Contactmodus Atomic Force Microscopie als een snelle techniek voor morfologische observatie en bacteriële celschadeanalyse
30 juni 2023
Hier presenteren we de toepassing van atomic force microscopy (AFM) als een eenvoudige en snelle methode voor bacteriële karakterisering en analyseren we details zoals de bacteriële grootte en vorm, bacteriële cultuurbiofilms en de activiteit van nanodeeltjes als bactericiden.
Dit protocol toont het gebruik van contactmodus atoomkrachtmicroscopie om veranderingen in celmorfologie als gevolg van een specifieke ziekte of behandeling te observeren. Het wordt ten zeerste aanbevolen om verzegelde containers voor deze procedure te gebruiken om besmetting te voorkomen en het vaste monster zo snel mogelijk te analyseren om veroudering te voorkomen. Begin met het bevestigen van de monsters op de dia door de dia meerdere keren voorzichtig over een vlam te laten gaan totdat het monster droog is.
Plaats de vaste monsters in een petrischaaltje en transporteer ze naar de atoomkrachtmicroscoopapparatuur voor observatie. Schakel vervolgens de computer en de atoomkrachtmicroscoop in. Selecteer vervolgens de contactmodus, ContAI-G-sondes en automatische hellingsopties in de software.
Stel de standaardwaarden voor de Z-controller in door het instelpunt in te stellen op 20 nanometer, P-versterking op 10.000, I-versterking op 1.000, D-versterking op nul en tipspanning op nul millivolts. Plaats de monsters met behulp van de scanbereikkop van 70 micrometer in de AFM-contactmodus. Krijg een snel beeld van het oppervlak van het gebied onder de sonde met behulp van een camera die is gemonteerd op twee lenzen die in de scankop zijn geïntegreerd.
Kies nu het gewenste gebied door het handmatig in het XY-vlak te verplaatsen. Laat de sonde het monsteroppervlak elektronisch naderen totdat contact is bereikt. Pas het XY-meetvlak van de scanner en het monsteroppervlak elektronisch aan door de XY-hellingsrichting te verkleinen.
Stel de standaardparameters van de software in op één regel per seconde en 256 punten per lijn. Voer vervolgens een volledig scanbereik uit van een gebied van 70 bij 70 micrometer. Selecteer het kleinere gebied met het gereedschap Zoomen.
Selecteer een nieuw gebied uit het monster door de cantilever elektronisch in te trekken en het monster langs het XY-vlak te bewegen. Voer vervolgens een nieuwe scan uit zoals eerder is gedemonstreerd. Gebruik vervolgens de lijn voor regelnivellering in het menu Extra van de afbeelding in de filterselectie om gegevensverwerking uit te voeren.
Optimaliseer de maximale en minimale hoogte in de kleurenbalk om de beste afbeeldingsresolutie te verkrijgen. Voer ten slotte de beeldanalyse uit met behulp van het analysemenu. Selecteer het begin- en eindpunt met het gewenste gereedschap om de lengte en afstand te bepalen.
Atoomkracht microscopische analyse van de bacterieculturen toonde aan dat de Staphylococcus aureus-culturen werden verdeeld over zones met cocci-aggregaten. Grotere schalen toonden aan dat er een grotere waardering was voor populatieverdeling en cocci-morfologie. De AFM-contactmodusbeelden maakten het mogelijk om de grootte van de cocci te bepalen, die een gemiddelde breedte van 1,25 micrometer liet zien.
Pseudomonas hunanensis toonde een homogene verdeling over het gehele glassteunoppervlak en vormde een aanhangende monolaag. De culturen waren staafvormig met een lengte van 1,9 micrometer en een breedte van 0,9 micrometer. Microverdunningsblootstelling van magnesiumoxide nanodeeltjes van Staphylococcus aureus resulteerde in het verlies van een glad oppervlak en homogene contouren als gevolg van ernstige verslechtering van de cellulaire structuur.
Vesikelvorming en cytosolische materiaalafgifte werden waargenomen in culturen bij hogere concentraties dan de MIC. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in E.coli-culturen waarbij de controles gladde oppervlakken toonden die de homogene staafachtige vorm benadrukten. De structuur verdween volledig bij 1.000 PPM blootstelling aan nanodeeltjes met alleen onderscheidbare silhouetten.
