Name: Het Chick Chorioallantoic Membrane (CAM)-model als hulpmiddel om ovariële weefseltransplantatie te bestuderen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Leer het CAM-xenotransplantatiemodel om vroege vascularisatie en follikeloverleving in menselijk eierstokweefsel te bestuderen. Deze kosteneffectieve methode biedt inzichten zonder ethische bezwaren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Mira Hryniuk, BA, voor het beoordelen van de Engelse taal van het artikel.

Het gebruik van menselijk weefsel werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Université Catholique de Louvain. De patiënten gaven hun schriftelijke geïnformeerde toestemming voor het gebruik van hun eierstokweefsel voor onderzoeksdoeleinden.
1. Dag 0 eieren bestellen die zeer waarschijnlijk worden belichaamd
<ol><li>Zoek een gecertificeerde, door Lohman geselecteerde leverancier van witte Leghorn-eieren van laboratoriumkwaliteit die een hoog percentage bevruchte eieren rapporteert, wat voornamelijk afhankelijk is van de leeftijd van de kuikens.</li>
</ol>2. Voorbereiden van de eieren voor incubatie
<ol><li>Vóór de aankomst van de eieren de broedmachine monteren en balanceren tot 37 °C bij een relatieve luchtvochtigheid van 40%-60%. Bewaak de temperatuur en luchtvochtigheid door een thermometer en hygrometer in de incubator te steken. Zorg ervoor dat het deksel van de broedstoof is uitgerust met een glazen venster om de interne parameters van de broedmachine te kunnen controleren zonder deze te hoeven openen (Figuur 1).</li>
	<li>Nadat u de eieren van dag 0 hebt ontvangen van door Lohman geselecteerde witte Leghorn-kuikens van een gecertificeerde eierleverancier van laboratoriumkwaliteit, reinigt u het oppervlak van de schalen met bevochtigd papier en droogt u ze onmiddellijk. NOTITIE: Aangezien het eierschaalmembraan poreus is, kan geautoclaveerd water worden gebruikt om eioppervlakken schoon te maken en de vochtigheid in de broedmachine te regelen om het risico op besmetting te minimaliseren.</li>
	<li>Label de eieren met een stift (bijv. datum en einummer).</li>
	<li>Broed de eieren uit met het puntige uiteinde naar beneden en draai ze om de CAM te laten ontwikkelen. Draai de eieren twee tot drie keer per dag handmatig 180° of gebruik een automatische rotator. OPMERKING: Om er zeker van te zijn dat de eieren inderdaad worden gedraaid, kan de eierschaal met een potlood of stift worden gemarkeerd met een "X" en "O" op de twee tegenoverliggende zijzijden. Het glazen venster in het deksel van de broedmachine maakt het mogelijk om de rotatie van de eieren te controleren zonder het apparaat te openen.</li>
</ol>3. Het openen van de eierschaal op dag 3 van ED
LET OP: Op dag 3 van de ED wordt een rechthoekig venster in de eierschaal gemaakt.
<ol><li>Bereid de laminaire stromingskap voor om in steriele omstandigheden te werken. Plaats de volgende instrumenten onder de motorkap en desinfecteer ze in 70% ethanol (indien nog niet gesteriliseerd): -Eierrek -Eierkaars of focale koude lichtbron -Marker -Steriele rechte pin -Steriele naald van 19 G -5 ml steriele spuit -Figuurzaagblad -Steriele pincet -Plakband</li>
	<li>Breng een ei over van de broedmachine naar het eierrek dat onder de motorkap is geplaatst en schakel de eierrotator uit.</li>
	<li>Identificeer in het donker de luchtzak van het ei door de eierkaars (of focale koude lichtbron) tegen de eierschaal te plaatsen. De luchtzak bevindt zich aan het stompe uiteinde van het ei. Gebruik een stift om het midden van de luchtzak op de eierschaal te bepalen.</li>
	<li>Doe de lichten aan. Maak een klein gaatje in de eierschaal waar het wordt gemarkeerd door voorzichtig een steriele rechte pin te draaien. Een kleine opening met een diameter van ongeveer 1 mm is meestal voldoende. LET OP: Pas op dat je de pin niet helemaal door het ei duwt. Als dit gebeurt, gooi dan het ei weg.</li>
