Evaluatie van cardiale contractiliteitsmodulatietherapie in 2D-van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Office of Science and Engineering Laboratories bij de FDA ontwikkelt regelgevende wetenschappelijke hulpmiddelen om ontwikkelaars van medische hulpmiddelen en FDA-reviewers te helpen. Ons uiteindelijke doel is om de toegang van patiënten tot innovatieve, veilige en effectieve medische hulpmiddelen te versnellen door middel van de best beschikbare wetenschap. In dit protocol passen we geavanceerde geïnduceerde pluripotente stamceltechnologie toe op de beoordeling van medische hulpmiddelen die worden gebruikt voor de behandeling van levensbedreigende hartaandoeningen.

Deze eenvoudige tool maakt reproduceerbare evaluatie van cardiale elektrofysiologische apparaten in de schotel mogelijk met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. Het kan ook worden gebruikt met patiëntspecifieke cellen afkomstig van donoren met verschillende hartaandoeningen. Om te beginnen, plaat de ontdooide menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten op 0,1% gelatine gecoate steriele zes-well platen ten minste twee dagen voorafgaand aan het zaaien van de cardiomyocyten op het flexibele hydrogel substraat.

Kweek de menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten in standaard cardiomyocytenmedium gedurende twee tot vier dagen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide om hen in staat te stellen te herstellen van de cryopreservatie. Ververs het gebruikte medium elke 48 uur met 100% cardiomyocytenmedium. Controleer de status van de menselijke iPSC-afgeleide cardiomyocyten vóór dissociatie door de gezondheid van de cellen te evalueren, waardoor de levensvatbaarheid en stabiele kloppen worden gewaarborgd.

Was de cardiomyocyten met vier milliliter DPBS per putje zonder calciumchloride of magnesiumchloride. Voeg een milliliter dissociatiereagens op kamertemperatuur toe aan elke put en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens 10 milliliter cardiomyocytenmedium toe aan een steriele conische buis van 15 milliliter.

Dissocieer de cardiomyocyten van de zesputplaten met een pipet van 1.000 microliter en voeg de celsuspensie toe aan de conische buis. Spoel de putjes af met één milliliter vers cardiomyocytenmedium om eventuele resterende cardiomyocyten te verzamelen en voeg ze toe aan de conische buis. Breng vervolgens het uiteindelijke volume van de conische buis op 15 milliliter met het medium.

Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten op 200 G en verwijder het supernatant tot de één milliliter. Resuspendeer de cellen in het cardiomyocytenmedium tot een eindvolume van vijf milliliter en tel de cardiomyocyten met een handmatige of geautomatiseerde celteller. Incubeer vervolgens de cardiomyocytencelsuspensie gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur terwijl de flexibele hydrogelsubstraten worden bereid.

Maak een pipet van 20 microliter klaar op één microliter, pipetpunten, een steriele 48-well glazen bodemplaat en een stopwatchtimer in de weefselkweekkap. Meng de extracellulaire matrix of het op ECM gebaseerde hydrogelsubstraat door zachtjes op de buis te tikken en deze onmiddellijk weer op ijs te plaatsen. Start de stopwatchtimer onmiddellijk voor het bekleden van het eerste hydrogelsubstraat en markeer dit als tijd nul.

Pipetteer een microliter van het hydrogelsubstraat ongeveer drie keer op en neer om de pipetpunt te koelen. Breng vervolgens ongeveer één microliter van het onverdunde hydrogelsubstraat horizontaal aan op de bodem van elke put in de 48-putplaat, waarbij de pipet in een hoek van 45 graden wordt gehouden. Plaats alle hydrogelsubstraten in dezelfde richting in elke put om het substraat te helpen identificeren bij het uitvoeren van de experimenten met een vergroting van 40x.

Plaats het deksel op de 48-putsplaat en laat de hydrogelsubstraten acht tot 10 minuten bij kamertemperatuur in de weefselkweekkap incuberen voordat u de cellen toevoegt. Na de incubatie zaait u de cardiomyocyten onmiddellijk druppelsgewijs rechtstreeks op de hydrogelsubstraten met ongeveer 30.000 levensvatbare cardiomyocyten per put in een laag gemiddeld volume van ongeveer 200 microliter cardiomyocytenmedium. Laat de cardiomyocyten na het sluiten van het deksel 10 tot 15 minuten ongestoord bij kamertemperatuur in de kap incuberen, zodat de cellen zich aan het hydrogelsubstraat kunnen hechten.

