Onderzoek naar de beschermende effecten van Platycodin D op niet-alcoholische leververvetting in een palmitinezuur-geïnduceerd in vitro model

Deze methode demonstreert het gebruik van AML-12-cellen die modelconstructie mogelijk maken en de beschermende effecten van platycodine D op NAFLD onderzoeken. Te veel vertrouwen op het gebruik van diermodellen verhoogt de last van de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen. Het gebruik van celmodellen in het vroege stadium van de ontwikkeling van NAFLD-geneesmiddelen is praktischer en kosteneffectiever.

Dit TCM-model kan helpen het begrip van de biologische functie van platycodine D te verbeteren en het gebruik van andere TCM voor de behandeling van NAFLD te bestuderen. Begin met het zaaien van één milliliter AML-12-cellen per put in 12-putplaten. Verdeel vervolgens de 12-well plaat in vier verschillende behandelingsgroepen en label ze als controle, PD behandeld, PA behandeld en PA plus PD behandelde groep.

Voeg één milliliter van de normale celkweekmedia per put toe aan de controle- en de met PD behandelde groep. Voeg een milliliter van de normale celkweekmedia aangevuld met 300 micromolair palmitinezuur toe aan de met PA behandelde en PA plus PD behandelde groep. Verwijder na 24 uur incubatie het kweekmedium van de cellen en was de cellen vervolgens twee keer met één milliliter serumvrije media.

Voeg vervolgens één milliliter normale celkweekmedia aangevuld met een vehikel toe aan de controlegroep en één milliliter normale celkweekmedia aangevuld met één micromolair platycodine D aan de met PD behandelde groep. Voeg één milliliter normale celkweekmedia aangevuld met 300 micromolair palmitinezuur toe aan de met PA behandelde groep en één milliliter normale celkweekmedia aangevuld met 300 micromolair palmitinezuur en één micromolair platycodine D aan de met PA plus PD behandelde groep. Na het behandelen van de cellen gedurende 24 uur, was de cellen met een milliliter 1X PBS per put drie keer.

Bevlek vervolgens de cellen met 100 microliter 10 micromolaire DCFH-DA per put. Incubeer de cellen in het donker gedurende 30 minuten. Was na incubatie de cellen drie keer met 1X PBS en voeg een milliliter 1X PBS toe aan elke put.

Plaats de 12-well plaat op het microscoopstadium en gebruik een 20X-objectief om de morfologie van de cellen bij 200X vergroting te observeren. Om het mitochondriale membraanpotentiaal te meten, wast u de behandelde cellen die eerder zijn bereid drie keer met één milliliter 1X PBS per put. Bevlek vervolgens de cellen met 100 microliter van vijf microgram per milliliter JC-1 werkoplossing en incuber de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in het donker.

Was vervolgens de cellen drie keer met 1X PBS en voeg een milliliter 1X PBS toe aan elke put. Plaats de 12-well plaat op het microscoopstadium en gebruik een 20X-objectief om de morfologie van de cellen bij 200X vergroting te observeren. Lyseer de behandelde cellen en verzamel het cellysaat in microcentrifugebuizen van 1,5 milliliter.

Centrifugeer de buizen op 12.000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 5x SDS-pagina-monsterlaadbuffer toe aan het cellysaatsupernatant met een volumeverhouding van één tot vier. Plaats vervolgens de voorbereide 12% SDS-PAGE-gel met 12 putjes in de elektroforesetank en voeg 1X SDS-upmonsterbuffer verdund met ultrapuur water toe tot de aanbevolen hoogtelimiet.

Voer na SDS-PAGE-elektroforese de elektrooverdracht van de eiwitten uit naar een PVDF-membraan van 0,45 micron. Incubeer het membraan in vijf milliliter van de primaire antilichamen verdund in blokkerende buffer. Gebruik antilichamen die specifiek zijn voor LC-III, p62 en bèta-actine.

Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Incubeer vervolgens het PVDF-membraan met konijn anti-muis LGG HRP secundair antilichaam verdund één tot 10.000 in blokkerende buffer. Incubeer het membraan bij kamertemperatuur beschermd tegen licht gedurende twee uur.

Plaats na incubatie het PVDF-membraan op een plasticfolie. Voeg een geschikte hoeveelheid ECL-werkoplossing toe en incubeer gedurende twee minuten. Verwijder vervolgens de ECL-werkoplossing en stel het PVDF-membraan in het beeldvormingssysteem bloot voor beeldontwikkeling.

DCFH-DA-kleuring toonde aan dat platycodine D het niveau van intracellulaire ROS in de ALM-12-cellen aanzienlijk kon verminderen, wat aangeeft dat deze behandeling cellulaire oxidatieve stress kan verminderen. Bovendien was de groene fluorescentie die JC-1-monomeren of gedepolariseerde mitochondriën vertegenwoordigde hoger in de met palmitinezuur behandelde cellen dan in de onbehandelde cellen, terwijl de rode fluorescentie die de JC-1-dimeren of gepolariseerde mitochondriën vertegenwoordigde, lager was in de met palmitinezuur behandelde cellen dan de onbehandelde cellen, wat wijst op palmitinezuur-geïnduceerde MMP-depolarisatie. Bovendien nam in vergelijking met de modelgroep de verhouding tussen JC-1-monomeren en dimeren af in de platycodine D-behandelingsgroep, wat aangeeft dat het de door palmitinezuur geïnduceerde MMP kon verbeteren.

Eiwitexpressieniveaus van autofagie-gerelateerde eiwitten LC-III en p62 werden onderzocht door western blotting. De verhouding van LC-32 tot LC-31 nam aanzienlijk af en het eiwitexpressieniveau van p62 nam toe na behandeling met palmitinezuur. Aan de andere kant verlaagde platycodine D het eiwitexpressieniveau van p62 aanzienlijk en verhoogde het de verhouding van LC-32 tot LC-31, wat wijst op herstel van de autofagische flux geïnduceerd door palmitinezuur.

Als de fluorescentiewaarde van de cellen in de negatieve controlegroep relatief hoog is, kunnen de werkconcentraties van de fluorescerende sondes indien nodig worden aangepast.