Op immunostaining gebaseerde detectie van dynamische veranderingen in rode bloedceleiwitten
17 maart 2023
Het vastleggen van dynamische veranderingen in de eiwitactivering van geënucleeerde rode bloedcellen brengt methodologische uitdagingen met zich mee, zoals het behoud van dynamische veranderingen in acute stimuli voor latere beoordeling. Het gepresenteerde protocol beschrijft monstervoorbereidings- en kleuringstechnieken die het behoud en de analyse van relevante eiwitveranderingen en daaropvolgende detectie mogelijk maken.
Onze methode maakt mechanistisch subcellulair onderzoek mogelijk in het snel bewegende veld van de mechanobiologie door tijdelijke eiwitmodificaties op hun plaats te fixeren en deze vervolgens te detecteren met specifieke antilichamen. Deze methode is technisch eenvoudig toe te passen. De resultaten zijn zeer valide en reproduceerbaar.
In vergelijking met andere technieken zou onze methode ook echt effectief kunnen worden gebruikt in het opkomende gebied van posttranslationele rode bloedcelsignalering, die afhankelijk is van tijdelijke eiwitmodificaties, met name mechanosignalering van rode bloedcellen. Om RBC-eiwitfixatie uit te voeren, verdunt u volbloed in een verhouding van één tot twee in 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer de bloedoplossing gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 132 g en verwijder het supernatant voorzichtig.
Resuspensie van de RBC-pellet in twee volumes van 0,1 molaire PBS en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer nogmaals het monster en verwijder het supernatant voordat u de RBC-pellet opnieuw in één volume van 0,1 molaire PBS suspenseert. Label een microscoopglaasje met de monster-ID en het antilichaam aangebracht met een alcoholbestendige pen.
Voeg 10 microliter van de bereide RBC-oplossing toe. Plaats een tweede dia op het monster onder een hoek van 45 graden en verdeel het monster gelijkmatig over de dia. Verwarm de dia door het monster met een constante beweging gedurende vijf tot zeven seconden over de Bunsen-brander te laten zweven.
Voor immunohistochemische kleuring markeert u het 2/3-gebied van de dia als een test en 1/3 als een controle met behulp van een vetpotlood. Was vervolgens de monstergebieden twee keer door TBS gedurende 30 seconden aan te brengen. Voeg na de tweede wasbeurt 0,1% trypsine toe en bedek de dia met behulp van een speciaal gebouwde incubatiekamer met een deksel.
Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Vul een bekerglas met leidingwater en stop de enzymreactie door het leidingwater uit het bekerglas aan de glijbaan toe te voegen. Giet de oplossing af en was beide gebieden drie keer met TBS.
Voeg na de laatste wasbeurt peroxidase-blokkerende oplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Giet na incubatie de oplossing af en was beide gebieden drie keer met TBS. Voeg vervolgens 3% magere melkoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten.
Giet na incubatie de oplossing af en voeg de primaire antilichaamoplossing toe aan het testgebied. Voeg een antilichaamcontroleoplossing toe aan het controlegebied. Incubeer de monsters bij vier graden Celsius gedurende een nacht.
Giet de volgende dag de antilichaamoplossing af en was beide gebieden drie keer met TBS. Voeg vervolgens 3% normale geitenserumoplossing toe om niet-specifieke binding te voorkomen en gedurende 30 minuten te incuberen. Voeg na incubatie een secundaire antilichaamoplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten.
Giet de antilichaamoplossing af en was de gebieden drie keer met TBS voordat u doorgaat met de ontwikkeling van kleuring. Voeg vervolgens een avidine-gekoppelde mierikswortelperoxidasereactie toe en voeg verdunde avidineperoxidase-oplossing toe en incubeer gedurende 30 minuten. Plaats de dia onder een microscoop met een vergroting van 200 keer en voeg vers bereide DAB-oplossing toe aan beide gebieden.
Controleer de kleuring van de RBC's continu en stop de vlekken door de DAB-oplossing te verwijderen met een wegwerppipet voordat de achtergrond begint te kleuren. Om uitdroging van het monster uit te voeren, plaatst u de dia in een glazen rek en dompelt u gedurende vijf seconden elk onder in toenemende ethanolconcentraties en ten slotte in xylol. Plaats na uitdroging de dia op tissuepapier met de RBC's aan de bovenkant om overtollig vocht te absorberen.
