Name: Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer een eenvoudige 3D-kweekmethode voor zebravissferoïden met ZEM2S- en ZFL-cellijnen. Deze techniek versnelt vis-toxiciteitstesten en ondersteunt milieuvriendelijke ecotoxiciteitsstudies zonder dieren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) dankbaar voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticário.

De belangrijkste stappen voor het genereren van 3D-sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellijnen in een ronde bodem met 96-putplaat worden weergegeven in figuur 1.
OPMERKING: Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen die in dit protocol worden gebruikt en Tabel 1 voor oplossingen en kweekmedia die in dit protocol worden gebruikt.
1. Celkweekmedium en monolaagculturen
<ol><li>Kweek beide cellijnen (ZFL, ZEM2S) als monolagen in een incubator bij 28 °C zonder CO2, en subcultuur ze in een subcultivatieverhouding van 1:3 wanneer ze ~80% samenvloeiing bereiken.<ol><li>Begin met een T75-kolf van zebraviscellen bij ~ 80% samenvloeiing, gekweekt zoals hierboven beschreven.</li>
		<li>Verwijder het volledige medium en was de cellen door 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,01 M) toe te voegen aan de kweekkolf met behulp van een pipet.</li>
		<li>Voeg met behulp van een pipet 3 ml 1x trypsine-0,5 mM EDTA (0,05% [v/v]) toe aan de kweekkolven en incubeer gedurende 3 minuten bij 28 °C voor het losmaken van cellen uit de kolf.</li>
		<li>Tik zachtjes op de kolf om de cellen vrij te maken en stop vervolgens de trypsinevertering door 3 ml volledig kweekmedium aan de kolf toe te voegen.</li>
		<li>Breng met behulp van een pipet de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 100 × g .</li>
		<li>Verwijder na de pelletvorming voorzichtig het supernatant, voeg 1 ml van het volledige medium toe voor de respectieve cellijn in gebruik (ZFL of ZEM2S) en resuspensie met behulp van een micropipette. Neem een aliquot voor celtelling.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Celtelling met trypan blauwe kleurstofuitsluitingstest
<ol><li>Voeg 10 μL van de celsuspensie en 10 μL trypanblauwe kleurstof toe aan een microbuis om de cellen te tellen en hun levensvatbaarheid te evalueren. Meng de celsuspensie en verf met behulp van een pipet.</li>
	<li>Breng vervolgens 10 μL van dit mengsel (celsuspensie + trypanblauw) over naar een Neubauer-kamer en tel de cellen in de vier grote vierkanten (kwadranten: Q) die op de hoeken van de kamer zijn geplaatst, waarbij cellen die trypanblauw niet opnemen als levensvatbaar worden beschouwd. Bereken het aantal levensvatbare cellen met behulp van vergelijking (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	<li>Om het uiteindelijke celnummer in de celsuspensie te berekenen, vermenigvuldigt u het celnummer dat is bepaald met behulp van vergelijking (1) met 2 (de verdunningsfactor als gevolg van het gebruik van trypanblauw). OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd celtelsysteem worden gebruikt.</li>
</ol>3. Celplating in ULA-platen
<ol><li>Na het berekenen van het celnummer, stel de celsuspensie in op plaat 200 μL van deze suspensie per put van een 96-well round-bottom ULA-plaat met het aantal cellen dat nodig is voor elke cellijn, zoals hieronder aangegeven:<ol><li>Plaat 7.000 levensvatbare ZFL-cellen / put; gebruik dus voor de gehele ULA-plaat 700.000 cellen in 20 ml compleet medium.</li>
		<li>Plaat 3.500 levensvatbare ZEM2S-cellen / put; gebruik dus voor de gehele ULA-plaat 350.000 cellen in 20 ml compleet medium.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de celsuspensie voor met de aangepaste concentratie van cellen in een mediumreservoir en meng het met behulp van een meerkanaals micropipette, waarbij u ervoor zorgt dat er geen schuim of bubbels worden gevormd. Voeg met behulp van de meerkanaals micropipet 200 μL van de aangepaste celsuspensie toe aan elk putje van de ULA-plaat. OPMERKING: De plaat moet worden afgedicht met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van het kweekmedium van de 96-putplaat te voorkomen.</li>
</ol>4. Sferoïde vorming
