Cytotoxiciteitstests met zebraviscellijnen

Het cytotoxiciteitstestprotocol met behulp van zebraviscellijnen kan vragen beantwoorden over acute toxiciteit van chemicaliën op vissen of helpen bij het definiëren van de juiste testconcentraties voor andere alternatieve vistests. Het belangrijkste voordeel van deze 96-well plaattest is het combineren van verschillende levensvatbaarheidseindpunten om cytotoxiciteit voor zebraviscellen te bepalen, wat een belangrijke vissoort is in ecotoxiciteitsstudies. Het protocol is heel eenvoudig.

Als u alle beschreven stappen correct volgt, zou men geen probleem moeten ondervinden. Dit protocol helpt om geen op dieren gebaseerde ecotoxiciteitsstudies te bereiken die effecten evalueren in viscellijnen afgeleid van verschillende organen of levensfase, zoals hepatocyten in embryonale cellen. Om te beginnen met het plateren van de ZEM2S- of ZFL-cellen, berekent u het volume van de respectieve celsuspensies die nodig zijn om het gewenste aantal cellen voor assays te verkrijgen.

Vul een steriel reagensreservoir met het volledige kweekmedium voor de overeenkomstige cellijn en breng het berekende volume van de celsuspensie over naar het reservoir voor een totaal volume van 20 milliliter. Meng de oplossing voorzichtig met behulp van een meerkanaalspipet op en neer zonder schuim of bubbels te vormen. Voeg vervolgens met behulp van de meerkanaals micropipette 200 microliter van de celsuspensie toe aan elke put van een transparante polystyreen 96-putplaat om een levensvatbaar celgetal van 60.000 cellen per put voor de ZEM2S-cellen en 40.000 cellen per put voor de ZFL-cellen te verkrijgen.

Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur. Om beide typen cellen bloot te stellen aan verschillende concentraties van de teststoffen, bereidt u de gewenste concentratie van teststofoplossingen in de kweekmedia voor de relevante cellijn voor zonder foetaal runderserum of FBS. Na de 24-uurs incubatie, gooi de gebruikte media voorzichtig weg uit de putten met behulp van een meerkanaals micropipette.

Voeg vervolgens 100 microliter van een bepaalde teststofoplossing per put toe in technische drievouden, wat drie putten betekent voor elke concentratie van de teststof. Plaats de controlegroepen op dezelfde plaat als de teststoffen in technische drievouden. Voeg voor de blancocontrole 100 microliter van de blootstellingsmedia toe in drie celvrije putjes.

Voeg voor de negatieve controle 100 microliter van de blootstellingsmedia toe aan drie putten die cellen bevatten. Stel voor de positieve controle drie putjes met cellen bloot aan een 1% Triton X-100-oplossing bereid in de blootstellingsmedia. Sluit de platen af met parafilm of zelfklevende afdichtingsfolie om verdamping van kweekmedium te voorkomen en incuber de platen gedurende 24 uur bij 28 graden Celsius.

Gooi na 24 uur na blootstelling aan de teststof de blootstellingsmedia voorzichtig uit de putten weg door de inhoud in een opvangbak te gieten en was elke put met 200 microliter PBS. Om vervolgens de PBS te verwijderen zonder cellen te verliezen, giet u deze voorzichtig in een opvangbak. Om de Alamar Blue- of AB- en CFDA-AM-tests uit te voeren, voegt u 100 microliter van de betreffende oplossing per put toe en incubeert u de plaat gedurende 30 minuten in het donker bij 28 graden Celsius.

Meet vervolgens de fluorescentie in een fluorescentieplaatlezer op de geschikte excitatie- en emissiegolflengten die in de tekst worden genoemd. Om de neutrale rode of NR-test uit te voeren, neemt u de NR-werkoplossing met een concentratie van 40 microgram per milliliter en centrifugeert u gedurende 10 minuten bij 600 G. Verwijder vervolgens voorzichtig de eerder toegevoegde AB- en CFDA-AM-oplossingen uit de putten door de inhoud in een opvangbak te gieten.

Voeg met behulp van een meerkanaals micropipette 100 microliter van de NR-werkoplossing per put toe en incuber de plaat gedurende drie uur bij 28 graden Celsius. Zodra de incubatie voorbij is, giet u de NR-oplossing voorzichtig van de plaat in een opvangbak en wast u de putten door 150 microliter PBS per put toe te voegen. Voeg na het wassen 150 microliter van de NR-extractieoplossing per put toe en incuber de plaat door deze gedurende 10 minuten voorzichtig op een plaatschudder te schudden voordat u de absorptie op 540 nanometer meet met behulp van een plaatlezer.

Om de MTT-test uit te voeren, verwijdert u na de 24-uurs blootstelling aan de teststof voorzichtig de blootstellingsmedia door de inhoud in een opvangbak te gieten en met behulp van een meerkanaals micropipette 100 microliter MTT-werkoplossing per put in het donker toe te voegen. Incubeer de plaat bij 28 graden Celsius gedurende vier uur in het donker. Gooi vervolgens de MTT-oplossing weg door de inhoud in een opvangbak te gieten en voeg 100 microliter DMSO toe aan elke put om de formazankristallen te extraheren.

Incubeer de plaat gedurende 10 minuten op een plaatschudder voordat u de absorptie op 517 nanometer meet met behulp van een plaatlezer. Voor de AP-test vertoonden de putten die overeenkomen met blanco, positieve controle- en zeer cytotoxische concentraties van teststoffen een blauwe kleur en lage fluorescentie, wat wijst op de afwezigheid of een vermindering van levensvatbare cellen. Daarentegen zetten de putten die overeenkomen met lage cytotoxische concentraties van de teststof en negatieve controle met een groot aantal levensvatbare cellen het resazurine om in roze resorufine met een hogere fluorescentie.

Voor NR-test zijn de zeer cytotoxische concentraties van de teststoffen en de positieve controle transparant of lichtroze met een lage absorptie, terwijl putten met levensvatbare cellen die de NR-kleurstof behouden, een donkerroze kleur en een hoge absorptie vertonen. Evenzo zijn putten zonder levensvatbare cellen voor MTT-testen transparant, terwijl die met levensvatbare cellen MTT omzetten in violetkleurige formazan. Op basis van de berekende levensvatbaarheidspercentages van cellen werd de halve maximale remmerconcentratie of IC50-waarde geschat voor de verschillende teststoffen in ZFL- en ZEM2S-cellijnen.

Er werd geen significant verschil in levensvatbaarheid van cellen waargenomen voor culturen met en zonder FBS, wat wijst op de geschiktheid van kweekmedia zonder FBS voor de chemische blootstellingsperiode van 24 uur. MTT- en NR-assays toonden geen significant effect van variërende DMSO-concentraties van 0,1% tot 1% op de levensvatbaarheid van cellen, wat aangeeft dat deze cellijnen het gebruik van DMSO als oplosmiddel tot 1% ondersteunen Let extra op tijdens het hanteren van vergulde cellen om zelfloslating tijdens de hele procedure te voorkomen en bereid de neutrale rode werkoplossing zorgvuldig voor om neerslag van kleurstoffen te voorkomen. Deze procedure kan worden toegepast op studies die verschillende aspecten van chemische effecten op vissen behandelen met behulp van in vitro modellen, en bijdragen aan de voortgang van geen op dieren gebaseerde ecotoxiciteitsstudies.