eerste put van de zes-put plaat geplaatst op ijs. Breng vervolgens het ovariële corticale fragment in de eerste put achtereenvolgens over in elke put van de zesputplaat met afnemende concentraties cryoprotectant in vijf milliliter Leibovitz 15-medium.

Roer het weefsel in elk medium voorzichtig gedurende vijf minuten. Voor follikelisolatie brengt u het ontdooide eierstokweefsel over in een twee millimeter gerasterde petrischaal gevuld met 10 milliliter dissectiemedium, 30 microgram per milliliter penicilline G en 50 microgram per milliliter streptomycine. Pas indien nodig de weefselgrootte aan met het scalpel.

Stapel de drie stukjes van de weefselsnijder op en plaats het ovariumfragment tussen de twee blokken. Snijd het fragment doormidden met een mes en schuif door de blokken om twee fragmenten van 0,5 millimeter dikte te verkrijgen. Snijd het weefsel met behulp van de tissue chopper om de kleinere stukjes te verkrijgen.

Snijd indien nodig de resterende stukjes handmatig met het scalpel totdat het weefsel is gebroken. Zodra het weefsel is gebroken, brengt u het gefragmenteerde weefsel over in een gerasterde petrischaal gevuld met zeven milliliter verteringsmedium voordat u de schaal in de couveuse plaatst met 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Neem de petrischaal elke 10 minuten uit de couveuse.

Spoel het weefsel door het verteringsmedium op en neer te pipetteren met een pipet van één milliliter. Na 45 minuten incubatie in het verteringsmedium, plaatst u de schaal onder een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van vijf tot 6,3 keer en haalt u de follikels op met behulp van een microcapillaire pipet. Selecteer de follikels van belang en isoleer ze door ze op te zuigen met een mondpipet.

Als de follikels vast blijven zitten in een stuk cortex, isoleer ze dan mechanisch met twee 27-gauge spuiten door de cortex af te scheuren met de punt van de spuiten en follikels uit het stroma vrij te maken. Breng met behulp van het microcapillair de geïsoleerde follikels over naar een plaat met vier putten die 15 microliter van het gekalibreerde kweekmedium bevat, bedekt met 500 microliter oliecultuur. Na het overbrengen van één tot 10 follikels, spoel ze twee keer in twee druppels van 15 microliter PBS bedekt met 500 microliter oliecultuur gedurende vijf seconden elk.

Verzamel met behulp van de mondpipet 20 follikels met minimale PBS in een lege buis en houd de buis op ijs. Na 90 minuten incubatie in het verteringsmedium stopt u de enzymatische reactie door een koudeblokkerende oplossing toe te voegen. Suspensie onder de chemische kap de geïsoleerde follikels in 100 microliter van de lysisoplossing die bij de RNA-extractiekit wordt geleverd.

Vortex de geïsoleerde follikels met 2500 RPM per minuut om hun structuur te breken en voeg vervolgens 50 microliter 100% ethanol toe aan de buis. En kort vortex de buis op hoge snelheid. Breng na vortexing het totale volume van de buis over naar een microfilterpatroon, bestaande uit een kolom en een opvangbuis.

En centrifugeer de assemblage gedurende 10 seconden bij 16, 363 g bij vier graden Celsius. Was de kolom met 180 microliter wasoplossing 1 die bij de kit is geleverd voordat u de buis gedurende 10 seconden centrifugeert. Na twee wasbeurten van 180 microliter wasoplossing 2, 3 aan de kolom, droogt u het filter door de buis nog een laatste keer te centrifugeren en plaatst u een nieuwe opvangbuis onder de patroon.

Om de elutie van de nucleïnezuren uit te voeren, voegt u eerst acht microliter Elution Solution van 75 graden Celsius toe aan de filterassemblage. Centrifugeer de assemblage na één minuut gedurende 30 seconden. Herhaal deze stap met zeven microliter Elution Solution.

Als u klaar bent, voegt u twee internationale eenheid DNase- en DNase-buffer toe aan de buis en incubeert u de buis gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Blokkeer de enzymatische activiteit met één bij 10 DNase-inactivatiereagens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer vervolgens de buis gedurende 1,5 minuut bij 16, 363 g bij vier graden Celsius en breng de suspensie met het RNA over naar een nieuwe buis.

Beoordeel met behulp van een spectrofotometer de hoeveelheid RNA in het monster. Gebruik één microliter Elution Solution als een blanco en één microliter oplossing van RNA geëxtraheerd uit geïsoleerde follikels. Controleer of de 260/280-verhouding ongeveer 2,0 is voor RNA-zuiverheid.

En bewaar het monster bij min 80 graden Celsius of schrijf het direct achteraf om RT-qPCR uit te voeren. Met behulp van dit protocol werden de twee gehomogeniseerde ovariumfragmenten van 4x2x1 millimeter van dezelfde patiënt verwerkt om de follikels te isoleren. RNA-kwantificering onthulde dat 4,8 nanogram per microliter totaal RNA werd geëxtraheerd uit follikels van minder dan 75 micrometer groot met een zuiverheidsverhouding van 1,89.

Uit de minder dan 200 micrometer follikels werd 10,5 nanogram per microliter totaal RNA geëxtraheerd met een zuiverheidsverhouding van 1,74. Het RNA-integriteitsgetal, of RIN, waarden waren respectievelijk 7,1 en 7,9 in buisjes één en twee, wat de kwaliteit van het RNA uit onze monsters valideerde. Na het uitvoeren van een standaardcyclus op een real-time PCR-systeem, waren de cyclusdrempels, of CT, verkregen 30,87 en 29,56 voor HPRT, 33,5 en 31,77 voor kitligand en 30,71 en 30,57 voor GDF9.

De enzymatische vertering van het weefsel is een kritiek punt. De experimentator moet de follikelintegriteit tijdens de reactie voortdurend evalueren en waarborgen door deze indien nodig te stoppen. Naast genexpressieanalyses worden geïsoleerde follikels gebruikt om experimentele systemen te ontwikkelen om de vruchtbaarheid van kankerpatiënten te behouden, zoals follikel-in-vitrocultuur of kunstmatige eierstokken.

De isolatietechniek vereiste een leercurve voor het ophalen van een groot aantal intacte follikels. De onderzoekers wordt geadviseerd om ervoor te zorgen dat het weefsel goed verbrijzeld is voor de spijsvertering.