<ol><li>Incubeer de ULA-plaat op een orbitale shaker bij 70 rpm gedurende 5 dagen in een incubator van 28 °C. Laat de sferoïden zich vormen gedurende 5 dagen orbitaal schudden (figuur 2), met een gemiddelde diameter van ~225 μm (ZFL-sferoïden) en ~226 μm in diameter (ZEM2S-sferoïden)12. OPMERKING: Na 5 dagen incubatie (maximale circulariteit) zijn de sferoïden klaar voor gebruik.</li>
	<li>Om de sferoïden langer dan 5 dagen in cultuur te houden, verwijdert u elke 5 dagen 100 μL van het gebruikte medium en voegt u 100 μL vers compleet kweekmedium toe met behulp van een meerkanaals micropipette. OPMERKING: Zorg ervoor dat u de sferoïden tijdens dit proces niet opzuigt.</li>
</ol>5. Het meten van grootte (diameter) en vorm (circulariteitsindex) van sferoïden
<ol><li>Verkrijg de afbeeldingen.<ol><li>Verkrijg onder een microscoop voor omgekeerd licht met een beeldopnamesysteem een beeld van een gedefinieerde schaal. OPMERKING: Gebruik een microscoopfasekalibratieplaat of een Neubauer-dia (waarin de kwadrantmaten bekend zijn) om de schaal te verkrijgen.</li>
		<li>Onder de microscoop en met behulp van dezelfde objectieve lens die wordt gebruikt om het beeld van de schaal te verkrijgen, verkrijgt u beelden van de volledig gevormde sferoïden (d.w.z. 5 dagen oude sferoïden). OPMERKING: Alle foto's moeten worden gemaakt met hetzelfde beeldopnamesysteem, omdat de beeldresolutie belangrijk is om de grootte en vorm van de sferoïden te bepalen en dit kan verschillen tussen soorten systemen.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de schaal in.<ol><li>Open met de ImageJ-software de afbeelding van de gedefinieerde schaal (klik op Bestand | openen).</li>
		<li>Selecteer de rechtlijnige kiezer op de werkbalk en sleep met de muis een lijn uit over de extensie van de gedefinieerde schaal in de afbeelding.</li>
		<li>Stel de schaal in door Analyseren | Stel schaal in en wacht tot het venster Schaal instellen wordt geopend.</li>
		<li>Vul in het venster Schaal instellen de lege ruimte van Bekende afstand in met de bekende afstand (μm) die overeenkomt met de rechte lijn; vul de eenheid van lengte met um voor μm. Klik op OK. OPMERKING: De schaal in pixels/μm wordt onder aan het venster weergegeven.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel de meetparameters in.<ol><li>Selecteer in de ImageJ-software de optie Analyseren | Stel metingen in om het venster Metingen instellen te openen.</li>
		<li>Schakel in het venster Metingen instellen de vakjes in voor de gewenste metingen (d.w.z. gebieds- en vormdescriptoren). Klik op OK.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg de diameter en circulariteit van de sferoïden.<ol><li>Open de afbeelding van een sferoïde (Bestand | Open).</li>
		<li>Selecteer het selectiegereedschap uit de vrije hand op de werkbalk en selecteer met de muis de buitenzijde van de sferoïde, zoals weergegeven in figuur 3A. OPMERKING: Als u wilt in- of uitzoomen op de afbeelding, drukt u op de Ctrl-toets en gebruikt u de muis om omlaag of omhoog te scrollen, of drukt u op de Ctrl-toets en gebruikt u de pijltoetsen omhoog of omlaag op het toetsenbord.</li>
		<li>Selecteer Analyseren | Meten om het venster Resultaten te openen, waarin de gemeten waarden worden weergegeven.</li>
		<li>Bereken met behulp van de oppervlaktewaarde de grootte (diameter) van de sferoïden met behulp van vergelijking (2): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq02.jpg" style="margin: auto;">(2)</li>
		<li>De circulariteitsindex wordt in het venster Resultaten gegeven als "Circ.", en wordt automatisch berekend door de software met behulp van vergelijking (3): <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/64859/64859eq03.jpg" style="margin: auto;">(3) OPMERKING: De circulariteitsindex van 1,0 vertegenwoordigt een perfecte bolvorm, terwijl een waarde in de buurt van 0,0 een langwerpige vorm13 aangeeft.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research.+Genetic+Toxicology+and+Environmental+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research. Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033(2019).</li>
<li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnology and Bioengineering. 83 (2), 173-180 (2003).</li>
