Name: Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen ZEM2S en ZFL in 96-well plates voor ecotoxiciteitonderzoek. Dit protocol combineert meerdere viabiliteitseindpunten om acute toxiciteit van chemicaliën te beoordelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ter nagedachtenis aan Dr. Márcio Lorencini, een co-auteur van dit werk, een uitstekende onderzoeker op het gebied van cosmetica en toegewijd aan het bevorderen van cosmetisch onderzoek in Brazilië. De auteurs zijn dankbaar voor het Multi-user Laboratory in de afdeling Fysiologie (UFPR) voor de beschikbaarheid van apparatuur en voor de financiële steun van de Coördinatie voor de Verbetering van het Personeel van het Hoger Onderwijs (CAPES, Brazilië) (Finance Code 001) en de Grupo Boticario.

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor de lijst van materialen die in dit protocol worden gebruikt en tabel 1 voor de samenstelling van de in dit protocol gebruikte oplossingen en media.
1. ZFL- en ZEM2S-cellen voorbereiden
<ol><li>Begin met een T75-kolf van ZFL- of ZEM2S-cellen met 80% confluentie, gekweekt in het betreffende volledige medium bij 28 °C zonder CO2.</li>
	<li>Haal het kweekmedium uit de kolf en was de cellen door toevoeging van 10 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (0,01 M). Voeg 3 ml 1x trypsine (0,05% v/v; 0,5 mM trypsine-EDTA) toe aan de kweekkolven. Incubeer bij 28 °C gedurende 3 min.</li>
	<li>Tik zachtjes op de kolf om de cellen vrij te maken en stop vervolgens de trypsinevertering door 3 ml volledig kweekmedium aan de kolf toe te voegen.</li>
	<li>Breng de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 100 × g .</li>
	<li>Verwijder na het centrifugeren voorzichtig het supernatant, voeg 1 ml volledig medium toe voor ZFL- of ZEM2S-cellen en resuspensie van de pellet met behulp van een micropipette.</li>
</ol>2. Celtelling door trypan blauwe kleurstofuitsluiting
<ol><li>Voeg 10 μL van de celsuspensie en 10 μL trypanblauwe kleurstof toe aan een microbuis om de cellen te tellen en hun levensvatbaarheid te evalueren. Meng de celsuspensie en verf met behulp van een pipet.</li>
	<li>Breng vervolgens 10 μL van dit mengsel (celsuspensie + trypan blauw) over naar een Neubauer-kamer en tel de cellen in de vier grote vierkanten (kwadranten Q) die op de hoeken van de kamer zijn geplaatst, waarbij levensvatbare cellen worden beschouwd als cellen die geen trypanblauw opnemen. Bepaal het aantal levensvatbare cellen met behulp van vergelijking (1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64860/64860eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)</li>
	<li>Bereken het uiteindelijke celnummer in de celsuspensie door het celnummer bepaald met behulp van vergelijking (1) te vermenigvuldigen met twee (de verdunningsfactor als gevolg van het gebruik van trypanblauw). OPMERKING: Als alternatief kan een geautomatiseerd celtellingsysteem (bijv. een cytomeer met celtelling en levensvatbaarheidsfunctie) worden gebruikt.</li>
</ol>3. Celbeplating in 96-putplaten
<ol><li>Bereken het celsuspensievolume dat nodig is om het aantal cellen te verkrijgen dat nodig is om de cytotoxiciteitstests uit te voeren. Het aantal levensvatbare cellen voor elke cellijn wordt hieronder aangegeven:<ol><li>Plaat 60.000 levensvatbare ZEM2S-cellen per put; gebruik dus voor de hele plaat zes miljoen cellen in 20 ml volledig medium (200 μL/put, 96-well plaat).</li>
		<li>Plaat 40.000 levensvatbare ZFL-cellen per put; gebruik dus voor de hele plaat vier miljoen cellen in 20 ml volledig medium (200 μL/put, 96-well plaat).</li>
	</ol></li>
	<li>Breng daarna het respectieve volume van de celsuspensie over naar een reagensreservoir (steriel) en vul met het volledige kweekmedium voor ZFL of ZEM2S tot 20 ml. Meng de oplossing met behulp van een meerkanaalspipet voorzichtig op en neer. OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen schuim of bubbels vormt.</li>
