Name: Real-time kwantificering van de effecten van IS200/IS605 Family-Associated TnpB op Transposon-activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 4 s
Description: Leer hoe je TnpB-transposonactiviteit in levende Escherichia coli-cellen kwantificeert met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult dynamiek op enkel-celniveau.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiële steun voor dit onderzoek werd verstrekt door start-upfondsen van de Universiteit van Californië.

1. Bereiding van bacterieculturen
<ol><li>Kweek E. coli stam MG1655 met plasmide transposon constructen (eerder beschreven in Kim et al.8) 's nachts in LB met de juiste antibiotica (25 μg/ml kanamycine, zie Materiaaltabel) bij 37 °C. OPMERKING: De sequenties van de gebruikte constructen en de bijbehorende sequenties zijn beschikbaar als GenBank20 toetredingsnummers OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 en OP717085.</li>
	<li>Om een exponentiële groei in steady-state te bereiken, ≥100 vouwen in het M63-medium (100 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 1,8 μM FeSO4, 15 mM [NH4] 2SO4, 0,5 μg / ml thiamine [vitamine B1]) aangevuld met een koolstofbron (0,5% w / v glucose hier) en geschikte antibiotica (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Kweek culturen bij 37 °C totdat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) ~0,2 bereikt. De culturen zijn klaar voor gebruik.</li>
</ol>2. Dia voorbereiding
<ol><li>Bereid een dia door M63 met 0,5% w/v glucose en 1,5% w/v agarose in de magnetron te koken om de agarose te smelten en ervoor te zorgen dat deze volledig gesmolten en goed gemengd is.</li>
	<li>Laat het mengsel afkoelen tot ~55 °C voordat u antibiotica en inductoren toevoegt (25 μg/ml Kanamycine en 10 ng/μL anhydrotetracycline [aTc], zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats een microscoopglaasje op de werkbank. Stapel nog twee dia's loodrecht op de eerste en plaats een andere op de bovenkant, parallel aan de onderste dia. Zorg ervoor dat er een opening is die gelijk is aan één schuifdikte tussen de onderste en bovenste dia's. Pipet ~ 1 ml van het M63 agarose mengsel in deze opening tussen de dia's langzaam om een klein gel vierkant te creëren.</li>
	<li>Zodra de gel is gestold (~ 10-15 min), schuift u de bovenste schuif om deze te verwijderen. Trim de agarose pad met een scheermes of mes. Pipetteer vervolgens 2,5 μL van de kweek (stap 1.3) en leg de deklip erop.</li>
	<li>Sluit de ruimte tussen de glijbaan en de afdekplaat af met epoxy (zie Materiaalopgave). Laat de epoxy drogen en de cellen minstens 1 uur bij 37 °C op de agarose pad bezinken.</li>
</ol>3. Timelapse fluorescentiemicroscopie
<ol><li>Plaats het bereide monster (stap 1.3) op een fluorescentiemicroscoop (zie materiaaltabel) in een omgeving die verwarmd en op 37 °C wordt gehouden.<ol><li>Stel de belichtingstijden in die geschikt zijn voor de camera die wordt gebruikt voor beeldacquisitie. Pas de verlichtingsintensiteit aan om fotobleaching te minimaliseren. OPMERKING: Voor dit onderzoek werd een blootstellingstijd van 2 s voor elke golflengte gebruikt.</li>
		<li>Zoek voor elke golflengte een gezichtsveld (FOV) met minimale fluorescentie. Verkrijg afbeeldingen om te gebruiken tijdens de analyse voor achtergrondaftrek.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel een protocol op om afbeeldingen in een raster op verschillende golflengten en met regelmatige tijdsintervallen te verkrijgen.<ol><li>Codeer timelapse-fotografie in het protocol. Stel de acquisitiefrequentie in op het gewenste tijdsinterval (20 min hier) en de totale timelapse-duur op de gewenste lengte (24 uur).</li>
		<li>Codeer de juiste golflengten in het protocol (afhankelijk van de gebruikte constructie). OPMERKING: De mCherry excitatiepiek ligt op 587 nm en de emissiepiek op 610 nm21; mVenus is op 515 nm en 527 nm12, terwijl mCerulean3 op 433 nm en 475 nm11 ligt.</li>
		<li>Stel de rastergrootte in om vast te leggen tussen het gewenste aantal FOV's. OPMERKING: De hier getoonde representatieve gegevens gebruikten 8 x 8 FOV's.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Beeldanalyse
<ol><li>Voer achtergrondaftrek uit op elk kleurkanaal met behulp van de respectieve achtergrondafbeeldingen die zijn verkregen in stap 3.1.2. Voor alle analysestappen gebruiken we standaardmodules in het open-source platform Fiji22 (zie Materiaalopgave).</li>
	<li>Benader de totale populatie op elk moment in de tijd door het mCerulean-kanaal te drempelen en het drempelgebied te delen door het gemiddelde celoppervlak.</li>
	<li>Om de unieke excisiegebeurtenissen te tellen, neemt u de tijdsderivaat van het mCerulean3-kanaal. Voer dit uit door opeenvolgende afbeeldingen in het mCerulean3-kanaal af te trekken. De excisiegebeurtenissen worden gedetecteerd in de tijdderivaat als een heldere flits van fluorescentie.<ol><li>Drempel de stapel excisiegebeurtenissen om ongewenste fluorescentie te elimineren. Merk op dat dit proces delen van de excisies zelf zal drempelen. Om dit op te lossen, verwijdt u de afbeeldingen om de excisies in hun oorspronkelijke grootte te herstellen. OPMERKING: Analyses met vergelijkbare drempel- en beeldanalysetechnieken kunnen ook op de andere fluorescentiekanalen worden uitgevoerd (bijv. excisiegebeurtenissen correleren met niveaus van transposase TnpA [gele Venusfluorescentie] en TnpB [rode mCherry-fluorescentie].</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Cowley, M., Oakey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+re-wire+and+fine-tune+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome.</a> PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).</li>