	<li>Sluit een steriele naald van 19 G aan op een steriele spuit van 5 ml.</li>
	<li>Zoek in het donker de dooierzak met behulp van de eierkaars (of focale koude lichtbron) en prik het ei door het gat dat in stap 3.4 is gemaakt met de steriele naald van 19 G onder een hoek van 45° naar de bodem van het ei; Zorg ervoor dat u de dooierzak niet verstoort. Zuig tussen 1,5-2 ml albumine op om de CAM los te maken van de schaal en sluit vervolgens het gat met een stuk plakband. OPMERKING: Als de dooierzak tijdens het opzuigen wordt verstoord, zal de opgezogen vloeistof in de spuit geel gekleurd zijn in plaats van transparant (albumine). Als dit gebeurt, vervang dan de naald en spuit. Als er relatief veel eigeel wordt opgezogen, kan dit de levensvatbaarheid van het embryo in gevaar brengen.</li>
	<li>Doe de lichten aan. Leg het ei horizontaal en teken met een stift een rechthoekig venster van 1 cm x 1,5 cm. Maak het raam niet groter dan de gebruikelijke breedte van standaard plakband.</li>
	<li>Houd het ei in één hand en zaag het eerder getekende venster voorzichtig in de eierschaal met een figuurzaagblad. Zorg ervoor dat de schaal niet barst en snijd niet helemaal tot aan de ingedrukte CAM. Blaas regelmatig om schelpstof en vuil te verwijderen.</li>
	<li>Schuif een steriele pincet onder het rechthoekige stuk gezaagde schaal en pak het behendig vast om het netjes te verwijderen zonder de CAM te beschadigen. Gooi bovendien het witte membraan van de buitenste schil weg om het embryo en zijn CAM te kunnen zien. NOTITIE: Als er wat eierschaalstof of vuil op de CAM valt, kan dit worden verwijderd met een steriele pincet, waarbij u zeer voorzichtig moet zijn om de CAM niet te scheuren.</li>
	<li>Identificeer levensvatbare bevruchte eieren. Ze zijn te herkennen aan hun heldere eiwit en de vasculaire ring rond het embryo, waar soms zelfs in dit stadium (dag 3 van ED) een kloppend hart kan worden gedetecteerd. Gooi niet-bevruchte of dode embryo's weg.</li>
	<li>Plak plakband over het nieuw gemaakte raam om uitdroging te voorkomen. Zorg ervoor dat u het ene uiteinde over zichzelf vouwt om het verwijderen te vergemakkelijken.</li>
	<li>Leg het ei terug in de broedmachine met het geopende raam naar boven gericht en de tape raakt de CAM niet. Gebruik een gevouwen stuk papier of een deel van het eierrek om te voorkomen dat het ei gaat rollen. Zorg ervoor dat de roterende lade is uitgeschakeld.</li>
	<li>Herhaal stap 3.2-3.12 om de resterende eieren te openen.</li>
</ol>4. Enten van ingevroren-ontdooid menselijk eierstokweefsel op de CAM
OPMERKING: Transplantatie naar de CAM moet idealiter worden gestart tussen dag 7-10 van ED.
<ol><li>Ontdooi ingevroren ovariële corticale strips onder de laminaire stroomkap volgens het elders beschreven protocol30.</li>
	<li>Snijd de corticale stroken in drie fragmenten van 4 mm x 2 mm x 1 mm. Gebruik één stuk als niet-geënte controle en de andere twee voor xenotransplantatie gedurende 1 dag of 6 dagen. OPMERKING: Als er voldoende weefsel beschikbaar is, werk dan in tweevoud.</li>
	<li>Breng een ei van de broedmachine over naar het eierrek onder de motorkap, met het raam naar boven gericht.</li>
	<li>Trek de tape van het raam en zorg ervoor dat het embryo levensvatbaar is. In dit stadium hebben levensvatbare embryo's een uitgebreid vaatstelsel, een helder eiwit, een zichtbare hartslag en enige beweging van het embryo.</li>