	<li>Voeg 200 μL van de celsuspensie toe aan elke put van een transparante polystyreen 96-well plaat met behulp van de meerkanaals micropipette. Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 24 uur. OPMERKING: De plaat moet ten minste drie putjes zonder cellen hebben voor de blancocontrole en er mogen alleen volledige media aan deze putjes worden toegevoegd. Het randeffect (veroorzaakt door hogere verdamping in de randputten) komt vaak voor in 96-well plaattesten en kan de levensvatbaarheid van de cellen in de randputten van de plaat28 beïnvloeden. Dit effect kan hoger of lager zijn, afhankelijk van het merk en ontwerp28 van de 96-putplaat. Hoewel we geen verstoring van de celgroei / levensvatbaarheid voor ZFL en ZEM2S in de randputten hebben opgemerkt, raden we aan de plaat af te dichten met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om dit effect te voorkomen, of de cellen alleen in de 60 binnenputten te kweken en de randputten met PBS te vullen.</li>
</ol>4. Blootstelling van cellen aan teststof
<ol><li>Gooi de gebruikte media voorzichtig uit de putten weg met behulp van een meerkanaals micropipette.</li>
	<li>Stel de cellen bloot aan het testen van chemicaliën in verschillende concentraties. Bereid de oplossingen van de concentraties van de teststof in de kweekmedia voor ZFL of ZEM2S zonder foetaal runderserum (FBS) (blootstellingsmedia). Voeg vervolgens 100 μL per put van deze oplossingen toe in technisch drievoud (d.w.z. drie putten/concentratie van de teststof).</li>
	<li>Plaats voor controles de controlegroepen op dezelfde plaat als de teststof in technische drievouden (drie putjes/controlegroep). Voeg voor de blancocontrole (B) dus 100 μL van de blootstellingsmedia in de celvrije putten toe, voor de negatieve controle (NC), voeg 100 μL van de blootstellingsmedia toe aan putten met cellen en stel voor de positieve controle (PC) de cellen bloot aan een oplossing van 1% Triton X-100 bereid in de blootstellingsmedia. In sommige gevallen moet een oplosmiddelcontrole (SC) in de plaat worden opgenomen, rekening houdend met een duidelijk niet-cytotoxische concentratie als uiteindelijke oplosmiddelconcentratie. OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 0,5% DMSO als oplosmiddel te gebruiken; DMSO kan tot 1% als oplosmiddel in deze cellijnen worden gebruikt zonder de cytotoxiciteitsdrempel van 10% gerelateerd aan de negatieve controle te overschrijden.</li>
	<li>Incubeer de platen bij 28 °C gedurende 24 uur. Sluit de platen af met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van kweekmedium te voorkomen. OPMERKING: Bepaalde chemische stoffen kunnen intrinsieke achtergrondabsorptie of fluorescentie hebben die de absorptie of fluorescentie van de indicatorkleurstof(en) kunnen verstoren (verbindingen met kleur kunnen bijvoorbeeld de absorptie beïnvloeden, serumalbumine29 en verbindingen die interfereren met reductie-enzymen30,31). In dit geval moet de plaat een extra controle bevatten door teststofoplossingen toe te voegen in de putten zonder cellen. Dit is om de mogelijke interferentie van de chemische zelfabsorptie/autofluorescentie met de kleurstoffen te verifiëren. Als interferentie wordt gedetecteerd, moet men evalueren of het kan worden uitgesloten om een juiste voorspelling van cytotoxiciteit te verkrijgen.</li>
</ol>5. Cytotoxiciteitstests
OPMERKING: Bereid alle oplossingen volgens tabel 1. Alle hieronder beschreven stappen (figuur 1) worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Het gebruik van een pipet om de blootstellingsmedia weg te gooien wordt niet aanbevolen, omdat de cellen na chemische behandeling gemakkelijk van de putten kunnen loskomen.
<ol><li>AB en CFDA-AM assays<ol><li>Gooi na 24 uur blootstelling aan de teststof de blootstellingsmedia voorzichtig weg door de inhoud in een opvangbak te gieten.</li>
		<li>Was de plaat met 200 μL PBS. Verwijder de PBS voorzichtig door deze in een opvangbak te gieten om te voorkomen dat cellen verloren gaan.</li>
		<li>Voeg 100 μL per putje AB/CFDA-AM oplossing toe. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker bij 28 °C.</li>
		<li>Meet de fluorescentie in een fluorescentieplaatlezer bij 530 nm (excitatie) en 595 nm (emissie) voor AB, en bij 493 nm (excitatie) en 541 nm (emissie) voor CFDA-AM.</li>
	</ol></li>
	<li>NR-test OPMERKING: De stappen voor de NR-test worden onmiddellijk na de AB- en CFDA-AM-testen uitgevoerd (figuur 1).<ol><li>Centrifugeer de NR-werkoplossing (40 μg/ml) bij 600 × g gedurende 10 minuten. OPMERKING: Precipitatie van NR in de buis mag niet worden overgebracht op de platen. Dus, na centrifugatie van de NR-werkoplossing, verzamelt u het supernatant met behulp van een pipet zonder de NR-neerslag op te zuigen. Breng het supernatant over in een reagensreservoir.</li>