<li>Baron, M. G., Purcell, W. M., Jackson, S. K., Owen, S. F., Jha, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+more+representative+in+vitro+method+for+fish+ecotoxicology%3A+morphological+and+biochemical+characterisation+of+three-dimensional+spheroidal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Towards a more representative in vitro method for fish ecotoxicology: morphological and biochemical characterisation of three-dimensional spheroidal hepatocytes.</a> Ecotoxicology. 21 (8), 2419-2429 (2012).</li>
<li>Alves, R. F., Rocha, E., Madureira, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+hepatocyte+spheroids+-+A+powerful+%28though+underexplored%29+alternative+in+vitro+model+to+study+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology.+Toxicology+%26+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fish hepatocyte spheroids - A powerful (though underexplored) alternative in vitro model to study hepatotoxicity.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Toxicology & Pharmacology. 262, 109470(2022).</li>
<li>Baron, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmaceutical+metabolism+in+fish%3A+using+a+3-D+hepatic+in+vitro+model+to+assess+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Pharmaceutical metabolism in fish: using a 3-D hepatic in vitro model to assess clearance.</a> PloS One. 12 (1), 0168837(2017).</li>
<li>Langan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+size+does+not+impact+metabolism+of+the+%CE%B2-blocker+propranolol+in+3D+intestinal+fish+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Spheroid size does not impact metabolism of the β-blocker propranolol in 3D intestinal fish model.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 947(2018).</li>
<li>Lammel, T., Tsoukatou, G., Jellinek, J., Sturve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+three-dimensional+%283D%29+spheroid+cultures+of+the+continuous+rainbow+trout+liver+cell+line+RTL-W1%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Development of three-dimensional (3D) spheroid cultures of the continuous rainbow trout liver cell line RTL-W1.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 167, 250-258 (2019).</li>
<li>Jeong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+CBZ-induced+catalysis+and+cytochrome+gene+expression+in+three+dimensional+zebrafish+liver+cellculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Environmental+and+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Differential effects of CBZ-induced catalysis and cytochrome gene expression in three dimensional zebrafish liver cellculture.</a> Journal of Environmental and Analytical Toxicology. 6, 2161(2016).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e2720(2011).</li>
<li>Lee, W. G., Ortmann, D., Hancock, M. J., Bae, H., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hollow+sphere+soft+lithography+approach+for+long-term+hanging+drop+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">A hollow sphere soft lithography approach for long-term hanging drop methods.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (2), 249-259 (2010).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods in Molecular Medicine. 140, 141-151 (2007).</li>
<li>de Souza, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+3D+cultures+of+zebrafish+liver+and+embryo+cell+lines%3A+a+comparison+of+different+spheroid+formation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Development of 3D cultures of zebrafish liver and embryo cell lines: a comparison of different spheroid formation methods.</a> Ecotoxicology. 30 (9), 1893-1909 (2021).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+user+guide%5BTitle%5D)+AND+%22ImageJ%2FFiji%22%5BJournal%5D)">ImageJ user guide.</a> ImageJ/Fiji. 1, 151-161 (2012).</li>
<li>Guidony, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABC+proteins+activity+and+cytotoxicity+in+zebrafish+hepatocytes+exposed+to+triclosan%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan.</a> Environmental Pollution. 271, 116368(2021).</li>
<li>da Silva, N. D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+of+goethite+in+the+effects+of+glyphosate+and+Roundup%C2%AE+on+ZFL+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line.</a> Toxicology In Vitro. 65, 104755(2020).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+is+a+key+factor+influencing+the+invasion+and+proliferation+of+Toxoplasma+gondii+in+fish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells.</a> Experimental Parasitology. 217, 107966(2020).</li>