Voeg twee of drie druppels montagemedium toe aan een afdekplaat en bedek de dia met de afdekplaat. Voor visualisatie en beeldvorming plaatst u de dia in een microscoop met doorgelaten licht in combinatie met een camera. Schakel de lichtbron en camera in en start de software.
Stel onder de Bright-Field-modus de RBC's scherp door aan de knoppen voor grove en fijne scherpstelling te draaien. Stel de RBC's op dezelfde manier scherp onder de fluorescerende modus. Voor het analyseren van de grijswaarde van RBC markeert u de rand van elke RBC met het gereedschap Oval Selection in de ImageJ-software.
Meet met de opdracht Meten de grijswaarden van 50 RBC's uit de test en 10 RBC's uit het besturingselement. Voor immunofluorescente kleuring van RBC-eiwitten, incubeer het monster met een secundair fluorescerend geconjugeerd antilichaam gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, waardoor het wordt beschermd tegen licht. Giet na incubatie de antilichaamoplossing af en was de dia drie keer met TBS.
Laat de TBS na de laatste wasbeurt op het monster zitten. Droog het monster uit en bereid de dia voor met een afdekstrook voor microscopische evaluatie, zoals aangetoond. Schakel de microscoop en de fluorescerende lichtbron in en stel de RBC's scherp in een Bright-Field Mode.
Leg heldere veld- en fluorescerende afbeeldingen vast in ten minste drie verschillende gebieden van het testgebied van de dia die willekeurig zijn geselecteerd. Stel de belichtingstijd in op één seconde voor fluorescerende afbeeldingen en leg een afbeelding vast. Schakel vervolgens over naar de helderveldmodus, stel de belichtingstijd in op Automatisch en leg het bijbehorende helderveldbeeld vast.
Sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling. Leg fluorescerende en heldere veldbeelden vast in ten minste twee verschillende willekeurig geselecteerde gebieden van het besturingsgebied van de dia. Sla de afbeeldingen op in TIFF-indeling om de oorspronkelijke grijswaarden van pixels te behouden, compressie te voorkomen en metagegevens van de acquisitie over te dragen.
Als u de grijswaarden van vastgelegde RBC's wilt meten, opent u ImageJ. Markeer elke cel met het gereedschap Ovale selectie en analyseer met de opdracht Meten. Markeer tussen de drie en vijf gebieden die vrij zijn van RBC's en bepaal de grijswaarden om het achtergrondsignaal te meten.
Als u alternatieve gegevensanalyses van vastgelegde afbeeldingen wilt uitvoeren, maakt u een macroopdracht via de Fiji-release van ImageJ voor geautomatiseerde selectie, achtergrondcorrectie en grijswaardeanalyse van een bepaalde afbeelding. Open het beeld TIFF-indeling voor analyse in Fiji. Open vervolgens de RBC-fluorescentie.
ijm macro, en klik op Uitvoeren. Het signaal van antilichamen gericht tegen RBC stikstofmonoxidesynthase, of NOS, gefosforyleerd op het serine 1177-residu in rust en als reactie op blootstelling aan mechanische kracht, werd beoordeeld met behulp van zowel immunohistochemie als immunofluorescentie. Een drievoudige toename van het signaal van antilichamen gericht tegen RBC-NOS gefosforyleerd op het serine 1177-residu werd gedetecteerd als reactie op mechanische krachtblootstelling van RBC's in vergelijking met de respectieve niet-geschoren cellen bij beoordeling met de immunohistochemische of immunofluorescentiemethode.
De gebruiker moet ervoor zorgen dat het antilichaam alleen op het testgebied wordt aangebracht. Anders kan het monster niet worden geanalyseerd vanwege een ontbrekende controle. Gezien de beschikbaarheid van een grote verscheidenheid aan antilichamen, is het mogelijk om met deze methode veel verschillende eiwitten en signaleringsprocessen te targeten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het vastleggen van dynamische veranderingen in eiwitactivering in enucleeerde rode bloedcellen, waarbij uitdagingen worden aangepakt om deze veranderingen voor analyse te behouden. Het protocol maakt mechanistische onderzoeken mogelijk in mechanosignalering van rode bloedcellen door effectieve fixatie en detectie van tijdelijke eiwitmodificaties.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Mechanobiologie
- Signaalgeving van rode bloedcellen
- Eiwitmodificaties
Achtergrond
- Onderzoek naar eiwitactivering in rode bloedcellen is cruciaal voor het begrijpen van mechanosignalering.