		<li>Verwijder de AB/CFDA-AM-oplossing voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten.</li>
		<li>Voeg 100 μL per put van de NR-werkoplossing toe met behulp van een meerkanaals micropipette. Incubeer de plaat bij 28 °C gedurende 3 uur. OPMERKING: Na de incubatie van 3 uur, observeer of NR-neerslag in de platen is opgetreden met behulp van een microscoop. NR-precipitaten kunnen de kwantificering van de levensvatbaarheid van de cel verstoren, dus ze mogen niet aanwezig zijn.</li>
		<li>Verwijder de NR-oplossing voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten. Was de putjes door 150 μL PBS per put toe te voegen.</li>
		<li>Voeg 150 μL per put van de NR-extractieoplossing toe en incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder om zachtjes te schudden. Meet de absorptie bij 540 nm in een plaatlezer. OPMERKING: Een tweede uitlezing bij 690 nm moet worden uitgevoerd om eventuele achtergrondabsorptie van vingerafdrukken in de plaat uit te sluiten.</li>
	</ol></li>
	<li>MTT-test OPMERKING: De MTT-bepaling moet afzonderlijk van de hierboven beschreven tests (in een nieuwe plaat) worden uitgevoerd (figuur 2).<ol><li>Verwijder de belichtingsmedia voorzichtig door de inhoud in een opvangbak te gieten.</li>
		<li>Voeg 100 μL MTT-werkoplossing per put toe met behulp van een meerkanaals micropipette. Incubeer de plaat bij 28 °C gedurende 4 uur.</li>
		<li>Gooi de MTT-oplossing weg door de inhoud in een opvangbak te gieten.</li>
		<li>Voeg 100 μL per put DMSO toe om de formazankristallen te extraheren en incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder. Meet de absorptie bij 570 nm met behulp van een plaatlezer. OPMERKING: Een tweede uitlezing bij 690 nm moet worden uitgevoerd om eventuele achtergrondabsorptie van vingerafdrukken in de plaat uit te sluiten. Het is belangrijk op te merken dat teststoffen kunnen interfereren met MTT, dat moet worden geëvalueerd om de kwaliteit van de gegenereerde gegevens te waarborgen32. Hiervoor moeten celvrije putten met de testconcentraties en MTT (0,5 mg / ml) worden blootgesteld, gevolgd door incubatie om elke kleurverandering in de putten te observeren die de absorptie kan verhogen en tot valse levensvatbaarheidsresultaten kan leiden. Chemische stoffen die interageren met MTT moeten in deze test worden vermeden.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Berekening van de levensvatbaarheid/cytotoxiciteit van cellen
OPMERKING: De verkregen ruwe absorptie of fluorescentie wordt gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te berekenen als een percentage dat verband houdt met de negatieve controle (voor teststoffen die rechtstreeks in blootstellingsmedia worden bereid) of de oplosmiddelcontrole (voor teststoffen bereid met oplosmiddelen, zoals DMSO). Voordat het levensvatbaarheidspercentage van de cel wordt bepaald, moeten de onbewerkte gegevens worden genormaliseerd door het lege besturingselement.
<ol><li>Bereken de gemiddelde absorptie of fluorescentie voor elke concentratie van de teststof en elke controlegroep (drie putjes/behandeling).</li>
	<li>Om het levensvatbaarheidspercentage van de cel ten opzichte van de controle (negatief of oplosmiddel) te bepalen, gebruikt u vergelijking (2): <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64860/64860eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2) OPMERKING: Absorptie (abs) of fluorescentie (fluo) eenheden vertegenwoordigen het gemiddelde van absorptie of fluorescentie gemeten in de drie putten per concentratie; Leeg staat voor putten zonder cellen.</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Cytotoxiciteitstests worden veel gebruikt voor in vitro toxiciteitsevaluatie en dit protocolartikel presenteert vier veelgebruikte cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om te worden uitgevoerd in zebraviscellijnen (d.w.z. celdichtheid voor 96-putplaat, incubatietijd in de MTT-test, FBS-depletie tijdens de chemische blootstellingsconditie en maximaal aanvaardbare concentratie voor de SC). Aangezien deze testen cytotoxiciteit kwantificeren door verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen (metabo...