<li>Schneider, D., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+insertion+sequence+elements+during+experimental+evolution+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria.</a> Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).</li>
<li>Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+elements+as+mutator+genes+in+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposable elements as mutator genes in evolution.</a> Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).</li>
<li>Coufal, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+in+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition in human neural progenitor cells.</a> Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).</li>
<li>Kano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L1+retrotransposition+occurs+mainly+in+embryogenesis+and+creates+somatic+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism.</a> Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).</li>
<li>Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE+dancing+in+the+human+genome%3A+transposable+elements+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease.</a> Genome Medicine. 1 (10), 97(2009).</li>
<li>Goodier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrotransposition+in+tumors+and+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Retrotransposition in tumors and brains.</a> Mobile DNA. 5, 11(2014).</li>
<li>Kim, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+transposable+element+activity+in+individual+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Real-time transposable element activity in individual live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).</li>
<li>Lutz, R., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+and+tight+regulation+of+transcriptional+units+in+Escherichia+coli+via+the+LacR%2FO%2C+the+TetR%2FO+and+AraC%2FI1-I2+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements.</a> Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).</li>
<li>Calos, M. P., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+sequence+change+resulting+from+the+IQ1+mutation%2C+which+greatly+increases+promoter+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+General+Genetics+MGG%22%5BJournal%5D)">The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength.</a> Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).</li>
<li>Markwardt, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+cerulean+fluorescent+protein+with+enhanced+brightness+and+reduced+reversible+photoswitching%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching.</a> PLoS One. 6 (3), 17896(2011).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).</li>
<li>Kersulyte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposable+element+ISHp608+of+Helicobacter+pylori%3A+nonrandom+geographic+distribution%2C+functional+organization%2C+and+insertion+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity.</a> Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).</li>
<li>Shmakov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+evolution+of+class+2+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems.</a> Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).</li>
<li>Bao, W., Jurka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologues+of+bacterial+TnpB_IS605+are+widespread+in+diverse+eukaryotic+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+DNA%22%5BJournal%5D)">Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements.</a> Mobile DNA. 4 (1), 12(2013).</li>
<li>Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+insertion+sequences%3A+their+genomic+impact+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity.</a> FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).</li>
<li>Altae-Tran, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+IS200%2FIS605+transposon+family+encodes+diverse+programmable+RNA-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases.</a> Science. 374 (6563), 57-65 (2021).</li>
<li>Karvelis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-associated+TnpB+is+a+programmable+RNA-guided+DNA+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease.</a> Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).</li>
<li>Kaur, D., Kuhlman, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IS200%2FIS605+family-associated+TnpB+increases+transposon+activity+and+retention%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Benson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenBank%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GenBank.</a> Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ton-Hoang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Stranded+DNA+transposition+is+coupled+to+host+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication.</a> Cell. 142 (3), 398-408 (2010).</li>
<li>Wang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+growth+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Robust growth of Escherichia coli.</a> Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De unieke methode die hier wordt gepresenteerd voor real-time beeldvorming van transponeerbare elementactiviteit in levende cellen is een gevoelige test die transpositie in levende cellen en in realtime direct kan detecteren en deze activiteit kan correleren met de expressie van accessoire eiwitten. Hoewel de doorvoer lager is dan kan worden bereikt met bulkmethoden, bereikt deze methode gedetailleerde metingen van TE-activiteit en eiwitexpressie in individuele levende cellen.
Een verscheidenh...