	<li>Bereid de entplaats voor door een klein deel van de CAM voorzichtig te traumatiseren door een strook van 1cm2 steriel ether-geëxtraheerd lenspapier op het epitheeloppervlak te leggen en dit onmiddellijk te verwijderen. OPMERKING: De CAM is een ondoordringbare barrière, tenzij het membraan is getraumatiseerd door de verwijdering van het bovenste peridermale deel van de dubbele epitheellaag, waardoor de basale laag intact blijft. Deze techniek verbetert ook het revascularisatieproces door wondgenezing te activeren. Als het steriele, met ether geëxtraheerde lenspapier te lang op de CAM blijft zitten, kan het membraan aan het lenspapier blijven kleven en scheuren. Als dit gebeurt, gooi dan het ei weg.</li>
	<li>Pak een bevroren-ontdooide ovariële corticale strip (4 mm x 2 mm x 1 mm) vast met een microchirurgische pincet en plaats deze op de getraumatiseerde CAM met de medullaire kant tegen de CAM. Transplanteer één stukje weefsel per ei.</li>
	<li>Bedek het raam met plakband en leg het ei voorzichtig terug in de broedmachine. Zorg ervoor dat de opening van de eierschaal rechtop staat en dat het ei goed vastzit.</li>
	<li>Herhaal stap 4.1-4.7 voor het transplanteren van alle resterende weefsels. OPMERKING: De implantaten moeten op elke transplantatiedag worden gecontroleerd om de levensvatbaarheid van het embryo te beoordelen en veranderingen in het vaatstelsel te volgen.</li>
</ol>5. Oogsten van de grafts
OPMERKING: Xenotransplantaten moeten uiterlijk op dag 17 van ED worden geoogst, aangezien het immuunsysteem van het embryo vanaf dag 18 volwassen en competent wordt.
<ol><li>Plaats het ei op een rek en vergroot het venster in de eierschaal om een betere visualisatie van het transplantaat en eenvoudigere manipulatie mogelijk te maken.</li>
	<li>Evalueer het transplantaat macroscopisch en let vooral op de vasculaire reactie van de CAM op het transplantaat. Maak digitale foto's of video's voor de goede orde.</li>
	<li>Pak het weefsel of de omringende CAM vast met een pincet en gebruik een schaar of een scalpel om het transplantaat voorzichtig uit de CAM te verwijderen. OPMERKING: De grafts worden rond dag 3 van het enten bedekt met een tweede laag CAM en worden uiteindelijk ingekapseld. Ze kunnen op dag 6 ook in het ei zijn verplaatst, waardoor het in sommige gevallen moeilijk is om ze terug te halen.</li>
	<li>Analyseer de uitgesneden weefsels met behulp van een methode die geschikt is voor het gegeven experiment. In de huidige studie werden weefselstukjes gefixeerd in paraformaldehyde, ingebed in paraffine en gekleurd met hematoxyline en eosine volgens de onderstaande stappen:<ol><li>Fixeer de fragmenten gedurende 24 uur in 4 % paraformaldehyde en veranker ze in paraffine met behulp van een automatische inbedding volgens de in tabel 1 vermelde stappen.</li>
		<li>Laat de in paraffine ingebedde blokken een nacht bij 4°C staan voordat u ze met een microtoom in secties van 5 μm dik snijdt.</li>
		<li>Verdeel de weefseldelen over een glasplaatje op een hete plaat (30 °C) en laat ze 2 uur drogen, gevolgd door 24 uur in een oven op 37 °C.</li>
		<li>Kleurs daarna de objectglaasjes met hematoxyline en eosine volgens een elders beschreven protocol31. Digitaliseer vervolgens de monsters met behulp van een diascanner en analyseer ze met behulp van beeldanalysesoftware.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het meest uitdagende deel van het hier beschreven protocol is het maken van het kleine gaatje dat nodig is om het eiwit op te zuigen om de CAM los te maken van de eierschaal voordat een venster wordt gemaakt. Te veel druk uitoefenen kan leiden tot overpenetratie of kan zelfs het ei barsten en vernietigen, waardoor onherroepelijke schade aan de CAM en zijn vasculatuur ontstaat. Om fouten tot een minimum te beperken tijdens de eerste pogingen om de CAM te scheiden, wordt sterk aangeraden om te oefenen met het maken van kle...

