Een silicosemuismodel dat tot stand komt door herhaalde inademing van kristallijn silicastof

In het beschreven silicosemodel van muizen dat wordt gegenereerd door intralaserinfusie van kristalsilicastof, simuleerden alle CSD-suspensie meerdere keren het optreden en de ontwikkeling van menselijke silicose in grote mate. Deze methode is tijdbesparend en niveaubesparend, maar ook praktisch en effectief. Veroorzaakt verder geen mechanisch letsel aan de bovenste luchtwegen als gevolg van de operatie.

Deze methode zou ook kunnen worden gebruikt om ziektemodellen van virussen, bacteriën, et cetera te maken. De procedure zal worden gedemonstreerd door Hangbing Cao, een masterstudent uit mijn laboratorium, die bekwaam is in het voorbereiden van het silicose-muismodel. Begin met het bereiden van het kristallijne silicastof of CSD ten minste één dag voordat u de neusdruppels toedient.

Maal hiervoor silica een half uur in een agaatvijzel. Om de deeltjesgrootte en -vorm te controleren, bereidt u het monster voor op scanning-elektronenmicroscopie of SEM met behulp van geleidende tape om de siliciumdeeltjes te binden. Blaas met een föhn voorzichtig de deeltjes weg die niet stevig zijn gehecht voordat u doorgaat met het vastleggen van het beeld.

Meng vervolgens het gemalen silica en de steriele zoutoplossing in een concentratie van 20 milligram per milliliter met behulp van een ultrasone shaker. Draai ten slotte de voorbereide CSD-suspensie gedurende 10 seconden in een draaikolk. Dien 50 microliter CSD toe aan de verdoofde muis via een neusinfuus gedurende vier tot acht seconden.

Behandel de controlemuis met een gelijke hoeveelheid zoutoplossing, houd vervolgens het lichaam van de muis vast met de handpalm, knijp met de duim en wijsvinger in de huid aan de achterkant van de nek terwijl u de achterpoten van de muis met de andere vingers vastzet. Druk vijf tot 10 seconden lang vijf tot tien keer zachtjes met de andere wijsvinger op het kloppende hartgebied van de muis. Verwarm het in paraffine ingebedde longweefsel op een kookplaat bij 60 graden Celsius gedurende meer dan vier uur.

Om het paraffinegedeelte van was te ontdoen en te hydrateren, laat u het glaasje twee keer 30 minuten in xyleen weken, dompelt u het glaasje vervolgens achtereenvolgens vijf minuten in watervrij 95%85% en 75% ethanol, en ten slotte in gedeïoniseerd water, en plaatst u het glaasje vervolgens 10 minuten in de hematoxylinekleuringsemmer voordat u het gedurende vijf minuten voorzichtig afspoelt onder stromend water. Dompel het 10 seconden in de eosinekleuringsemmer. Na het uitdrogen van het monster in 75%85%95% en watervrije ethanol gedurende elk vijf minuten, maakt u het weefselgedeelte vrij door het vijf minuten onder te dompelen in xyleen en sluit u het af met ongeveer 60 microliter neutrale harsdruppels.

Plaats de afdekschuif voorzichtig over het gedeelte. Voor het kleuren van Masson kleurt u de ontwaxte en gehydrateerde paraffinemonsters gedurende 10 minuten met vers bereide 50%Weigert's hematoxyline, en spoelt u het objectglaasje na 10 seconden weken in zure ethanolvloeibaarheid voorzichtig af met stromend water voor blauwvorming van de kernen. Kleurt het monster vervolgens gedurende zeven minuten met druppels rode kleuroplossing en was het gedurende één minuut met 30% zoutzuurwerkoplossing.

Nadat u het objectglaasje gedurende 20 seconden in 95% alcohol hebt ondergedompeld, droogt u het monster twee keer één tot drie seconden uit met watervrije ethanol en maakt u, zoals eerder aangetoond, het monster helder en verzegeld. Voor Sirius-roodkleuring infiltreert u het van was ontdeed en gehydrateerde gedeelte gedurende een uur met Sirius-roodkleuringsoplossing en kleurt u vervolgens de celkernen gedurende acht tot 10 minuten met Mayer hematoxlyn-kleuringsoplossing. Spoel het voorzichtig af onder stromend water gedurende 10 minuten voordat u het glaasje uitdroogt, opruimt en verzegelt.

Infiltreer het ontwaxte en gehydrateerde paraffinemonster met 30 milliliter van een EDTA-antigeenoplossing van drie milligram per milliliter. Kook het monster 20 tot 30 minuten voordat u het wast met gedeïoniseerd water en het gedurende vijf minuten in PBST incubeert. Week het monster gedurende 15 minuten met vers bereide 0,3% waterstofperoxide-oplossing en was het driemaal gedurende vijf minuten met PBST.

Permeabiliseer het membraan van het monster gedurende 15 minuten met 0,3%Triton 100-oplossing en blokkeer met 30 tot 40 microliter 5%runderserumalbumine of BSA gedurende een uur. Voeg na het verwijderen van de blokkerende oplossing op de juiste manier verdunde primaire antilichamen NF-kappa B en CD-68 toe en incubeer het monster een nacht bij twee tot acht graden Celsius in een IHC-natte doos met microscoopglaasje. De volgende dag, nadat u het monster gedurende een uur op kamertemperatuur hebt gebracht, wast u het drie keer gedurende vijf minuten met PBST.