Chemische stoffen moeten worden getest op hun veiligheid voor de menselijke gezondheid en het milieu. Moleculaire en cellulaire biomarkers worden in toenemende mate overwogen in veiligheidsbeoordelingen om effecten op levende organismen te voorspellen door regelgevende instanties en/of wetgevingen (bijv. REACH, OESO, US EPA)1,2, omdat ze kunnen voorafgaan aan de in vivo nadelige uitkomst (bijv. endocriene verstoring, immunologische respons, acute toxiciteit, fototoxiciteit)3,4,5,6,7 . In deze context is cytotoxiciteit als een meting genomen om de acute toxiciteit bij vissente voorspellen 5,8; Het kan echter vele andere toepassingen hebben in ecotoxiciteitsstudies, zoals het definiëren van subcytotoxische concentraties van chemische stoffen om hun meest uiteenlopende reeks effecten op vissen te bestuderen (bijv. Hormoonontregelende effecten).
In celkweeksystemen (in vitro systemen) kan de cytotoxiciteit van chemische stoffen worden bepaald door methoden die verschillen in de soorten eindpunten. Een cytotoxiciteitsmethode kan bijvoorbeeld worden gebaseerd op een eindpunt dat verband houdt met specifieke morfologie die wordt waargenomen tijdens het celdoodproces, terwijl een andere cytotoxiciteit kan bepalen door de meting van celdood, levensvatbaarheid en functionaliteit, morfologie, energiemetabolisme en celaanhechting en -proliferatie. Chemische stoffen kunnen de levensvatbaarheid van cellen beïnvloeden via verschillende mechanismen, dus cytotoxiciteitsbeoordeling met betrekking tot verschillende eindpunten van de levensvatbaarheid van cellen is noodzakelijk om chemische effectente voorspellen 9.
MTT en Alamar Blue (AB) zijn testen die effecten op de levensvatbaarheid van cellen bepalen op basis van celstofwisselingsactiviteit. De MTT-test evalueert de activiteit van het mitochondriale enzym succinaatdehydrogenase10. De reductie van geelachtig 3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) tot formazanblauw komt alleen voor in levensvatbare cellen en de optische dichtheid is recht evenredig met het aantal levensvatbare cellen10. De AB-test is een gevoelige oxidatie-reductie-indicator, gemedieerd door mitochondriale enzymen die fluoresceren en van kleur veranderen bij het reduceren van resazurine tot resorufine door levende cellen11; cytosolische en microsomale enzymen dragen echter ook bij aan de reductie van AB en MTT12. Deze enzymen kunnen verschillende reductasen omvatten, zoals alcohol en aldehydeoxidoreductasen, NAD (P) H: chinonoxidoreductase, flavinereductase, NADH-dehydrogenase en cytochromen11.
De Neutral Red (NR) assay is een cel levensvatbaarheidstest gebaseerd op de opname van deze kleurstof in de lysosomen van levensvatbare cellen13. De opname van NR hangt af van het vermogen van de cellen om pH-gradiënten te behouden. De protongradiënt in de lysosomen handhaaft een pH lager dan het cytoplasma. Bij normale fysiologische pH presenteert de NR een nettolading van ongeveer nul, waardoor het celmembranen kan binnendringen. De kleurstof wordt dus geladen en wordt vastgehouden in de lysosomen. Bijgevolg, hoe groter de hoeveelheid behouden NR, hoe groter het aantal levensvatbare cellen14. Chemische stoffen die het celoppervlak of de lysosomale membranen beschadigen, belemmeren de opname van deze kleurstof.
De CFDA-AM-test is een fluorometrische levensvatbaarheidstest voor cellen op basis van de retentie van 5-carboxyfluoresceïnediacetaat acetoxymethylester (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, een esterasesubstraat, wordt omgezet in carboxyfluoresceïne, een fluorescerende stof die polair en niet-permeabel is door membranen van levende cellen15; Het wordt dus vastgehouden in de binnenkant van een intact celmembraan, wat wijst op levensvatbare cellen.
Onlangs werden drie cytotoxiciteitstests (CFDA-AM, NR en AB-assays) gecombineerd in een gevalideerde ISO-richtlijn (International Organization for Standardization) (ISO 21115: 2019) 16 en OESO-testmethode (Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling) (OESO TG 249) om de acute toxiciteit van vissen te evalueren met behulp van de RTgill-W1-cellijn (permanente cellijn van regenboogforel [Oncorhynchus mykiss] kieuw) in 24-putplaten17 . Hoewel er een bestaande celgebaseerde methode is om de acute toxiciteit van vissen te voorspellen, zijn er inspanningen geleverd om vergelijkbare methoden met andere vissoorten te ontwikkelen en de doorvoer van de methode te vergroten. Enkele voorbeelden zijn de ontwikkeling van ZFL-cellijnen getransfecteerd met reportergenen voor specifieke toxiciteitsroutes18,19, fototoxiciteitstests in de RTgill-W1-cellijn 20 en het gebruik van ZFL- en ZF4-cellijnen (zebravisfibroblast afgeleid van embryo's van 1 dag oud) om toxiciteit te beoordelen door middel van verschillende cytotoxiciteitstests21.
Danio rerio (zebravis) is een van de belangrijkste vissoorten die worden gebruikt in aquatische toxiciteitsstudies; Celgebaseerde methoden met zebraviscellijnen voor het testen van vistoxiciteit kunnen dus uiterst nuttig zijn. De ZFL-cellijn is een zebravisepitheelhepatocytencellijn die de belangrijkste kenmerken van leverparenchymale cellen presenteert en xenobiotica kan metaboliseren 7,22,23,24,25. Ondertussen is de ZEM2S-cellijn een embryonale zebravis fibroblastische cellijn afgeleid van het blastulastadium die kan worden gebruikt om ontwikkelingseffecten op vissen te onderzoeken26,27. Dit protocol beschrijft dus vier cytotoxiciteitstests (MTT-, AB-, NR- en CFDA-AM-assays), met modificaties die moeten worden uitgevoerd met ZFL- en ZEM2S-cellijnen in 96-putplaten.

