Onderzoekende RNA-structuur met dimethylsulfaatmutatieprofilering met sequencing in vitro en in cellen

DMS-MaP is een op sequencing gebaseerde methode waarmee we een momentopname van de RNA-structuur kunnen krijgen en kunnen leren hoe deze onder verschillende omstandigheden verandert. In tegenstelling tot conventionele structuurbepalingsmethoden, zoals kristallografie en elektronenmicroscopie, kan DMS-MaP worden gebruikt in cellen en deconvolute RNA-structuurensembles. Omdat de RNA-structuur implicaties heeft in een groot aantal biologische verschijnselen, kan onze methode mechanistische inzichten bieden in bijna elk gebied van biologisch onderzoek.

Begin met het overbrengen van 89 microliter van de hervouwbuffer in een aangewezen buis van 1,5 milliliter voor elke reactie met een eindvolume van 100 microliter. Prewarm de buis op 37 graden Celsius in een thermoshaker die onder een chemische kap is geplaatst. Voeg 10 microliter nucleasevrij water toe aan een PCR-buis en breng er één tot 10 picomol RNA in over.

Incubeer het in een thermocycler bij 95 graden Celsius gedurende één minuut om het RNA te denatureren. En plaats de buis dan onmiddellijk op een ijsblok om RNA-misvouwen te voorkomen. Om het RNA opnieuw te vouwen, voegt u het monster toe aan de aangewezen buis met de hervouwbuffer bij 37 graden Celsius en mengt u het goed voordat u het gedurende 10 tot 20 minuten incubeert.

Voeg vervolgens een microliter 100% dimethylsulfaat of DMS toe, met een concentratie van 10,5 molair in de buis met het RNA-monster, en incubeer het reactiemengsel gedurende vijf minuten terwijl je het schudt met 800 tot 1.400 rotaties per minuut. Na de reactie van vijf minuten dooft u het met 60 microliter bèta-mercaptoethanol en mengt u het goed voordat u vortext en het RNA onmiddellijk op ijs plaatst. Reinig vervolgens het RNA en eluuteer het in 10 microliter nucleasevrij water.

Kwantificeer het RNA met behulp van een spectrofotometer. Bewaar ten slotte het gemodificeerde RNA bij min 80 graden Celsius. Breng na toevoeging van het reactiemengsel in de PCR-buis ten minste 100 nanogram van het geëlueerde gemodificeerde RNA in 10 microliter nucleasevrij water over naar de PCR-buis.

Incubeer het mengsel bij 57 graden Celsius gedurende 30 minuten tot 1,5 uur in een thermocycler. 30 minuten is voldoende om een product te maken dat 500 nucleotiden bevat. Voeg vervolgens een microliter van vier molaire natriumhydroxide toe, meng goed per pipet en incubeer gedurende drie minuten bij 95 graden Celsius om het RNA af te breken en TGIRT uit het complementaire DNA vrij te maken.

Gebruik een kolomgebaseerde aanpak om de primers te verwijderen en het complementaire DNA op te ruimen. En voer PCR uit om het te versterken. Controleer het PCR-succes door twee microliter van het PCR-product op een agarose-gel uit te voeren voordat u doorgaat met de voorbereiding van de bibliotheek.

Kwantificeer vervolgens de geëxtraheerde fragmenten met behulp van een spectrofotometer voordat u de fragmenten indexeert voor sequencing. Breng de met virus geïnfecteerde cellen die zijn gegroeid naar het gewenste infectiestadium over in een speciale en geschikte zuurkast met het vereiste bioveiligheidsniveau. Voeg 2,5% volume DMS toe aan het kweekmedium dat de cellen bevat en sluit de container af met parafilm.

Incubeer de container onmiddellijk bij 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Pipetteer na incubatie voorzichtig het DMS-bevattende medium en gooi het weg in geschikt chemisch afval. Voeg vervolgens voorzichtig 10 milliliter stopbuffer toe aan de cellen, schraap de cellen en breng ze over naar een conische buis van 15 milliliter.