- Tijdelijke eiwitmodificaties spelen een belangrijke rol in cellulaire reacties.
- Bestaande methoden hebben uitdagingen bij het behouden van dynamische veranderingen tijdens analyse.
- Deze studie introduceert een betrouwbaar protocol voor eiwitfixatie en detectie.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het fixeren van tijdelijke eiwitmodificaties in rode bloedcellen.
- Om reproduceerbare analyse van eiwitactivering in reactie op stimuli mogelijk te maken.
- Om onderzoek naar post-translationele modificaties en mechanosignalering te bevorderen.
Gebruikte methoden
- Verdunning van vol bloed in 4% paraformaldehyde voor fixatie.
- Centrifugatie om cellulaire componenten te scheiden.
- Kleurtechnieken voor specifieke eiwitdetectie.
- Toepassing van specifieke antilichamen voor analyse.
Belangrijkste resultaten
- De methode is eenvoudig toe te passen en levert geldige, reproduceerbare resultaten op.
- Effectief in het vastleggen van tijdelijke eiwitmodificaties in rode bloedcellen.
- Maakt onderzoek in het opkomende veld van mechanosignalering van rode bloedcellen mogelijk.
- Vertoont voordelen ten opzichte van bestaande technieken bij het behouden van dynamische veranderingen.
Conclusies
- Het gepresenteerde protocol verbetert aanzienlijk de studie van eiwitdynamica in rode bloedcellen.
- Het opent nieuwe wegen voor onderzoek in mechanobiologie en cellulaire signalering.
- Toekomstige studies kunnen deze methode gebruiken voor diepere inzichten in de functie van rode bloedcellen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Immunostaining-based detection of dynamic red blood cell (RBC) protein alterations enables mechanistic interrogation of transient protein modifications critical for mechanobiology and post-translational signaling research. This capability supports early-stage target validation and de-risking in discovery pipelines where acute protein activation states inform therapeutic hypotheses. The method's reproducibility and semi-quantitative outputs facilitate robust portfolio triage and cross-program comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables detection of acute protein activation states relevant to mechanotransduction and signaling pathways.
- Supports functional target validation by capturing transient post-translational modifications in RBCs.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific protein responses to experimental stimuli.
- Provides semi-quantitative data for hypothesis-driven portfolio advancement decisions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated RBC samples for downstream screening of protein activation or inhibition.
- Standardizes antibody-based detection workflows for reproducible and comparable results.
- Enables quantitative image-based readouts suitable for assay development and optimization.
- Supports scalability through protocol adaptability to different antibody targets and detection modalities.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by enabling detection of protein changes in response to physiological or pathological stimuli.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker identification in RBCs.
- Reduces translational risk by ensuring that observed protein modifications are robust and reproducible across conditions.
Pipeline & Workflow Integration
This immunostaining protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling early mechanistic studies, assay development, and translational biomarker exploration in RBC systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by detecting specific protein activation events.
- Screening: Delivers reproducible, semi-quantitative outputs for compound or condition evaluation.
- Analytics: Provides image-based gray value measurements and background correction for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by capturing disease- or treatment-relevant protein modifications.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to diverse antibody targets and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies by preserving transient protein states.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and detection for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions by providing robust, semi-quantitative data on protein activation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying biological mechanisms and reducing late-stage uncertainty.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody selection, sample preparation, and microscopy-based imaging.
- Needs access to light and fluorescence microscopy, as well as image analysis software such as ImageJ or Fiji.
- Demands rigorous control staining to account for non-specific antibody binding and background signals.
- Adaptable to various RBC protein targets and signaling pathways with appropriate antibody validation.
- Limited to semi-quantitative analysis; absolute quantification may require complementary methods.