Transponeerbare elementen (TSE's) zijn genetische elementen die in hun gastheergenomen mobiliseren door excisie of katalyseren kopiëren gevolgd door genomische re-integratie. TSE's bestaan in alle domeinen van het leven en transpositie herstructureert het gastheergenoom, muteert coderings- en controlegebieden1. Dit genereert mutaties en diversiteit die een belangrijke rol spelen in evolutie 2,3, ontwikkeling 4,5 en verschillende menselijke ziekten6, waaronder kanker7.
Met behulp van nieuwe genetische constructies die aspecten van transpositieve activiteit koppelen aan fluorescerende verslaggevers, beschreef ons eerdere werk de ontwikkeling van een experimenteel systeem op basis van de bacteriële TE IS608, een vertegenwoordiger van de wijdverspreide IS200 / IS605-familie van TSE's, die de real-time visualisatie van transpositie in individuele levende cellenmogelijk maakt 8 (figuur 1). Het TE-systeem wordt weergegeven in figuur 1A. De TE bestaat uit de transposasecoderingssequentie, tnpA, geflankeerd door Left End (LE) en Right End (RE) imperfect palindromic repeats (IP's), die de herkennings- en excisieplaatsen voor TnpA zijn. tnpA wordt uitgedrukt met behulp van de promotor PLTetO1, die wordt onderdrukt door de tet-repressor en induceerbaar is met anhydrotetracycline (aTc)9. De TE splitst de -10 en -35 sequenties van een constitutieve PlacIQ1 promotor10 voor de blauwe reporter mCerulean311. Zoals te zien is in figuur 1C, kan de TE worden weggesneden wanneer de productie van tnpA wordt geïnduceerd, wat leidt tot reconstructie van promotors. De geproduceerde cel drukt mCerulean3 uit en fluoresceert blauw. De N-terminus van TnpA is gefuseerd met de gele reporter Venus12, waardoor de TnpA-niveaus kunnen worden gemeten door gele fluorescentie.
IS608 en andere leden van de IS200/IS605-familie van transposons coderen meestal ook voor een tweede gen van de tot nu toe onbekende functie, tnpB13. De TnpB-eiwitten zijn een enorm overvloedige maar onvolmaakt gekarakteriseerde familie van nucleasen gecodeerd door verschillende bacteriële en archaeale TSE's 14,15, die vaak alleen uit tnpB16 bestaan. Bovendien hebben recente studies hernieuwde interesse in TnpB door te vinden dat TnpB functioneert als een CRISPR / Cas-achtige programmeerbare RNA-geleide endonuclease die dsDNA- of ssDNA-pauzes onder verschillende omstandigheden zal opleveren17,18. Het blijft echter onduidelijk welke rol TnpB kan spelen bij het reguleren van de omzetting. Om real-time visualisatie van de effecten van TnpB op IS608-transpositie uit te voeren, werd een versie van de transposon gemaakt, inclusief het coderende gebied van TnpB met een N-terminale fusie tot het rode fluorescerende eiwit mCherry.
Als aanvulling op meer gedetailleerde studies op bulkniveau uitgevoerd door het Kuhlman-lab19, wordt hier getoond hoe real-time beeldvorming van transposonactiviteit kwantitatief de impact van TnpB of andere accessoire eiwitten op transpositiedynamiek kan onthullen. Door TnpB te fuseren met mCherry, worden de individuele transpositiegebeurtenissen geïdentificeerd door blauwe fluorescentie en gecorreleerd met expressieniveaus van TnpA (gele fluorescentie) en TnpB (rode fluorescentie).