<li>Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+induced+by+glyphosate+and+glyphosate-based+herbicides+in+the+zebrafish+hepatocyte+cell+line+%28ZF-L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L).</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).</li>
<li>Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+water+soluble+fraction+of+gasoline+on+ZFL+cell+line%3A+Cytotoxicity%2C+genotoxicity+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress.</a> Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).</li>
<li>Morozesk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+multiwalled+carbon+nanotubes+co-exposure+with+cadmium+on+zebrafish+cell+line%3A+Metal+uptake+and+accumulation%2C+oxidative+stress%2C+genotoxicity+and+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle.</a> Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892(2020).</li>
<li>Dognani, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofibrous+membranes+for+low-concentration+Cr+VI+adsorption%3A+kinetic%2C+thermodynamic+and+the+influence+on+ZFL+cells+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability.</a> Materials Research. , 24(2021).</li>
<li>ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/crl-2147">https://www.atcc.org/products/crl-2147</a> (2022).</li>
<li>Bell, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+primary+human+hepatocyte+spheroids+as+a+model+system+for+drug-induced+liver+injury%2C+liver+function+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function and disease.</a> Scientific Reports. 6, 25187(2016).</li>
<li>Gajski, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxic+potential+of+selected+cytostatic+drugs+in+human+and+zebrafish+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research+International%22%5BJournal%5D)">Genotoxic potential of selected cytostatic drugs in human and zebrafish cells.</a> Environmental Science and Pollution Research International. 23 (15), 14739-14750 (2016).</li>
<li>Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+octocrylene+on+zebrafish+larvae+and+liver+cell+line+%28ZFL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL).</a> Aquatic Toxicology. 236, 105843(2021).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+determination+of+oxygen+consumption+rates+and+diffusion+coefficients+in+multicellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Method for the determination of oxygen consumption rates and diffusion coefficients in multicellular spheroids.</a> Biophysical Journal. 46 (3), 343-348 (1984).</li>
<li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability%2C+spheroid+size%2C+and+hepatocellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 672-680 (2004).</li>
<li>Ho, R. K., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+of+cell+fate+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Commitment of cell fate in the early zebrafish embryo.</a> Science. 261 (5117), 109-111 (1993).</li>
<li>Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocadherin-19+and+N-cadherin+interact+to+control+cell+movements+during+anterior+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocadherin-19 and N-cadherin interact to control cell movements during anterior neurulation.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 1029-1041 (2010).</li>
<li>Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cultures+from+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+transcriptome+characterization+of+model+zebrafish+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines.</a> Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dit is een eenvoudige, gemakkelijke en snelle methode voor het genereren van sferoïden van zebravislever en embryonale cellijnen. Deze methode is ontwikkeld door deze groep op basis van modificaties van bestaande 3D-sferoïdemethoden om problemen te overwinnen die zijn gemeld in wetenschappelijke studies met betrekking tot sferoïdevorming, evenals onzekerheden in de nauwkeurigheid van gegevens van 3D-sferoïde-assays. De gemelde problemen liggen bijvoorbeeld in moeilijkheden bij de hantering, de tijdrovende aard van het ge...