<table><tbody><tr><td>5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester)</td><td>Invitrogen</td><td>C1345</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plate, 96 well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td>Surface: Standard, flat base</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Poeder, hoge glucose, pyruvate</td></tr><tr><td>FBS - Fetal Bovine Serum, gekwalificeerd, USDA-goedgekeurde regio's</td><td>Gibco</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix, poeder</td><td>Gibco</td><td>21700026</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Gibco</td><td>41300021</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Neutral red&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4638</td><td>Poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>Orbital shaker&nbsp;</td><td>Warmnest</td><td>KLD-350-BI</td><td>22 mm rotatiediameter</td></tr><tr><td>Dulbeccos PBS (10X) met calcium en magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14080055</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin natriumzout&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7017</td><td>Poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>31800-014</td><td>Poeder</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Poeder,&nbsp; bioreagens voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide&nbsp; 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw kleurstof (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5%), geen fenolrood</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ZEM2S cellijn</td><td>ATCC</td><td>CRL-2147</td><td>Deze cellijn werd vriendelijk gedoneerd door Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA)</td></tr><tr><td>ZFL cellijn</td><td>BCRJ</td><td>256</td><td></td></tr></tbody></table>

cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Cytotoxicity Assays with Zebrafish Cell Lines

Viscellijnen worden steeds vaker gebruikt in ecotoxiciteitsstudies en cytotoxiciteitstests zijn voorgesteld als methoden om acute toxiciteit van vissen te voorspellen. Dit protocol presenteert dus cytotoxiciteitstests die zijn aangepast om de levensvatbaarheid van cellen te evalueren in zebravis (Danio rerio) embryo (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen. De geëvalueerde cytotoxiciteitseindpunten zijn mitochondriale integriteit (Alamar Blue [AB] en MTT-assays), membraanintegriteit via esterase-activiteit (CFDA-AM-assay) en lysosomale membraanintegriteit (Neutral Red [NR] assay). Na de blootstelling van de teststoffen in een plaat met 96 putten worden de cytotoxiciteitstests uitgevoerd; hier worden AB en CFDA-AM gelijktijdig uitgevoerd, gevolgd door NR op dezelfde plaat, terwijl de MTT-test op een afzonderlijke plaat wordt uitgevoerd. De uitlezingen voor deze testen worden genomen door fluorescentie voor AB en CFDA-AM, en absorptie voor MTT en NR. De cytotoxiciteitstests die met deze viscellijnen worden uitgevoerd, kunnen worden gebruikt om de acute toxiciteit van chemische stoffen op vissen te bestuderen.

Figuur 3 toont de platen van de AB-, CFDA-AM-, NR- en MTT-assays. Voor de AB-test (figuur 3A) vertonen de lege putten en putten met geen of een verminderd aantal levensvatbare cellen een blauwe kleur en een lage fluorescentie, terwijl de putten met een groot aantal levensvatbare cellen roze zijn en hoge fluorescentiewaarden vertonen als gevolg van de transformatie van resazurine (AB) in resorufine (roze substantie) door de levensvatbare cellen. Voor de CFDA-AM-t...

Dit protocol presenteert veelgebruikte cytotoxiciteitstests (Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red en MTT-assays) aangepast voor de beoordeling van cytotoxiciteit in zebravisembryo's (ZEM2S) en lever (ZFL) cellijnen in 96-well platen.

Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Fish cell lines have become increasingly used in ecotoxicity studies, and cytotoxicity assays have been proposed as methods to predict fish acute ...