<table><tbody><tr><td>2 Ton Clear Epoxy</td><td>Devcon</td><td>31345</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5066</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AX1385-1</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td></td></tr><tr><td>Argon Laser</td><td>Melles Griot</td><td>35-IMA-840-015</td><td></td></tr><tr><td>Blue Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Discontinued</td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 &micro;L, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491504</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 &micro;L, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene)</td><td>Eppendorf North America Biotools</td><td>22491555</td><td></td></tr><tr><td>Ferrous Sulfate Acs 500 g</td><td>Fisher Scientific</td><td>706834</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td>Fiji (imagej.net)</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&nbsp;LB Broth, Miller (Granulated)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9723-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass Cover Slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1355006</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate Cert Ac</td><td>Fisher Scientific</td><td>XXM63SP3KG</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Heater</td><td>World Precision Instruments</td><td>96810-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>17001H</td><td></td></tr><tr><td>ProScan III Stage</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Red Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M</td><td></td></tr><tr><td>Sapphire 561 LP Laser</td><td>Coherent</td><td>1170412</td><td></td></tr><tr><td>Slide, Microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>125535B</td><td></td></tr><tr><td>Thiamine Hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich (SIAL)</td><td>T1270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ti-LU4 Laser Launch</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yellow Filter Cube</td><td>Chroma</td><td>Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time kwantificering van de effecten van is200/is605 family-associated tnpb op transposon-activiteit

Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity

Hier wordt een protocol geschetst om live, real-time beeldvorming uit te voeren van transponeerbare elementactiviteit in levende bacteriële cellen met behulp van een reeks fluorescerende melders gekoppeld aan transpositie. Het laat met name zien hoe real-time beeldvorming kan worden gebruikt om de effecten van het accessoire eiwit TnpB op de activiteit van het transponeerbare element IS608, een lid van de IS200/IS605-familie van transponeerbare elementen, te beoordelen. De IS200/IS605 familie van transponeerbare elementen zijn overvloedige mobiele elementen verbonden met een van de meest ontelbare genen in de natuur, tnpB. Sequentie homologieën suggereren dat het TnpB-eiwit een evolutionaire voorloper kan zijn van CRISPR / Cas9-systemen. Bovendien heeft TnpB hernieuwde interesse gekregen, waarvan is aangetoond dat het fungeert als een Cas-ACHTIG RNA-geleid DNA-endonuclease. De effecten van TnpB op de transpositiesnelheden van IS608 worden gekwantificeerd en er wordt aangetoond dat de expressie van TnpB van IS608 resulteert in ~ 5x verhoogde transposonactiviteit in vergelijking met cellen zonder TnpB-expressie.

Deze methode voor het visualiseren van transposon-activiteit in levende cellen door fluorescentiemicroscopie, terwijl het een lagere doorvoer heeft dan bulkfluorescentiemetingen, maakt directe visualisatie van transposon-activiteit in individuele levende cellen mogelijk. Transposon-excisiegebeurtenissen resulteren in de reconstitutie van de promotor voor mCerulean3 (figuur 1), waardoor cellen die transposonactiviteit ondergaan door felblauwe fluorescentie kunnen worden geïdentificeerd (<stro...