Sferoïden zijn kleine bolletjes cellen die worden gevormd wanneer cellen worden gekweekt in nauw cel-tot-celcontact in 3D-cultuur. Het vermogen van sferoïden om de in vivo weefselomgeving na te bootsen is al bestudeerd in een verscheidenheid aan cellijnen en primaire cellen 1,2. Hoewel sferoïden goed ontwikkeld zijn voor toxiciteitsstudies bij zoogdieren, is de ontwikkeling van sferoïden voor toxiciteitsstudies met gewervelde dieren van niet-zoogdieren (bijv. vissen) nog steeds aan de gang3. Voor viscellijnen zijn sferoïden ontwikkeld met behulp van verschillende methoden, zoals orbitaal schudden (OS) met behulp van verschillende soorten putplaten 3,4,5,6,7, en de methode van magnetische levitatie met behulp van magnetische nanodeeltjes8. Sommige van deze kweekmethoden voor sferoïden kunnen echter meer nadelen hebben dan andere.
Tolmethoden in grote microplaten (24-putplaten) kunnen bijvoorbeeld een groot aantal sferoïden genereren die verschillen in grootte en vorm; Inderdaad, multi-sferoïde structuurvorming is aangetoond7. Dit vereist intense inspanningen om sferoïden met een vergelijkbare grootte en vorm met de hand te selecteren voor een experiment. De hanging drop 3D-cultuurmethode wordt vaak gebruikt voor het genereren van sferoïden van zoogdiercellijnen 1,2,9,10,11, waarbij enkele sferoïden per druppel kunnen worden gegenereerd, waardoor de hierboven beschreven problemen worden vermeden. Hoewel een aangepaste hangende druppelmethode (hangende druppel + orbitaal schudden) in staat is om ZFL-sferoïden te genereren met behulp van een goedkope methode, heeft het zijn nadelen12. De gevormde cellulaire aggregaten kunnen niet gedurende lange perioden in de druppels worden bewaard; ze moeten dus worden overgebracht naar putplaten. Dit proces vereist intensieve hantering en lange perioden van werk in een laminaire stromingskap, omdat het druppelsgewijs wordt uitgevoerd met behulp van een micropipette12. Bovendien vereist deze methode 10 dagen om de ZFL-sferoïden volledig te vormen (5 dagen in hangende druppel + 5 dagen in OS)12. Deze nadelen kunnen de toepassing van 3D-vissferoïden voor toxiciteitstests beperken, vooral gezien mogelijke toepassingen voor chemische prioritering en productduurzaamheid.
Zo beschrijft dit artikel een 3D-kweekprotocol dat in staat is om enkele sferoïden van ZFL (D. rerio normale hepatocyt) en ZEM2S (D. rerio blastula fase embryo) cellijnen te genereren op basis van het gecombineerde gebruik van 96-well, ultra-lage bevestigingsplaten (ULA-platen) en een orbitale shaker (22 mm rotatiediameter). De toegepaste methode is eenvoudig en reproduceerbaar en kan in een korte periode (5 dagen) grote aantallen sferoïden van vergelijkbare grootte en vorm genereren. De voordelen van deze methode kunnen de toepassing van 3D-modellen voor aquatische toxiciteitsstudies in zowel de industrie als de academische wereld ondersteunen, evenals de voortgang van de implementatie van alternatieve methoden voor ecotoxiciteitstests.