Voeg voorzichtig 100 microliter vers cardiomyocytenmedium toe aan elk putje. Plaats de gesloten dekselplaat op een incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende twee tot vier dagen. Zet de microscoop en de omgevingscontrolekamer aan om in evenwicht te komen tot 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.

Verwijder het cardiomyocytenmedium uit de 48-putplaat en spoel elke put voorzichtig tweemaal af met 600 microliter van de cardiale contractiliteitsmodulatie of CCM-testmedium. Voeg vervolgens 300 microliter CCM-testmedium per put toe en plaats de 48-putplaat op de microscoop in de omgevingscontrolekamer. Plaats de elektroden en breng de cellen gedurende vijf minuten in evenwicht.

Als u de contractievideo's wilt opnemen met behulp van videogebaseerde microscopie, opent u de video-opnamesoftware en stelt u een framesnelheid van 100 frames per seconde in. Selecteer vervolgens een interessegebied of ROI in de buurt van het midden van de hiPSC-CM monolayer. Vervolgens stimuleert het veld de cellen met een commerciële pulsgenerator om de 2D-cardiomyocyten monolagen elektrisch te versnellen.

Plaats de cardiomyocyt op 1,5 maal de drempel op één hertz met baseline pulsparameters. Monofasische blokgolfpacingpulsen met een stimuluspulsduur van twee milliseconden van vijf volt. Neem de baseline pacing alleen contractie video op vóór de CCM voor een minimum van vijf slagen.

Stimuleer vervolgens de cardiomyocyten monolaag met een experimenteel elektrisch signaal van 30 milliseconden vertraging, twee symmetrische bifasische pulsen van 5,14 milliseconden faseduur, met 20,56 milliseconden totale duur, 10 volt faseamplitude en nul interfase-interval. Neem de CCM-geïnduceerde contractievideo op voor minimaal vijf slagen. Schakel het CCM-signaal uit, stimuleer met een baseline pacing-puls en neem een contractievideo op van de herstelperiode na de CCM voor minimaal vijf slagen.

Gebruik een standaard contractiesoftware om de contractievideo's automatisch te analyseren en de belangrijkste contractiele eigenschappen te kwantificeren, zoals contractieamplitude, contractiehelling, ontspanningshelling, tijd tot piek, tijd tot baseline 90% en contractieduur 50%De 2D menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten monolayer contractuele eigenschappen werden gekarakteriseerd en de belangrijkste parameters van cardiomyocytencontractiliteit werden gekwantificeerd. De toepassing van de standaard CCM-stimulatieparameters resulteerde in verbeterde contractiele eigenschappen in vitro. De effecten van extracellulaire calciumconcentratiemodulatie op menselijke contractiele eigenschappen met en zonder CCM-stimulatie werden geëvalueerd.

De verwachte baseline calciumafhankelijkheid van contractie werd waargenomen, evenals een CCM-geïnduceerde toename van de calciumgevoeligheid op het niveau van de cardiomyocytenmonolaag. Bovendien onthulde de farmacologische ondervraging van de bèta-androgene signaleringsroute dat de CCM-geïnduceerde inotrope effecten gedeeltelijk werden gemedieerd door bèta-adrenerge signalering. Bovendien kan deze tool worden uitgebreid naar patiëntspecifieke ziektecardiomyocyten, inclusief die van gedilateerde cardiomyopathie om het effect van CCM in de context van ziektetoestanden te begrijpen.

Hier richten we ons voornamelijk op het evalueren van menselijke contractiele eigenschappen. Met behulp van deze tool kan men echter ook andere uitlezingen van cardiale excitatiecontractiekoppelingen evalueren, inclusief actiepotentialen en calciumbehandeling. Dit is het eerste regelgevende wetenschappelijke instrument dat geïnduceerde pluripotente stamcellen door technologie combineert met de beoordeling van hartapparaten.

Deze alternatieve methode maakt de weg vrij voor medische hulpmiddelen om in een schaal te worden beoordeeld en heeft het potentieel om de noodzaak van dier- en menselijke proefpersonen te verminderen.