Testen van de in vitro en in vivo efficiëntie van mRNA-lipide nanodeeltjes geformuleerd door microfluïdische menging

Dit protocol kan worden gebruikt om consistente lipide nanodeeltjes te formuleren die MRA inkapselen. De formuleringsparameters kunnen worden afgestemd en de verschillende lipide nanodeeltjes kunnen worden geëvalueerd op hun potentie en biodistributie. Een gestandaardiseerd protocol voor de formulering van lipide-nanodeeltjes en in-vitro- en in-vivotests kan worden gebruikt om consistente lipide-nanodeeltjes te formuleren die met elkaar kunnen worden vergeleken.

Er zijn veel kleine details om in gedachten te houden bij het formuleren en evalueren van de potentie van nanodeeltjes, maar welke details zijn verantwoordelijk? Het bereiden van de formulering zou niet moeilijk moeten zijn. Begin met het vullen van een schone beker van vier liter met 200 tot 300 milliliter verse 10X PBS en verdun deze tot 1X met ultrapuur water.

Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume van PBS tussen de twee en drie liter ligt. Plaats dialysecassettes met de juiste capaciteit voor het lipide-nanodeeltje, of LNP-formulering, in de veldbeker. Maak de tienvoudige verdunning van een 100 millimolaire citroenzuurbuffervoorraad met behulp van ultrapuur water om een 10 millimolaire citroenzuurbuffer te creëren voor mRNA-verdunning.

Maak vervolgens C 12 200 ioniseerbare lipiden, helperlipiden, cholesterol en lipideverankerde PEG- of lipide PEG-voorraadoplossingen door elk lipide op te lossen in 100% ethanol. Zorg ervoor dat de voorraadoplossingen volledig zijn opgelost door ze te verwarmen en te mengen bij 37 graden Celsius. Combineer de berekende volumes van de verschillende lipidecomponenten in een conische buis.

Verdun de lipiden met 100% ethanol tot het uiteindelijke volume van V, wat overeenkomt met 25% van het uiteindelijke volume van LNP. Bereken de hoeveelheid mRNA die nodig is voor formulering op basis van de ioniseerbare lipide-mRNA-gewichtsverhouding en het totale volume mRNA-LNP. Ontdooi vervolgens de vuurvlieg luciferase die codeert voor mRNA op ijs.

Verdun vervolgens het mRNA tot een eindvolume dat driemaal zo hoog is als de organische fase met behulp van de 10 millimolaire citroenzuurbuffer. Spuit een delicaat taakdoekje met een oppervlakteontsmetting voor RNA's en DNA en veeg de binnenkant van het microfluïdische instrument grondig schoon. Open vervolgens een nieuwe microfluïdische cartridge en plaats deze met de inlaatkanalen naar beneden en van elkaar af.

Plaats twee steriele conische buisjes van 15 milliliter op de houder met de doppen eraf. Als u klaar bent, vult u een spuit van vijf milliliter met de mRNA-oplossing die mRNA bevat, verdund in een citroenzuurbuffer van 10 millimolair. Vul vervolgens een injectiespuit van drie milliliter met de lipidenoplossing met daarin de lipiden verdund in 100% ethanol.

Zorg ervoor dat u alle lucht uit de spuiten verwijdert. Steek vervolgens zonder de naald de spuit van vijf milliliter met de mRNA-oplossing in de linkerinlaat van de cartridge en steek de spuit van drie milliliter met de lipideoplossing in de rechterinlaat van de cartridge. Schakel het microfluïdische instrument in en selecteer snel uitvoeren.

Nadat u de juiste spuittypes hebt geselecteerd voor de ingebrachte spuiten van vijf en drie milliliter, voert u de parameters voor LNP-formulering in met een verhouding van drie op één waterig tot organisch debiet, voordat u op de startknop drukt om de mRNA-LNP's te formuleren. Laad de mRNA-LNP's die in de rechter conische buis zijn verzameld met een injectiespuit in de eerder gehydrateerde dialysecassettes zonder het cassettemembraan aan te prikken of aan te raken, plaats de dialysecassettes met de mRNA-LNP's terug in het bekerglas met PBS en laat ze ten minste twee uur dialyseren. Breng na de dialyse de dialysecassettes met de mRNA-LNP's in een steriele bioveiligheidskast en verwijder de mRNA-LNP's met behulp van een spuit met een naald.