Het cytotoxiciteitstestprotocol met behulp van zebraviscellijnen kan vragen beantwoorden over acute toxiciteit van chemicaliën op vissen of helpen bij het definiëren van de juiste testconcentraties voor andere alternatieve vistests. Het belangrijkste voordeel van deze 96-well plaattest is het combineren van verschillende levensvatbaarheidseindpunten om cytotoxiciteit voor zebraviscellen te bepalen, wat een belangrijke vissoort is in ecotoxiciteitsstudies. Het protocol is heel eenvoudig.Als u alle beschreven stappen correct volgt, zou men geen probleem moeten ondervinden. Dit protocol helpt om geen op dieren gebaseerde ecotoxiciteitsstudies te bereiken die effecten evalueren in viscellijnen afgeleid van verschillende organen of levensfase, zoals hepatocyten in embryonale cellen. Om te beginnen met het plateren van de ZEM2S- of ZFL-cellen, berekent u het volume van de respectieve celsuspensies die nodig zijn om het gewenste aantal cellen voor assays te verkrijgen.Vul een steriel reagensreservoir met het volledige kweekmedium voor de overeenkomstige cellijn en breng het berekende volume van de celsuspensie over naar het reservoir voor een totaal volume van 20 milliliter. Meng de oplossing voorzichtig met behulp van een meerkanaalspipet op en neer zonder schuim of bubbels te vormen. Voeg vervolgens met behulp van de meerkanaals micropipette 200 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een transparante polystyreen 96-putplaat om een levensvatbaar celgetal van 60.000 cellen per put voor de ZEM2S-cellen en 40.000 cellen per put voor de ZFL-cellen te verkrijgen.Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur. Om beide typen cellen bloot te stellen aan verschillende concentraties van de teststoffen, bereidt u de gewenste concentratie van teststofoplossingen in de kweekmedia voor de relevante cellijn voor zonder foetaal runderserum of FBS. Na de 24-uurs incubatie, gooi de gebruikte media voorzichtig weg uit de putten met behulp van een meerkanaals micropipette.Voeg vervolgens 100 microliter van een bepaalde teststofoplossing per put toe in technische drievouden, wat drie putten betekent voor elke concentratie van de teststof. Plaats de controlegroepen op dezelfde plaat als de teststoffen in technische drievouden. Voeg voor de blancocontrole 100 microliter van de blootstellingsmedia toe in drie celvrije putjes.Voeg voor de negatieve controle 100 microliter van de blootstellingsmedia toe aan drie putten die cellen bevatten. Stel voor de positieve controle drie putjes met cellen bloot aan een 1% Triton X-100-oplossing bereid in de blootstellingsmedia. Sluit de platen af met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van kweekmedium te voorkomen en incuber de platen gedurende 24 uur bij 28 graden Celsius.Gooi na 24 uur na blootstelling aan de teststof de blootstellingsmedia voorzichtig uit de putten weg door de inhoud in een opvangbak te gieten en was elke put met 200 microliter PBS. Om vervolgens de PBS te verwijderen zonder cellen te verliezen, giet u deze voorzichtig in een opvangbak. Om de Alamar Blue- of AB- en CFDA-AM-tests uit te voeren, voegt u 100 microliter van de betreffende oplossing per put toe en incubeert u de plaat gedurende 30 minuten in het donker bij 28 graden Celsius.Meet vervolgens de fluorescentie in een fluorescentieplaatlezer op de geschikte excitatie- en emissiegolflengten die in de tekst worden genoemd. Om de neutrale rode of NR-test uit te voeren, neemt u de NR-werkoplossing