De vraag naar vruchtbaarheidsbehoud voor oncologische en goedaardige indicaties, evenals om sociale redenen, is de afgelopen decennia dramatisch toegenomen. Verschillende behandelingen die worden gebruikt om kwaadaardige en niet-kwaadaardige ziekten te genezen, zijn echter zeer giftig voor de geslachtsklieren en kunnen leiden tot iatrogene voortijdige ovariële insufficiëntie, wat uiteindelijk leidt totonvruchtbaarheid. Gevestigde technieken voor het behoud van vruchtbaarheid zijn onder meer cryopreservatie van embryo's, vitrificatie van onrijpe of rijpe eicellen en cryopreservatie van eierstokweefsel 2,3,4. Het bevriezen van eierstokweefsel is de enige beschikbare optie voor het behoud van de vruchtbaarheid bij prepuberale meisjes of vrouwen die onmiddellijke kankertherapie nodig hebben. Het herstel van de endocriene functie na transplantatie van eierstokweefsel komt voor bij meer dan 95% van de proefpersonen, met levendgeborenen variërend van 18% tot 42%5,6,7,8,9.
Hoewel de transplantatie van ingevroren-ontdooid eierstokweefsel succesvol is gebleken, is er nog ruimte voor verbetering. Inderdaad, aangezien ovariële corticale fragmenten worden getransplanteerd zonder vasculaire anastomose, ervaren ze een periode van hypoxie waarin transplantaatrevascularisatie plaatsvindt 10,11,12. De overgrote meerderheid van de onderzoeken naar transplantatie van menselijk eierstokweefsel heeft gebruik gemaakt van een xenotransplantaatmodel, waarbij eierstokweefsel wordt getransplanteerd naar immunodeficiënte muizen. De volledige revascularisatie van de xenotransplantaten duurt ongeveer 10 dagen, waarbij zowel de gastheer- als de transplantaatvaten bijdragen aan de vorming van functionele vaten 12,13,14. Ongeveer 50%-90% van de follikelreserve gaat verloren tijdens dit hypoxische venster vóór de voltooiing van de transplantaatrevascularisatie 10,15,16. Er is sterk gesuggereerd dat dit massale follikelverlies optreedt door zowel directe follikelsterfte, zoals blijkt uit een afname van het absolute aantal follikels dat overblijft na transplantatie, als de activering van primordiale follikelgroei, zoals aangegeven door veranderingen in follikelverhoudingen in de richting van verhoogde groeisnelheden van follikels17,18.
Interessant is dat eerder onderzoek met behulp van verschillende dierlijke eierstokweefsels die zijn geënt op het chorioallantoïsche membraan (CAM) van kuikens, dat een constitutie heeft die de typische entplaats van het peritoneum nabootst, de remming van spontane follikelactivering heeft gemeld, waarbij de primordiale follikelreserve tot 10 dagen intact blijft 19,20,21,22. Ons team heeft eerder aangetoond dat het enten van ingevroren-ontdooid menselijk eierstokweefsel op CAM een betrouwbare benadering vormde voor het onderzoeken van transplantatie van menselijk eierstokweefsel in de eerste ischemische stadia23 en toonde onlangs aan dat deze transplantatiemethode in staat was om follikelactivering tegen te gaan24.
Het CAM-model is vooral aantrekkelijk, niet alleen omdat eieren veel goedkoper zijn dan muizen, maar ook vanwege de sterk gevasculariseerde aard van CAM, waardoor het verband tussen follikelactivering en revascularisatie van het ovariumtransplantaat kan worden onderzocht. Het vogelsysteem is inderdaad een van de meest voorkomende en veelzijdige manieren om angiogenese te bestuderen25. De ontwikkeling van kuikenembryo's (ED) duurt 21 dagen tot het uitkomen en de CAM wordt binnen de eerste 4-5 dagen gevormd door de fusie van allantois en chorion26. Met name het kuikenembryo is een van nature immunodeficiënte gastheer tot dag 17 van ED, dus xenotransplantatie-experimenten kunnen worden uitgevoerd zonder enig risico op afstoting van het transplantaat27,28. Bovendien levert de benadering van het CAM-model geen ethische of juridische bezwaren op in termen van Europees recht29, waardoor het een aantrekkelijk alternatief is voor andere diermodellen. Wat de kweekomstandigheden betreft, hebben kuikenembryo's alleen een broedmachine nodig die is ingesteld op 37 °C met een relatieve luchtvochtigheid van 40%-60%. Deze beperkte experimenteervereisten verlagen de onderzoekskosten aanzienlijk in vergelijking met het gebruik van immunodeficiënte muizen.
Het hierin gepresenteerde protocol heeft tot doel de ontwikkeling van een CAM-xenotransplantatiemodel voor menselijk eierstokweefsel te beschrijven en specifieke inzichten te verschaffen in de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek van transplantaatrevascularisatie en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen. Dit protocol zou van groot belang kunnen zijn voor het onderzoeken van de mechanismen achter het vroege follikelverlies na transplantatie en het bestuderen van de impact van verschillende middelen (groeifactoren, hormonen, enz.) op dit fenomeen.