Incubeer het monster gedurende een uur in konijn anti-muis mierikswortelperoxidase gelabeld secundaire antilichamen bij kamertemperatuur. Was de monsters na incubatie opnieuw drie keer gedurende vijf minuten elk met PBST en incubeer het monster vervolgens gedurende vijf tot 20 minuten met het DAB-substraat dat overeenkomt met het enzymgelabelde antilichaam. Na het blussen van de reactie met gedeïoniseerd water, het monster gedurende 30 seconden tegenkleuren met Weigert's hematoxyline.

Spoel het een minuut onder stromend water, dehydrateer, verwijder en sluit het weefsel af. Voordat u overgaat tot de analyse van de western blot, homogeniseert u het weefsel met de RIPA werkoplossing op ijs gedurende vijf minuten met behulp van een draagbare elektrische molen. Incubeer gedurende een uur op ijs met schudden en centrifugeer het homogenaat bij 14.800 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Verzamel de supernatant en bepaal de eiwitconcentratie met een BCA-eiwittestkit. Voeg 20 microliter 5X laadbuffer toe aan de supernatant en verwarm vervolgens de met RIPA bereide eiwitopslagoplossing van zes microgram per microliter gedurende 20 minuten in een metalen bad bij 100 graden Celsius. Bewaar 100 microliter aliquots van de eiwitoplossing in elke buis bij min 80 graden Celsius.

Voor elektroforese verdunt u de aliquots tot twee tot drie microgram per microliter met RIPA lysaat en voegt u vervolgens 20 microgram monster per putje toe om de gel te laten lopen. Breng het eiwit gedurende 20 seconden over naar een PVDF-membraan dat vooraf is geactiveerd met methanol met behulp van de natte overdrachtsmethode met een stroom van 400 milliampère gedurende één tot twee uur. Na het vijf keer wassen van het membraan gedurende vijf minuten met PBST-oplossing, blokkeert u gedurende een uur met 5% BSA of magere melk.

Dompel de strips onder in de primaire antilichaamoplossing die NF-kappa B en bèta-actine bevat, verdund met 5% BSA. Schud de strips een nacht zachtjes bij twee tot acht graden Celsius voordat u ze wast met PBST. Incubeer vervolgens de strips, eerst in het verdunde secundaire antilichaam gedurende een uur bij kamertemperatuur met zacht schudden, en vervolgens met verbeterde chemiluminescentieontwikkelaar gedurende drie minuten.

Stel de strip gedurende 20 seconden bloot aan een gelimager en meet de grijswaarde van de strip om het eiwitniveau te beoordelen met behulp van systeemsoftware. De SEM-beelden van CSD toonden aan dat de deeltjes onregelmatig gevormd waren. Sirius-roodkleuring uitgevoerd om collageenafzetting te meten, toonde aan dat de progressie van longfibrose bij muizen aanzienlijk werd versneld na blootstelling aan CSD gedurende één maand.

Polariserende microscopie onthulde drie verschillende soorten collageenvezels, waarvan type één collageenvezels in rood een risicofactor zijn voor silicose, maar er werd geen significante fibrose gevonden in de voertuiggroep. Dit werd ook aangegeven door de respectievelijke fibrosescores. HE-kleuring van met CSD behandeld longweefsel van muizen toonde typische silicaknobbeltjes die worden gekenmerkt door vloeibare necrose na fagocytose van CSD in het centrum, omringd door macrofagen in de periferie.

Masson-kleuring toonde ook aan dat de knobbeltjes verrijkt waren met CSD die gepaard ging met fibrose. De immunohistochemische kleuring van CD-68 onthulde verder de brede aanwezigheid van macrofagen in longweefsel. Gepolariseerde lichtmicroscopie toonde aan dat deze macrofagen CSD hadden ingeslikt, wat ernstig longletsel veroorzaakte.

Immunohistochemische kleuring toonde een hogere NF-kappa B-kleuring, wat wijst op een hogere ontstekingsreactie in de met CSD behandelde groep dan in de mediumgroep. Representatieve western blot toonde ook aan dat de met CSD behandelde muizen een hogere NF-kappa B-expressie in de longen hadden, en het verschil in expressie tussen de twee groepen was significant. Om obstructie van de luchtwegen te voorkomen en het herstel van de ademhaling te bevorderen, moet het hartgebied van de muis vijf tot tien keer zachtjes worden gemasseerd, zoals aangetoond na een periode van vijf seconden.

Dit model kan een onderliggend mechanisme van silicose onderzoeken en helpen bij het screenen van therapeutische geneesmiddelen, samen met het vaststellen van cruciale parameters zoals dosering en duur. Deze technologie biedt een handige, effectieve en economische manier om muismodellen bloot te stellen aan fijnstof, ongeacht of dit bacteriën toevoegt. Het monitoren van het gedrag van muizen kan helpen bij het bepalen van de mogelijke effecten van het inademen van fijnstof.