Dissectie van pancreasweefsel om levensvatbare afzonderlijke cellen te isoleren
26 mei 2023
Metaplastische cellen van de alvleesklier zijn voorlopers van kwaadaardige cellen die aanleiding geven tot pancreastumoren. Het isoleren van intacte levensvatbare alvleeskliercellen is echter een uitdaging. Hier presenteren we een efficiënte methode voor dissociatie van pancreasweefsel. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) of voor twee- of driedimensionale co-culturing.
Het aangetoonde dissociatieprotocol van pancreasweefsel is eenvoudig en biedt een hulpmiddel om levensvatbare afzonderlijke cellen uit pancreasweefsel te isoleren in verschillende stadia tijdens het maligniteitsproces, inclusief solide tumoren. Het herstellen van intacte en levensvatbare acinaire cellen is een grote uitdaging. Het protocol kan levensvatbare afzonderlijke cellen herstellen van normale pancreata, pancreata met pre-maligne laesies of pancreastumoren die talrijke stromale en immuuncellen bevatten.
Het gebruik van dit protocol om menselijke pancreastumoren of ontstoken pancreas te ontleden, zou kunnen helpen bij het onderzoeken van deze ziekten om nieuwe biomarkers en behandelingen te vinden. De methode is gemakkelijk te gebruiken en kan met minimale oefening de gewenste resultaten opleveren. Deze video helpt om de kleine details van het protocol te bekijken.
Voordat u met de dissectie begint, moet u alle instrumenten en apparatuur gereed houden op ijs. Nadat u de geëuthanaseerde muis hebt gerepareerd, besproeit u zijn buik met 70% ethanol. Maak met een schaar en een tang een V-vormige incisie van 2,5 centimeter in het genitale gebied van het dier en ga omhoog om de buikholte volledig te openen.
Zoek de maag aan de linkerkant van de muis en de alvleesklier, die zich in de buurt van de milt bevindt. Scheid met twee tangen de alvleesklier van de maag en de twaalfvingerige darm zonder te scheuren. Ga verder en scheid de alvleesklier van de dunne darm, het jejunum en het ileum.
Verplaats de alvleesklier naar de rechterkant en scheid de resterende verbindingen tussen de alvleesklier en de borstholte met een tang om de alvleesklier en de aangehechte milt volledig los te maken. Verwijder voorzichtig de alvleesklier zonder mesenteriaal vet of ander aangrenzend weefsel en spreid het uit voor onderzoek in een petrischaal op ijs. Bereid volgens de in de tekst genoemde samenstelling de dissociatiebuffers 1 en 2, wasbuffer en enzymactiviteitsstopoplossing van tevoren voor.
Plaats de alvleesklier in een buis van 50 milliliter op ijs en spoel deze af met 10% foetaal runderserum, of FBS, en Hank's Balanced Salt Solution, of HBSS. Het vet zal drijven en de alvleesklier zal zinken. Dit is een gemakkelijke manier om het vervuilende witte vetweefsel dat nog aan de alvleesklier vastzit, te visualiseren en snel te verwijderen.
Breng vervolgens het alvleesklierweefsel van de muis over en bewaar het in een steriele petrischaal met vijf milliliter HBSS op ijs tot het snijden. Knip met een Noyes-schaar en een scalpel de alvleesklier in kleine stukjes van één tot drie kubieke millimeter. Nadat u de weefsels in een centrifugebuis hebt overgebracht, centrifugeert u deze gedurende vijf minuten op 350 G en vier graden Celsius.
Zuig het supernatans op en gooi het weg om celfragmenten en bloedcellen te verwijderen. Resuspend suspendeer de stukken in dissociatiebuffer 1 met 0,02% trypsine-C en 0,05% EDTA gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius met agitatie. Onmiddellijk wassen met 10%FBS en Dulbecco's Modified Eagle's Medium, of DMEM, en vijf minuten centrifugeren op 350G en vier graden Celsius.
Was opnieuw door de pellet opnieuw te suspenderen in 10 milliliter wasbuffer en zoals voorheen vijf minuten te centrifugeren voor de volgende dissociatiestap. Incubeer de alvleesklier in dissociatiebuffer 2 gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met agitatie bij 180 omwentelingen per minuut. Voer na 15 minuten mechanische dissociatie uit door de pancreasfragmenten 10 keer krachtig op en neer te pipetteren met behulp van steriele serologische pipetten.
Herhaal dit met pipetten van afnemende grootte, beginnend bij 25, 10 tot 5 milliliter. Incubeer het monster om het op 37 graden Celsius te brengen. Gebruik lichtmicroscopie om de dissociatie te controleren op basis van de hoeveelheid enkele cel in de suspensie.