<table><tbody><tr><td>Agani hypodermic needle, 19 G</td><td>Terumo Europe</td><td>AN*1950R1</td><td>19 G naald om albumine te aspireren</td></tr><tr><td>Terumo spuit, 5 mL concentrische Luer lock</td><td>Terumo Europe</td><td>SS*05LE1</td><td>5-mL steriele spuit</td></tr><tr><td>Caseviewer v2.2</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td>Beeldanalysesoftware</td></tr><tr><td>Diethylether</td><td>Merck Chemicals</td><td>603-022-00-4</td><td>Steriele ether om de CAM te traumatiseren</td></tr><tr><td>Eosine Y waterige oplossing 0,5%</td><td>Merck</td><td>1098441000</td><td>Kleurstofoplossing</td></tr><tr><td>Formaldehyde 4% waterige buffered oplossing (Formaline 10%)</td><td>VWR</td><td>97139010</td><td>Formaldehyde gebruikt voor weefselfixatie</td></tr><tr><td>Koelkast</td><td>Liebherr</td><td>7081260</td><td>Koelkast op 4 °C gebruikt voor paraffine-inbedding</td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>Schott</td><td>SLK2</td><td>Hete plaat gebruikt om de slides te drogen</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Thermo Forma Scientific 3111</td><td>10365156</td><td>Oven gebruikt voor slide-incubatie</td></tr><tr><td>Leica CLS 150 XE microscoop koude lichtbron</td><td>Leica</td><td>CLS 150 XE</td><td>Focaal koude lichtbron om de eieren te onderzoeken</td></tr><tr><td>Lensreinigingsdoek, graad 541</td><td>VWR</td><td>111-5003</td><td>Doek om in steriele ether te weken om de CAM te traumatiseren</td></tr><tr><td>Mayer's hematoxylinen</td><td>MERCK</td><td>1092491000</td><td>Kleurstofoplossing</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>20847307</td><td>Methanol</td></tr><tr><td>Microtoom</td><td>ThermoScientific-MICROM</td><td>HM325-2</td><td>Microtoom</td></tr><tr><td>Pannoramic P250 Flash III</td><td>3DHISTECH</td><td>/</td><td>Slidescanner met 20x vergroting</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Merck</td><td>1,04,00,51,000</td><td>Paraffine-inbeddingsoplossing</td></tr><tr><td>Paraplast Plus R</td><td>Sigma</td><td>P3683-1KG</td><td>Paraffine</td></tr><tr><td>Petrischaal, 60x15 mm, steriele</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Steriele petrischaal</td></tr><tr><td>Pin holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Pin holder</td></tr><tr><td>Polyhatch</td><td>Brinsea</td><td>CP01F</td><td>Ei-incubator met automatische rotator</td></tr><tr><td>Scroll zaagblad, 132 mm</td><td>Sencys</td><td>/</td><td>Zaagblad om een venster in de eischaal te maken</td></tr><tr><td>Roestvrijstalen inzetstiften</td><td>Fine Science Tools</td><td>26007-02</td><td>Rechte pin om een gat in de eischaal te maken</td></tr><tr><td>Steril-Helios</td><td>Angelantoni Industrie</td><td>ST-00275400000</td><td>Laminaire stroomkap</td></tr><tr><td>Superfrost Plus rands raads 90°</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>Glijmiddelvrije glazen slides</td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 6Al</td><td>Sakura</td><td>60320417-0711 VID6E3-1</td><td>Automatisch inbeddingsapparaat</td></tr><tr><td>Titanium pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11602-16</td><td>Pincet voor eischaal verwijdering en manipulatie van ovariumweefsel</td></tr><tr><td>Tolueen, pa</td><td>VWR</td><td>28701364</td><td>Paraffine-inbeddingsoplossing</td></tr></tbody></table>