Er wordt een protocol geschetst om live real-time beeldvorming uit te voeren om te kwantificeren hoe het accessoire-eiwit TnpB de dynamiek van transpositie in individuele levende Escherichia coli-cellen beïnvloedt.

Real-time kwantificering van de effecten van IS200/IS605 Family-Associated TnpB op Transposon-activiteit

Here, a protocol is outlined to perform live, real-time imaging of transposable element activity in live bacterial cells using a suite of fluorescent ...

Dit protocol stelt ons in staat om excisiestatistieken te kwantificeren op basis van één cel, in tegenstelling tot het kijken naar bulkgedrag. Op dit niveau kunnen we het gedrag van individuele cellen in de loop van de tijd volgen, inclusief hun TnpA- en TnpB-niveaus voor cellen die wegsnijden versus cellen die dat niet doen, waardoor we bijvoorbeeld de effecten van geïdentificeerde mutatiegebeurtenissen op de groeisnelheid kunnen meten. Deze methode is een eenvoudige, goedkope manier om de mutatiedynamiek van levende cellen te meten.De algemene benadering is van toepassing op elk systeem dat fluorescerende beeldvorming met levende cellen vereist. Bereid een dia door M63 te koken met 0,5% glucose en 1,5% agarose in de magnetron om de agarose te smelten. Zorg ervoor dat het medium volledig gesmolten en goed gemengd is.Laat het mengsel afkoelen tot 55 graden Celsius voordat u antibiotica en inductoren toevoegt. Plaats een microscoopglaasje op de werkbank. Stapel één dia loodrecht op de eerste.Zorg ervoor dat er een opening is die gelijk is aan één schuifdikte tussen de onderste en bovenste dia. Pipetteer een milliliter van het M63 agarose mengsel langzaam in de opening tussen de glijbaan om een klein gel vierkant te creëren. Zodra de gel is gestold, schuift u de bovenste schuif om deze te verwijderen.Trim de agarose pad met een scheermes of mes. Pipetteer vervolgens 2,5 microliter van de bacteriecultuur en leg de afdekslip erop. Sluit de ruimte tussen de glijbaan en de afdekslip af met epoxy.Laat de epoxy drogen en de cellen een uur lang op het agarosekussen bezinken bij 37 graden Celsius. Plaats het bereide monster op een fluorescentiemicroscoop in een omgeving die wordt verwarmd en op 37 graden Celsius wordt gehouden. Zoek voor elke golflengte het gezichtsveld met minimale fluorescentie.Stel een protocol op om afbeeldingen in een raster op verschillende golflengten en met regelmatige tijdsintervallen te verkrijgen. Transposon-excisiegebeurtenissen resulteren in de reconstitutie van de promotor voor mCerulean3, waardoor cellen kunnen worden geïdentificeerd die transposonactiviteit ondergaan door felblauwe fluorescentie. TnpB verbetert de transponeringsexcisiesnelheid.Cellen die accessoire-eiwit TnpB tot expressie brengen, ervaren vier tot vijf keer hogere niveaus van transposonactiviteit in vergelijking met TnpB-negatieve cellen. In TnpB-positieve cellen hebben cellen die transposon-excisiegebeurtenissen ondergaan hogere expressieniveaus van mCherry TnpB dan de algemene bevolking. Bovendien, voor cellen die excisiegebeurtenissen ondergaan, vertonen TnpB-positieve cellen slechts marginaal hogere niveaus van veneuze TnpA-transposase dan TnpB-negatieve cellen, wat hoger is dan de gele fluorescentie van de algemene bevolking.De meest waarschijnlijke plaats om te worstelen is in de voorbereiding van de celcultuur voor het experiment. Je moet ervoor zorgen dat cellen worden gekweekt tot exponentiële fase en dat de dia wordt ingeënt met een geschikt aantal cellen. Vergeet niet om uit te kijken voor bubbels bij het afsluiten van de glijbaan, zodat de agarose-gel niet uitdroogt.

real-time-quantification-effects-is200is605-family-associated-tnpb-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Kazi, M. I., et. al., Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the selection, quantification, and preservation of Gram-negative recipient bacteria carrying transposon insertions based on kanamycin resistance.