Het is belangrijk om monsterfixatie correct uit te voeren, omdat dit essentieel is voor verdere analyse. Het afbeeldingsfilter zorgt voor een goede afbeeldingsresolutie en voorbeelddetails. Met behulp van de bevestigingsmethode kunnen contactloze AFM-modi worden toegepast die nuttig kunnen zijn bij de studie van mechanische eigenschappen.
Deze methodologie zou een goedkoop en nuttig hulpmiddel kunnen zijn voor medisch en microbiologisch onderzoek gericht op bacteriële celschadeanalyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie maakt gebruik van atoomkrachtmicroscopie (AFM) voor gedetailleerde bacteriële karakterisering, met focus op bacteriële grootte, vorm, kweekbiofilms en de bacteriedodende effecten van nanodeeltjes. Het protocol benadrukt zorgvuldige monstervoorbereiding en specifieke beeldvormingstechnieken om morfologische veranderingen in bacteriële cellen waar te nemen.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Microbiologie
- Bacteriële karakterisering
- Nanodeeltjesonderzoek
Achtergrond
- Atomaire krachtmicroscopie is een belangrijk hulpmiddel voor het observeren van bacteriële morfologie.
- Inzicht in bacteriële biofilmvorming en respons op bactericiden helpt bij medisch onderzoek.
- Monstervoorbereiding is cruciaal voor nauwkeurige beeldvorming en analyse.
Gebruikte methoden
- Atomaire krachtmicroscopie in contactmodus
- Staphylococcus aureus en Pseudomonas hunanensis culturen
- Nanodeeltjesblootstellingstests
Belangrijkste resultaten
- AFM-analyse onthulde grootte en verdeling van bacteriële cellen, waarbij Staphylococcus aureus een gemiddelde breedte van 1,25 micrometer vertoonde.
- Verhoogde concentraties magnesiumoxidenanodeeltjes leidden tot significante morfologische veranderingen in bacteriële cellen.
- De studie toont de effectiviteit van AFM aan voor het analyseren van de structurele integriteit van bacteriën.
Conclusies
- Deze methodologie benadrukt de bruikbaarheid van AFM in de microbiologie, met name bij het beoordelen van bacteriële schade.
- De bevindingen dragen bij aan de bredere kennis van bacteriële reacties op behandelingen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Contact mode atomic force microscopy (AFM) enables rapid, high-resolution morphological assessment of bacterial cells, supporting early-stage evaluation of antimicrobial interventions. This technique provides actionable 3D topography and cell damage data without the complexity or cost of electron microscopy, facilitating efficient screening of nanoparticle effects on bacterial integrity. AFM's operational simplicity and quantitative outputs position it as a valuable tool for mechanistic de-risking and target validation in anti-infective discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of bacterial cell morphology and structural changes following compound exposure.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell damage and morphological disruption at the nanoscale.
- Facilitates rapid hypothesis testing regarding antimicrobial mechanisms of action.
Screening & Assay Development
- Provides reproducible, quantitative topographical data for assay standardization and validation.
- Accelerates screening of nanoparticle or compound libraries for bactericidal effects.
- Delivers high-content imaging outputs suitable for downstream comparative analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns morphological readouts with translational biomarkers of bacterial cell integrity.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical validation of antimicrobial candidates.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust evidence of cellular impact.
Pipeline & Workflow Integration
AFM contact mode integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early, quantitative assessment of bacterial cell damage and morphology in response to candidate interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven evaluation of antimicrobial mechanisms and cellular targets.
- Screening: Delivers standardized, reproducible imaging data for compound triage and prioritization.
- Analytics: Provides quantitative measurements of cell size, surface integrity, and morphological disruption.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical models by aligning morphological endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform for repeated use across diverse bacterial strains and compound classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antimicrobial efficacy and mechanism-of-action studies.
- Operational Value: Reduces time and cost compared to electron microscopy while maintaining high-resolution outputs.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing robust, quantitative evidence of cellular impact.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antimicrobial candidates based on direct morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation and sample preparation to ensure data quality.
- Needs access to AFM instrumentation with contact mode capability and appropriate probes.
- Demands standardized protocols for sample fixing and imaging to ensure reproducibility across teams.
- Adaptable to various bacterial strains and nanoparticle types with protocol optimization.
- Sample aging and contamination must be minimized to preserve morphological integrity for analysis.