<table><tbody><tr><td>96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate, Individually Wrapped, with Lid, Sterile</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, poeder, hoge glucose, pyruvaat</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 voedingsmix, poeder</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Afbeeldingsverwerking en -analyse in Java (ImageJ) 1.52p software</td><td>&nbsp;National Institutes of Health, VS</td><td></td><td>Beschikbaar op: https://imagej.nih.gov/ij/index.html</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, poeder</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shaker&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm rotatiediameter</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10x) met calcium en magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Fetale boviene serum, gekwalificeerd, USDA-goedgekeurde regio's</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat, poeder,&nbsp; bioreagens voor moleculaire biologie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblauw kleurstof (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenolrood</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S-cellijn</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Deze cellijn is vriendelijk gedoneerd door Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, VS)</td></tr><tr><td>ZFL-cellijn</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

een 3d-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

A 3D Culture Method of Spheroids of Embryonic and Liver Zebrafish Cell Lines

Viscellijnen zijn veelbelovende in vitro modellen voor ecotoxiciteitsbeoordeling; conventionele monolaagcultuursystemen (2D-cultuur) hebben echter bekende beperkingen (bijv. Levensduur van de cultuur en behoud van sommige in vivo cellulaire functies). Zo zijn 3D-culturen, zoals sferoïden, voorgesteld, omdat deze modellen weefselachtige structuren kunnen reproduceren, waardoor de in vivo omstandigheden beter worden heroverd. Dit artikel beschrijft een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden met twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt). Het protocol bestaat uit het plateren van de cellen in een ronde bodem, ultra-lage aanhechting, 96-well plaat. Na 5 dagen onder orbitaal schudden (70 rpm) wordt een enkele sferoïde per put gevormd. De gevormde sferoïden hebben een stabiele grootte en vorm, en deze methode voorkomt de vorming van meerdere sferoïden in een put; Het is dus niet nodig om sferoïden van vergelijkbare grootte met de hand te selecteren. Het gemak, de snelheid en de reproduceerbaarheid van deze sferoïde methode maken het nuttig voor high-throughput in vitro tests.

Enkele sferoïden per put met een stabiele grootte en vorm worden door deze methode gevormd. Figuur 2 illustreert het vormingsproces van enkele sferoïden van ZFL- en ZEM2S-cellen in een put van een ULA-plaat onder orbitaal schudden (70 rpm). De ZFL- en ZEM2S-cellijnen hebben verschillende gedragingen in 3D-cultuur. De ZEM2S-cellijn vertoont kenmerken die het vermogen verlenen om gemakkelijk een bolvorm te vormen sinds de eerste dag van het orbitale schudden (figuur 2E</st...

Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

Fish cell lines are promising in vitro models for ecotoxicity assessment; however, conventional monolayer culture systems (2D culture) have well-known ...