Filter de mRNA-LNP's steriel met behulp van een spuitfilter van 0,22 micrometer en vang ze op in een steriele conische buis. Plaats vervolgens 65 microliter van de mRNA-LNP-oplossing in een microbuis van 1,5 milliliter voor karakterisering. Plaat 5, 000 HepG2-cellen in een witte wand, heldere bodem, 96-wells plaat in 100 microliter compleet celkweekmedium en incubeer de cellen 's nachts in een gecontroleerde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Verwijder voor de behandeling van cellen met mRNA-LNP's het volledige medium uit de putjes. Behandel de cellen vervolgens met ofwel 100 microliter mRNA-LNP's verdund in compleet celkweekmedium in de gewenste doses, ofwel 100 microliter compleet medium vóór een incubatie van 24 uur. Verwijder na incubatie het celkweekmedium van de plaat met 96 putjes, voeg 20 microliter lysisbuffer toe aan elk putje, gevolgd door 100 microliter van de luciferase-testreagentia.

Bescherm de plaat tegen licht en plaats de plaat in een plaatlezer om het bioluminescente signaal te meten. Verdun de mRNA-LNP-oplossing met behulp van steriele PBS zodat twee microgram totaal mRNA aanwezig is in 100 microliter van het injectievolume van de staartader. Vul een insulinespuit van 29 gauge met 100 microliter mRNA-LNP of 100 microliter PBS en verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit.

Steek de naald met de schuine kant naar boven in de laterale staartader van de muis en injecteer langzaam de 100 microliter mRNA-LNP of PBS. Bereid zes uur na injectie een 15 milligram per milliliter voorraadoplossing van D-Luciferine-kaliumzout in steriele PBS. Selecteer in de beeldvormingssoftware voor het in-vivobeeldvormingssysteem, of IVIS, het vakje naast luminescentie voordat u op initialiseren drukt om het instrument voor te bereiden op gegevensverzameling.

Dien vervolgens 200 microliter D-Luciferine intraperitonealie toe aan de eerder behandelde muizen en wacht 10 minuten terwijl het luciferasesignaal stabiliseert voordat de muizen worden verdoofd. Breng de verdoofde muizen over naar de neuskegels in het in vivo beeldvormingssysteem en zorg ervoor dat ze op hun rug liggen met hun buik bloot, voordat ze de kamerdeur sluiten. Zorg er in de beeldvormingssoftware voor dat het juiste gezichtsveld is geselecteerd en stel de belichtingstijd in op automatisch, klik op de knop Verkrijgen in de software om bioluminescentiebeelden te verkrijgen.

De inkapselingsefficiëntie van de mRNA-LNP's werd bepaald als 92,3% met behulp van de gemodificeerde fluorescentietest en -vergelijking die hier worden getoond. Toenemende bioluminescentie werd waargenomen bij behandeling van 5.000 HepG2-cellen met toenemende doses mRNA-LNP. Luciferase-expressie werd gemakkelijk gedetecteerd bij de laagste dosis van deze studie van vijf nanogram per putje.

Een sterk bioluminescentiesignaal werd waargenomen in de bovenbuik van de muizen die werden behandeld met geformuleerde LNP's. Interessegebieden werden rond de leversignalen getekend om de totale luminescente flux te berekenen. De totale lichtstroom was ongeveer vijf keer 10 tot de 9e.

Handhaaf altijd de gewichtsverhouding tussen ioniseerbare lipiden en nucleïnezuren bij het formuleren van LNP's. Elk volume van de organische fase moet ioniseerbaar lipide bevatten dat overeenkomt met mRNA in drie volumes van de waterige fase.