met een concentratie van 40 microgram per milliliter en centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 600 G. Verwijder vervolgens voorzichtig de eerder toegevoegde AB- en CFDA-AM-oplossingen uit de putten door de inhoud in een opvangbak te gieten.Voeg met behulp van een meerkanaals micropipette 100 microliter van de NR-werkoplossing per put toe en incuber de plaat gedurende drie uur bij 28 graden Celsius. Zodra de incubatie voorbij is, giet u de NR-oplossing voorzichtig van de plaat in een opvangbak en wast u de putten door 150 microliter PBS per put toe te voegen. Voeg na het wassen 150 microliter van de NR-extractieoplossing per put toe en incuber de plaat door deze gedurende 10 minuten voorzichtig op een plaatschudder te schudden voordat u de absorptie op 540 nanometer meet met behulp van een plaatlezer.Om de MTT-test uit te voeren, verwijdert u na de 24-uurs blootstelling aan de teststof voorzichtig de blootstellingsmedia door de inhoud in een opvangbak te gieten en met behulp van een meerkanaals micropipette 100 microliter MTT-werkoplossing per put in het donker toe te voegen. Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende vier uur in het donker. Gooi vervolgens de MTT-oplossing weg door de inhoud in een opvangbak te gieten en voeg 100 microliter DMSO toe aan elke put om de formazankristallen te extraheren.Incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder voordat u de absorptie op 517 nanometer meet met behulp van een plaatlezer. Voor de AP-test vertoonden de putten die overeenkomen met blanco, positieve controle- en zeer cytotoxische concentraties van teststoffen een blauwe kleur en lage fluorescentie, wat wijst op de afwezigheid of een vermindering van levensvatbare cellen. Daarentegen zetten de putten die overeenkomen met lage cytotoxische concentraties van de teststof en negatieve controle met een groot aantal levensvatbare cellen het resazurine om in roze resorufine met een hogere fluorescentie.Voor NR-test zijn de zeer cytotoxische concentraties van de teststoffen en de positieve controle transparant of lichtroze met een lage absorptie, terwijl putten met levensvatbare cellen die de NR-kleurstof behouden, een donkerroze kleur en een hoge absorptie vertonen. Evenzo zijn putten zonder levensvatbare cellen voor MTT-testen transparant, terwijl die met levensvatbare cellen MTT omzetten in violetkleurige formazan. Op basis van de berekende levensvatbaarheidspercentages van cellen werd de halve maximale remmerconcentratie of IC50-waarde geschat voor de verschillende teststoffen in ZFL- en ZEM2S-cellijnen.Er werd geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen waargenomen voor culturen met en zonder FBS, wat wijst op de geschiktheid van kweekmedia zonder FBS voor de chemische blootstellingsperiode van 24 uur. MTT- en NR-assays toonden geen significant effect van variërende DMSO-concentraties van 0,1% tot 1% op de levensvatbaarheid van cellen, wat aangeeft dat deze cellijnen het gebruik van DMSO als oplosmiddel tot 1% ondersteunen Let extra op tijdens het hanteren van vergulde cellen om zelfloslating tijdens de hele procedure te voorkomen en bereid de neutrale rode werkoplossing zorgvuldig voor om neerslag van kleurstoffen te voorkomen. Deze procedure kan worden toegepast op studies die verschillende aspecten van chemische effecten op vissen behandelen met behulp van in vitro modellen, en bijdragen aan de voortgang van geen op dieren gebaseerde ecotoxiciteitsstudies.