Dit protocol kan gemakkelijk zebravissferoïden genereren, een 3D in vitro model met verschillende potentiële toepassingen in vistoxiciteitstests. Dit is een eenvoudige en snelle methode om enkele sferoïden van zebraviscellijnen te genereren die qua grootte en vorm erg op elkaar lijken. Als u alle beschreven stappen correct volgt, zou men geen problemen moeten ondervinden.Zebravissferoïden kunnen het mechanisme enorm ten goede komen, exploratie van de effecten van chemicaliën op vissen, wat helpt om de milieuveiligheidsbeoordeling van producten zoals cosmetica te verbeteren. Irisdoris Rodrigues de Souza, een arts in de genetica van mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Neem om te beginnen een T75-kolf met zebraviscellen bij ongeveer 80% samenvloeiing.Verwijder het volledige medium en was de cellen door 0,01 molaire PBS met een pipet aan de kweekkolf toe te voegen. Was de kweekkolf met PBS door de kolf voorzichtig te schudden en verwijder vervolgens de PBS. Voeg drie milliliter trypsine 0,5 millimolaire EDTA toe aan de kweekkolf en incubeer gedurende drie minuten bij 28 graden Celsius.Voor het losmaken van cellen van de kolf tikt u zachtjes op de kolf om de cellen los te laten. En stop dan de trypsinevertering door drie milliliter compleet kweekmedium aan de kolf toe te voegen. Breng met behulp van een pipet de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten op 100 G.Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant. Voeg een milliliter van het volledige medium toe voor de betreffende cellijn in gebruik en resuspensie van de pellet met behulp van een micropipet. Voeg 10 microliter van de celsuspensie en 10 microliter Trypan-blauwe kleurstof toe aan een microbuis om de cellen te tellen en hun levensvatbaarheid te evalueren.Meng de celsuspensie en kleurstof met behulp van een pipet en breng 10 microliter van dit mengsel over naar een Neubauer-kamer. Tel de cellen in de vier grote vierkanten of kwadranten die op de hoeken van de kamer zijn geplaatst, waarbij cellen die Trypan-blauw niet opnemen als levensvatbaar worden beschouwd. Bereken vervolgens het aantal levensvatbare cellen met behulp van de vergelijking die op het scherm wordt weergegeven.Vermenigvuldig dit celnummer met twee om het uiteindelijke celnummer in de celsuspensie te berekenen. Na het berekenen van het celnummer, past u de celsuspensie aan op plaat 200 microliter van deze suspensie per put van een 96-well ronde bodem ULA-plaat met het aantal cellen dat nodig is voor elke cellijn. Bereid de suspensie voor met de aangepaste concentratie van cellen in een mediumreservoir en meng het met behulp van een meerkanaals micropipet zonder schuim of bubbels te vormen.Voeg 200 microliter van de aangepaste celsuspensie toe aan elk putje van de ronde bodem ULA-plaat. met behulp van een meerkanaals pipet. De plaat moet worden afgedicht met Parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van het kweekmedium van de 96-putplaat te voorkomen.Incubeer de plaat op een orbitale shaker bij 70 RPM gedurende vijf dagen in een incubator van 28 graden Celsius zonder koolstofdioxide. Observeer na vijf dagen de sferoïden onder een microscoop met omgekeerd licht om de gegenereerde sferoïden te evalueren. Om hun vorm en grootte te meten, foto's van de sferoïden te verkrijgen en software te gebruiken om de afbeeldingen te verwerken en te analyseren.Nadat u de software hebt ingesteld om een geselecteerd gebied te meten op basis van een bekende schaal, selecteert u de buitenzijde van de sferoïde om het gebied en de circulariteit ervan te bepalen. Het gebied van de sferoïde wordt gebruikt om de grootte ervan te bepalen door de diameter d te berekenen en de software biedt de circulariteit van de sferoïde door een formule die het geselecteerde gebied en de geselecteerde omtrek gebruikt. Een ZFL-celaggregaat wordt gevormd op de eerste dag van orbitaal schudden.Het celaggregaat verhoogt zijn circulariteit op de derde dag en bereikt een adequate sferoïdale vorm op dag vijf. Een 16 dagen oude ZFL-sferoïde in ULA-plaat wordt hier getoond. De ZEM2S-cellijn vormt sferoïden vanaf de eerste dag van orbitaal schudden.De sferoïde behoudt zijn vorm en neemt in omvang toe op de derde dag, en zijn maximale circulariteit wordt bereikt op dag vijf. Een 10 dagen oude ZEM2S sferoïde in een ULA-plaat is hier te zien. De gemeten grootte van sferoïden van de ZFL- en ZEM2S-cellijnen en de gemeten circulariteitsindex van ZFL- en ZEM2S-sferoïden zijn in deze figuur weergegeven.Deze grafische afbeelding geeft het groeipatroon weer van ZFL- en ZEM2S-sferoïden. Een ZFL-sferoïde en ZEM2S-sferoïde gevormd na vijf dagen orbitaal schudden bij 100 RPM worden hier getoond. Het groeipatroon en de circulariteitsindex van de sferoïden gevormd bij rotatiesnelheden van 70 en 100 RPM zijn weergegeven in deze figuur.70 RPM is de meest geschikte snelheid om ZFL- en ZEM2S-sferoïden te vormen met deze methode. Kleuring van celmembranen door Lectine Alexa Fluor 594 en kernen door DAPI tonen de cellulaire integriteit in de kern van de sferoïden. Fluorescentie van resorufine gevormd door een reductie van AlamarBlue toont levensvatbare cellen in de kern van beide sferoïden.MTT-levensvatbaarheidstest in 3D-cultuur en 2D-cultuur van de ZEM2S- en ZFL-cellijn wordt hier getoond, wat geen significante verschillen aantoont. Wanneer u deze procedure probeert, zorg er dan voor dat u de platen afsluit om te voorkomen dat de pH van de kweekmedia en verdamping in de putten veranderen. De sferoïden kunnen worden toegepast in een verscheidenheid aan in vitro assays om toxische effecten in de vislever te evalueren of ontwikkelingsstudies met behulp van de embryo ZEM2S-cellijn.Dit protocol kan helpen de ontwikkeling van in-vitro vistests te bevorderen en zo bij te dragen aan de voortgang van op dieren gebaseerde ecotoxiciteitsstudies.

a-3d-culture-method-spheroids-embryonic-liver-zebrafish-cell

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

Beschrijven we een eenvoudige, snelle methode van het genereren van 3D weefsel-achtige sferoïden en hun potentiële toepassing op verschillen in de cel-cel interacties te kwantificeren.