het chick chorioallantoic membrane (cam)-model als hulpmiddel om ovariële weefseltransplantatie te bestuderen

The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Model as a Tool to Study Ovarian Tissue Transplantation

Cryopreservatie en transplantatie van eierstokweefsel is een effectieve strategie voor het behoud van de vruchtbaarheid, maar heeft één groot nadeel, namelijk massaal follikelverlies dat kort na herimplantatie optreedt als gevolg van abnormale follikelactivering en overlijden. Knaagdieren zijn benchmarkmodellen voor het onderzoeken van follikelactivering, maar de kosten, tijd en ethische overwegingen worden steeds onbetaalbaarder, waardoor de ontwikkeling van alternatieven wordt gestimuleerd. Het kuikenchorioallantoïsch membraan (CAM)-model is bijzonder aantrekkelijk, omdat het goedkoop is en natuurlijke immunodeficiëntie handhaaft tot dag 17 na de bevruchting, waardoor het ideaal is om xenotransplantatie op korte termijn van menselijk eierstokweefsel te bestuderen. De CAM is ook sterk gevasculariseerd en wordt veel gebruikt als model om angiogenese te onderzoeken. Dit geeft het een opmerkelijk voordeel ten opzichte van in-vitromodellen en maakt het mogelijk om mechanismen te onderzoeken die van invloed zijn op het vroege proces van follikelverlies na transplantatie. Het hierin beschreven protocol heeft tot doel de ontwikkeling te beschrijven van een CAM-xenotransplantatiemodel voor menselijk eierstokweefsel, met specifieke inzichten in de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek voor revascularisatie van het transplantaat en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen.

Overlevingspercentages van kuikenembryo's Het overlevingspercentage van het embryo vanaf venstervorming (dag 3 van ED) tot transplantatie van eierstokweefsel (dag 7 van ED) was 79% (33/42). Aangezien het percentage bevruchte eieren op dag 0 onbekend is, werden overtollige eieren op dag 0 van door Lohman geselecteerde witte Leghorn-kippen besteld om ervoor te zorgen dat er voldoende bevruchte eieren beschikbaar zouden zijn om te enten. In totaal werden 23 levensvatbare eieren van dag 7 gebruikt voor en...

Hier beschrijven we een protocol voor het ontwikkelen van een xenotransplantatiemodel voor kuikenchorioallantoïsch membraan (CAM) voor menselijk eierstokweefsel en demonstreren we de effectiviteit van de techniek, het tijdsbestek voor revascularisatie van het transplantaat en de levensvatbaarheid van het weefsel gedurende een transplantatieperiode van 6 dagen.

Het Chick Chorioallantoic Membrane (CAM)-model als hulpmiddel om ovariële weefseltransplantatie te bestuderen

Ovarian tissue cryopreservation and transplantation is an effective strategy for preserving fertility but has one major drawback, namely massive follicle ...