cytotoxicity-assays-with-zebrafish-cell-lines

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

This video describes the zebrafish xenograft assay to assess in vivo tumor formation and study the effect of therapeutic agents.

Zebrafish Xenograft Assay: A Method to Assess the Anti-cancer Efficacy of Therapeutics on Tumorigenicity in Zebrafish In Vivo

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Zebrafish xenograft modellen zorgen voor high-throughput drug screening en fluorescerende beeldvorming van menselijke kankercellen in een in vivo micro-omgeving. We ontwikkelden een workflow voor grootschalige, geautomatiseerde medicijnscreening op patiënt-afgeleide leukemiemonsters bij zebravissen met behulp van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop uitgeruste imaging unit.

Drug Screening van primaire patiënt afgeleid tumor Xenografts bij zebravissen

Dit protocol beschrijft de procedures om acute nierschade (AKI) te veroorzaken bij volwassen zebravissen met cisplatine als nefrotoxisch middel. We beschreven de stappen om de reproduceerbaarheid van de techniek te evalueren en twee technieken om respectievelijk ontsteking en celdood in het nierweefsel, flowcytometrie en TUNEL te analyseren.

Acuut nierletselmodel geïnduceerd door Cisplatine bij volwassen zebravissen

Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.

Zebravismodel van neuroblastoommetastase

De zebravis is onlangs gebruikt als model om potentiële stralingsmodificatoren te valideren. Het huidige protocol beschrijft de gedetailleerde stappen om zebravisembryo's te gebruiken voor op straling gebaseerde screeningsexperimenten en enkele observationele benaderingen om het effect van verschillende behandelingen en bestraling te evalueren.

Zebravislarven als model om potentiële radiosensibilisatoren of beschermers te evalueren

Hier presenteren we een effectief, eenvoudig en snel 3D-kweekprotocol voor de vorming van sferoïden van twee zebravissen (Danio rerio) cellijnen: ZEM2S (embryo) en ZFL (normale hepatocyt).

Een 3D-kweekmethode van sferoïden van embryonale en lever zebraviscellijnen

We gebruikten celproliferatiekleuring om slapende cellen te identificeren in het zebravis T-acute lymfoblastische leukemiemodel. De kleuring wordt vastgehouden in niet-delende cellen en verminderd tijdens celproliferatie, waardoor slapende cellen kunnen worden geselecteerd voor verder onderzoek. Dit protocol biedt een functioneel hulpmiddel om zelfvernieuwing te bestuderen in de context van cellulaire rust.

Identificatie van slapende cellen in een zebravis T-cel acute lymfoblastische leukemiemodel met behulp van celproliferatiekleuring 

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.

Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Leer cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen ZEM2S en ZFL in 96-well plates voor ecotoxiciteitonderzoek. Dit protocol combineert meerdere viabiliteitseindpunten om acute toxiciteit van chemicaliën te beoordelen.

Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Meer video's verkennen