Isolation of Gram-Negative Bacteria with Genomic Transposon Insertions

Hier beschrijven we een protocol met behulp van de mini-himar1 mariner-transposon mutagenese voor het genereren van een hoge dichtheid insertiemutant bibliotheek scherm, isoleren en identificeren van nieuwe alginaat toezichthouders in de prototypische Pseudomonas aeruginosa stam PAO1.

Identificatie van nieuwe genen geassocieerd met alginaat Productie in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Het gebruik van mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mariner transposon-gemedieerde mutagenese

Enterobacter sp. YSU groeit in glucose minimale zouten medium. Auxotrofen worden gegenereerd door transformatie met een transposome die willekeurig plaatst zichzelf in het gastheergenoom. Mutanten worden gevonden door replica plating van complexe medium tot minimaal medium. Onderbroken genen worden geïdentificeerd door gen-rescue en sequencing.

Generatie Enterobacter Sp. YSU auxotrofen behulp Transposon Mutagenesis

Hier schetsen we de workflow voor het gebruik van het TetON-systeem om weefselspecifieke genregulatie te bereiken in de regenererende staartvin van een volwassen zebravis.

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

Hier, werd de kracht van een transposon-gemedieerde willekeurige invoeging van een niet-coderende DNA element gebruikt om op te lossen zijn optimale chromosomale positie.

Bepaling van de optimale chromosomale locatie (s) voor een DNA Element in Escherichia coli met behulp van een nieuwe benadering van Transposon-gemedieerde

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Hier beschrijven we een techniek die transposon mutagenese met hoge gegevensdoorvoer sequencing combineert te identificeren en kwantificeren van transposon leptospiral mutanten in weefsels na een uitdaging van hamsters. Dit protocol kan worden gebruikt voor scherm mutanten voor overleving en verspreiding in dieren en kan ook worden toegepast op in vitro studies.

High-throughput parallelle Sequencing maatregel fitness van Leptospira interrogans Transposon invoeging mutanten tijdens Golden Syrische Hamster infectie

Dit protocol beschrijft een methode om stabiele integratie van een gen van belang in het menselijk genoom door het transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty -systeem. Voorbereiding van de integratie van defecte lentivirale vectoren, de in vitro -transductie van menselijke cellen en de moleculaire test op getransduceerde cellen worden gemeld.

Een efficiënte In Vitro omzetting methode door een Transcriptionally gereglementeerde Sleeping Beauty systeem verpakt in een defecte lentivirale Vector integratie

We beschrijven een methode om verzadigende transposon mutantbibliotheken te genereren in gramnegatieve bacteriën en de daaropvolgende voorbereiding van DNA-ampliconbibliotheken voor hoge doorvoersequenties. Als voorbeeld richten we ons op de ESKAPE-ziekteverwekker, Acinetobacter baumannii,maar dit protocol is vatbaar voor een breed scala aan gramnegatieve organismen.

Transposon Insertion Libraries genereren in gram-negatieve bacteriën voor high-throughput sequencing

Dit is een aangepaste methode voor het identificeren van kandidaat-insectenkolonisatiefactoren in een Burkholderia gunstige symbiont. De kevergastheer is geïnfecteerd met een willekeurige mutantenbibliotheek gegenereerd via transposonmutagenese en de complexiteit van de bibliotheek na kolonisatie wordt vergeleken met een controle die in vitrois gekweekt.

Transposon-insertion Sequencing als een hulpmiddel om bacteriële kolonisatiefactoren in een Burkholderia gladiolen symbiont van Lagria villosa Kevers op te helderen

Leer hoe je TnpB-transposonactiviteit in levende Escherichia coli-cellen kwantificeert met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult dynamiek op enkel-celniveau.

Real-time kwantificering van de effecten van IS200/IS605 Family-Associated TnpB op Transposon-activiteit

Meer video's verkennen