Pellet de cellen af door de buis gedurende drie minuten te centrifugeren op 3.000 g. Verwijder het supernatant en was de celpellet twee keer met 10 milliliter PBS. Verwijder de resterende PBS voorzichtig zoveel mogelijk na de wasbeurt.

Los de pellet op in een geschikte hoeveelheid RNA-isolatiereagens om RNA-extractie uit te voeren. Voeg vervolgens 200 microliter chloroform toe aan één milliliter gehomogeniseerde cellen in het RNA-isolatiereagens en vortex het gedurende 15 tot 20 seconden totdat de celoplossing felroze wordt. Wacht tot de fasescheiding heeft plaatsgevonden, wat wordt aangegeven door de roze lipidefase die zich onderaan nestelt.

Draai de buis met een snelheid van ongeveer 20.000 g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius voordat de bovenste waterige fase naar een nieuwe buis wordt overgebracht. Reinig het RNA en eluuteer in een voldoende hoeveelheid nucleasevrij water. Na het uitvoeren van ribosomale RNA-depletie met behulp van de voorkeursbenadering, eluteer het RNA in een voldoende volume nucleasevrij water en kwantificeer het met behulp van een spectrofotometer.

Het gezuiverde RNA kan opnieuw worden gebruikt in RT-PCR. Met behulp van de genoemde webserver kunnen de DMS-MaP-gegevens gemakkelijk worden geanalyseerd. De reads worden toegewezen aan een referentie en de mutaties per base worden geteld.

De resulterende populatiegemiddelde bestanden kunnen worden gebruikt als beperkingen in bekende RNA-structuurvoorspellingssoftware. De resulterende minimale vrije energiestructuren kunnen worden gevisualiseerd met behulp van software zoals VARNA. Vanaf nu kan alleen de stabiele versie van DREAM RNA-structuurensembles deconvolueren.

Er wordt echter gewerkt aan het toegankelijker maken van deze functie voor de hele gemeenschap. In vitro transcriptie van het gBlock-fragment langwerpig door aanhechting van een T7-polymerasepromotor genereerde het RNA van belang en verscheen als een enkele band bij 300 nucleotiden op een 1% agarose-gel. Het succes van de genspecifieke RT-PCR uitgevoerd op het DMS gemodificeerde RNA werd aangegeven door een enkele band bij 300 basenparen op een 2% agarose gel.

Het geïndexeerde fragment verscheen ongeveer 150 basenparen hoger dan verwacht. Dms-behandeling werd uitgevoerd op HCT-8-cellen met cytopathisch effect vier dagen na infectie met het virus. Het geëxtraheerde totale RNA verscheen op de agarose-gel als twee heldere banden, goed voor de 40S- en 60S-subeenheden.

Na ribosomale RNA-uitputting verdwenen de twee heldere banden, waardoor een uitstrijkje in de overeenkomstige baan achterbleef. Na de voorbereiding van de bibliotheek hadden monsters verschillende grootteverdelingen en verschenen ze als een uitstrijkje. De band werd tussen de 200 en 500 nucleotiden weggesneden en de adapterdimeer werd gescheiden.

Het structuurmodel van het SARS-CoV-2-genoom toonde aan dat basen met open conformatie een hogere reactiviteit hebben in vergelijking met die met base pairing. Het reactiviteitsprofiel van de basen gaf aan dat uracil en guanine lage reactiviteitswaarden hadden en niet werden gewijzigd door DMS. Met onze methode zijn we in staat om structuren in cellen op een high-throughput manier te voorspellen zonder groottebeperkingen.

Control metrics zijn erg belangrijk, omdat ze inzicht geven in de nauwkeurigheid van de structuurvoorspellingen. Om de nauwkeurigheid van de voorspelling verder te verifiëren, moeten meer experimenten worden uitgevoerd die de structuur verstoren of wijzigen.