Het gebruik van CAM om vroege veranderingen na transplantatie van eierstokweefsel te observeren, heeft een aanzienlijk voordeel ten opzichte van in-vitromodellen, omdat het onderzoek mogelijk maakt naar het mechanisme dat van invloed is op het vroege vascularisatie- en follikelverliesproces. Deze techniek is goedkoop en kan de eerste 17 dagen worden uitgevoerd zonder enig risico op afstoting van het transplantaat als gevolg van de natuurlijke immunodeficiëntie van het embryo. Bovendien levert deze benadering geen ethische of juridische bezwaren op in termen van Europees recht.De beste strategie om de manuele vaardigheden te ontwikkelen die nodig zijn voor het manipuleren van eieren, kan worden bereikt door vóór het eigenlijke experiment te trainen met niet-bevruchte eieren. Label om te beginnen de dag nul eieren ontvangen van Leuvense geselecteerde witte leghornkuikens met behulp van een marker. Broed de eieren uit in een broedmachine op 37 graden Celsius, met de puntige uiteinden naar beneden gericht.Draai de eieren 180 graden, twee tot drie keer per dag handmatig. Plaats in het donker een eierkaars tegen de eierschaal en bepaal met een stift het midden van de luchtzak op de eierschaal. Doe de lichten aan en draai een steriele rechte pen op de gemarkeerde positie om een opening van ongeveer een millimeter te maken.Lokaliseer de dooierzak in het donker met behulp van de eierkaars. Prik in het ei met een steriele naald van 19 gauge, onder een hoek van 45 graden naar de onderkant van het ei, zonder de dooierzak te verstoren. Zuig 1,5 tot twee milliliter van het albumine op om de CAM los te maken van de schaal.Sluit vervolgens het gat af met plakband. Doe de lichten aan en teken een rechthoekig venster van één bij 1,5 centimeter op het horizontaal geplaatste ei. Houd het ei in één hand en snijd voorzichtig een venster in de eierschaal, met behulp van een figuurzaagblad, zonder de schaal te barsten.Blaas regelmatig om schelpstof en vuil te verwijderen. Schuif een steriele pincet onder het rechthoekige stuk schaal en verwijder het netjes zonder de CAM te beschadigen. Gooi vervolgens het witte membraan van de buitenste schil weg om het embryo en de CAM te zien.In levensvatbare bevruchte eieren worden op dag drie van de ontwikkeling van kuikenembryo's heldere albumine, een vasculaire ring rond het embryo en soms een kloppend hart gezien. Leg het ei onder de laminaire stroomkap op het eierrek met het venster naar boven gericht en trek de tape eraf. Plaats voorzichtig een strook van een vierkante centimeter steriel ethergeëxtraheerd lenspapier op het epitheeloppervlak en verwijder deze onmiddellijk, om een klein deel van de CAM te traumatiseren.Pak vervolgens een bevroren ontdooide ovariumcorticale strip vast met een microchirurgische pincet en plaats deze op de getraumatiseerde CAM met de medullaire kant tegen de CAM. Evalueer het transplantaat macroscopisch en besteed bijzondere aandacht aan de vasculaire reactie van de CAM op het transplantaat voordat u digitale foto's of video's maakt. Als u klaar bent, oogst u het transplantaat door het weefsel of de omringende CAM met een tang vast te pakken en het transplantaat voorzichtig met een schaar uit de CAM te snijden.De grafts waren levensvatbaar in 100% van de gevallen na de eerste dag van de enting. Ze waren al gedeeltelijk gehecht aan de CAM en vertoonden het wielspaakpatroon van bloedvaten die nodig zijn voor hun vascularisatie. Na zes dagen enten werden de implantaten op de CAM geplakt.Rond dag drie na de transplantatie werden de grafts bedekt met een tweede laag CAM en werden ze ingekapseld. Het transplantaat vertoonde een goede vascularisatie, waarbij 80% van de transplantaties het ei binnendrong. Twee grafts hechtten zich niet aan de CAM en kregen een necrotisch uiterlijk, wat resulteerde in een overlevingspercentage van getransplanteerd weefsel van 83% na zes dagen.Bij de histologische evaluatie van de transplantatie werden op alle tijdstippen gezonde follikels waargenomen. Na de transplantatie werd een onbeduidende afname van de follikeldichtheden waargenomen. De overlevingspercentages van de follikels werden tijdens de transplantatieperiode gehandhaafd op 95% op dag één en 83% op dag zes.Het meest uitdagende deel is het maken van het kleine gaatje dat nodig is om het albumine op te zuigen, om de CAM los te maken van de eierschaal, voordat een venster wordt aangebracht. Te veel druk kan leiden tot overstimulatie, of kan zelfs het ei barsten en vernietigen, waardoor onherroepelijke schade aan de CAM of het vaatstelsel ontstaat. Dit model is ideaal voor het testen van verschillende aspecten van het vroege eierstokweefsel na de transplantatieperiode, waaronder de impact van pro-angiogene factoren, beschermende antioxidanten, cytokines, hormonen en andere factoren die de activering en vroege groei van follikels regelen.Dit model gaf het verband aan tussen vroege vascularisatie en modulatie van follikelactivering, de twee belangrijkste gebeurtenissen die resulteren in de afname van de ovariële reserve na transplantatie van eierstokweefsel.

the-chick-chorioallantoic-membrane-cam-model-as-tool-to-study-ovarian

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het kuiken chorion-membraan (CAM) is een uniek, natuurlijk immunodeficiënte ondersteunende cultuur omgeving om angiogenese en tumorigenese studie. Deze video artikel demonstreert de verschillende stappen in het...