A Simple Opknoping Drop Cultuur van de Cel Protocol voor het genereren van 3D-sferoïden

Spheroids are a type of 3D cell culture model used to more accurately represent a cell’s environment compared to 2D cell culture monolayer models. In the example protocol, we will see scientists generate spheroids from a colorectal cancer cell line and apply live-cell imaging to track the spheroids’ growth.

Spheroid Generation from Cell Lines: A Three-Dimensional (3D) Cell Culture Method

Somitogenesis is een ritmische ontwikkelingsproces dat ruimtelijk patronen het lichaam as van gewervelde embryo's. Eerder ontwikkelden we transgene zebravis lijnen die fluorescerende verslaggevers gebruiken om de cyclische genen die dit proces sturen observeren. Hier hebben we cultuur verspreid cellen van deze lijnen en het imago van hun oscillaties in de tijd in vitro.

Generatie Dispersed presomitische Mesoderm Cell Cultures for Imaging van de zebravis Segmentatie Klok in enkele cellen

Beeldvorming van cerebrovasculaire ontwikkeling in larvale zebravis wordt beschreven. Technieken om 3D-beeldvorming te vergemakkelijken en het gebruik van chemische behandelingen cerebrovasculaire ontwikkeling passen zijn ook aanwezig.

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Hier hebben wij een reproduceerbare werkwijze voor volwassenen neurogenese onderzocht onder toepassing van een assay neurosphere afgeleid van de gehele hersenen of van ofwel de telencephalic, tectal of cerebellaire gebieden van de volwassen hersenen zebravis. Daarnaast beschrijven we de procedure om genexpressie te manipuleren in zebravis neurosferen.

Isolatie en cultuur van de Adult zebravis Brain-afgeleide Neurosferen

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Presenteren we een efficiënt en gemakkelijk te gebruiken protocol voor het voorbereiden van primaire celculturen van zebravis embryo's voor transfectie en levende cel imaging, evenals een protocol bij het bereiden van primaire cellen van volwassen zebrafish hersenen.

Cultuur en de transfectie van zebravis primaire cellen

Hier presenteren we het protocol voor 3D-weefselkweek van de achterste lichaamsas van zebravissen, waardoor live studie van gewervelde segmentatie mogelijk is. Dit explantmodel biedt controle over de verlenging van de as, wijziging van morfogene bronnen en live beeldvorming op weefselniveau op subcellulair resolutieniveau.

Een 3D Tail Explant-cultuur om gewervelde segmentatie bij zebravissen te bestuderen

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

We presenteren een protocol voor het kweken van hoogreproduceerbare sferoïden en hun fenotypische karakterisering met behulp van beeldopname en proteomics.

Semi-geautomatiseerde fenotypische analyse van functionele 3D-sferoïde celculturen

Organoïden revolutioneren gepersonaliseerde weefselmodellering voor orgaanontwikkeling, medicijnontdekking en ziekteonderzoek. De voortgang in organoïdengineering leidt tot het creëren van ingewikkelde synthetische weefsels. Het doel is om morfogenese, assembloïdtechnologie en biomatrices te integreren om weefselengineering te bevorderen. Dit protocol helpt bij het modelleren van leverorganogenese en het vaststellen van richtlijnen voor de constructie van synthetisch weefsel.

In Vitro Cultuurtechnieken voor het Modelleren van Lever Organogenese, het Bouwen van Assembloids en het Ontwerpen van Synthetisch Weefsel met behulp van Menselijk Cellijnen

Leer een eenvoudige 3D-kweekmethode voor zebravissferoïden met ZEM2S- en ZFL-cellijnen. Deze techniek versnelt vis-toxiciteitstesten en ondersteunt milieuvriendelijke ecotoxiciteitsstudies zonder dieren.

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

Meer video's verkennen