Kuiken Ex ovo Cultuur en Ex ovo CAM test: Hoe het echt werkt

In this video, we describe a technique to open the eggshell of a fertilized chicken egg to expose its chorioallantoic membrane or CAM carrying a network of branching blood vessels. The exposed CAM can be used for in ovo tumor modeling.

Egg Windowing: A Method of Opening Fertilized Chicken Egg Shell to Expose Chorioallantoic Membrane Vasculature

In this video, we describe the implantation of cancer cells onto a chicken chorioallantoic membrane to generate an in ovo model. The model successfully engrafts the ovarian cancer cells to study the progression of gynecological cancer.

Chicken Chorioallantoic Membrane-based Cancer Modeling: An In Ovo Model to Study Cancer Cell Tumorigenesis and Metastasis

In this video, we describe the method to co-culture dorsal root ganglia and cancer cells on chick chorioallantoic membrane or CAM to study perineural invasion.

Chick Chorioallantoic Membrane or CAM Tumor Model: An In Ovo Method to Simulate Perineural Invasion of Tumor Cells

This video demonstrates the isolation of tumor-bearing chorioallantoic membrane from the chicken embryo. The harvested CAM can be used for further downstream applications.

Chick Chorioallantoic Membrane Harvest: A Method to Isolate Tumor Graft-bearing Chorioallantoic Membrane from Chicken Egg

De<em&gt; In ovo</em&gt; CAM-assay als Xenograftmodel voor sarcoom

Het dooierzakmembraan van het kuiken (CAM) is immuundeficiënt en sterk gevasculariseerd, waardoor het een natuurlijke in vivo model van tumorgroei en angiogenesis is. In dit protocol beschrijven we een betrouwbare methode om driedimensionale, gevasculariseerde hepatocellulair carcinoom (HCC) tumoren te laten groeien met behulp van de CAM-assay.

De<em&gt; In Ovo</em&gt; Chick chorioallantoïsmembraan (CAM) Assay als een efficiënte xenotransplantaatmodel van Hepatocellular Carcinoom

Perineural invasie is een agressief fenotype voorhoofd-en nek plaveiselcel cel carcinoom en andere tumoren. Het kuiken chorioallantoic membraan model is gebruikt voor het bestuderen van bloedvat, kanker invasie, en metastase. Hier laten we zien hoe dit model kan worden gebruikt om perineural invasie in vivo te beoordelen.

Het kuiken Chorioallantoic membraan in vivo model om Perineural invasie in hoofd en hals kanker te beoordelen

We presenteren het kipchorioallantoïsche membraanmodel als een alternatief, transplanteerbaar, in vivo model voor de engraftment van gynaecologische en urologische kankercellijnen en tumoren die door de patiënt zijn afgeleid.

Met behulp van de Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model om gynaecologische en urologische kankers studie

Dit protocol beschrijft drie methoden voor het verkrijgen en gebruiken van 5 tot 8 dagen oude kippenembryo's en hun chorioallantoic membrane (CAM) als een in vivo model om contrastverbeterde ultrasone beeldvorming en microbubbel-gemedieerde medicijnafgifte te bestuderen.

De voorbereiding van Chicken Ex Ovo Embryo's en Chorioallantoic Membrane Vessels als In Vivo Model voor Contrast-Enhanced Ultrasound Imaging en Microbubble-Gemedieerde Drug Delivery Studies

Het chorioallantoic membrane (CAM) van het aviaire embryo is een zeer nuttig en toepasbaar hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. Een speciaal ex ovo model van Japanse kwartel CAM is geschikt voor fotodynamisch behandelonderzoek.

Kwartel Chorioallantoic Membrane - Een hulpmiddel voor fotodynamische diagnose en therapie

Leer het CAM-xenotransplantatiemodel om vroege vascularisatie en follikeloverleving in menselijk eierstokweefsel te bestuderen. Deze kosteneffectieve methode biedt inzichten zonder ethische bezwaren.

Het Chick Chorioallantoic Membrane (CAM)-model als hulpmiddel om ovariële weefseltransplantatie te bestuderen

Meer video's verkennen