Bewaak de levensvatbaarheid van de cel met behulp van trypan blue. Ga door met incuberen en controleer de dissociatie door elke vijf minuten monsters te nemen. Incubeer tot 90% van de cellen is gescheiden in enkele cellen.
Nadat het alvleesklierweefsel goed is gedissocieerd, aangegeven door het verdwijnen van pancreasfragmenten en de toenemende troebelheid van de oplossing, stopt u de enzymatische reactie door tweemaal te wassen met enzymactiviteit, stop de oplossing gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Houd vanaf deze stap de celsuspensie op ijs. Haal de celsuspensie door een nylon gaas van 70 micron.
Een kleinere nylon maaswijdte kan de levensvatbaarheid van de cel verminderen. Controleer de levensvatbaarheid van de cel onder de microscoop. Resuspendeer en was de pellet met 5 tot 10 milliliter ijskoude gebufferde wasoplossing voordat u de cellen telt.
Als er meerdere rode bloedcellen worden waargenomen, behandel de cellen dan gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met een lysebuffer voor rode bloedcellen. In gevallen waarin klonters worden waargenomen, moeten de monsters opnieuw worden behandeld met trypsine, zoals eerder beschreven. Als de levensvatbaarheid minder dan 80% is, moeten levende cellen worden geïsoleerd met behulp van de magnetisch geactiveerde celsortering of MACS-kit voor het verwijderen van dode cellen met MACS MS-kolommen.
De rode kleur van het geïsoleerde pancreasweefsel was het gevolg van de expressie van tdTomato in de acinaire cellen. In een vroeg stadium van de dissociatie waren er lage aantallen geïsoleerde cellen en grote aantallen klonten. Later werden geïsoleerde levensvatbare cellen verkregen zonder het aantal levensvatbare cellen te verminderen.
Langere incubatie verminderde de levensvatbaarheid van de cellen. De tdTomato-positieve cellen werden geschat met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering. Het Gentle Dissociation Protocol ondersteunde het herstel van meerdere celtypen, met een hoge levensvatbaarheid die het mogelijk maakte om de gewenste celtypen op te volgen.
Het tellen van levende cellen tot dode cellen werd gedaan met behulp van een hemacytometer. De fluorescentiebeelden van bevroren pancreassecties toonden de tdTomato-positieve acinaire cellen. De eencellige RNA-sequencing bevestigde de detectie van alle celtypen die werden gedetecteerd in fluorescentie-geactiveerde celsortering in elk gereseceerd weefsel vanaf alle tijdstippen.
De carboxypeptidase1 of CPA1-expressie in acinaire cellen werd bestudeerd, wat wijst op minimale contaminatie met het transcriptoom van andere celtypen. Het is belangrijk op te merken dat langere incubatietijden de levensvatbaarheid van de cellen verminderden, dus het is belangrijk om het monster te controleren en de dissociatie van het weefsel en de levensvatbaarheid van de cellen om de paar minuten onder de microscoop te observeren. Het celisolatieprotocol kan worden gebruikt voor single cell RNA-sequencing, het kweken van cellen of als uitgangsmateriaal voor organoïden.
Deze techniek maakt het mogelijk om te onderzoeken hoe alvleesklierkanker zich ontwikkelt en om de interacties te onderzoeken tussen cellen die ontstoken of kankerweefsel infiltreren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een eenvoudig en efficiënt protocol voor het dissocieren van pancreasweefsel om levensvatige enkelcellen te isoleren. De methode is toepasbaar op verschillende stadia van pancreasmaligniteit, wat bijdraagt aan de studie van pancreastumoren en premaligne laesies.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Pancreatische metaplastische cellen zijn voorlopers van maligne cellen.
- Het isoleren van intacte, levensvatbare pancreascellen is een aanzienlijke uitdaging.
- Het protocol kan cellen herstellen uit zowel normaal als ziek pancreasweefsel.
- Inzicht in deze cellen kan leiden tot nieuwe biomarkers en behandelingen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het isoleren van levensvatbare pancreascellen.
- Om onderzoek naar pancreastumoren en aanverwante ziekten te faciliteren.
- Om te helpen bij de identificatie van nieuwe therapeutische doelwitten.
Gebruikte methoden
- Protocol voor de dissociatie van pancreasweefsel.
- Isolatie van enkelvoudige cellen voor downstream-toepassingen.
- Toepassing op verschillende stadia van maligniteit.
- Gebruik van het protocol voor menselijke pancreastumoren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle terugwinning van levensvatbare acinaire cellen uit pancreasteweefsels.
- Protocol toepasbaar op weefsels met premaligne laesies en tumoren.
- Minimale praktijkervaring vereist om de gewenste resultaten te bereiken.
- Potentieel om het begrip van pancreasziekten te verbeteren.
Conclusies
- Het protocol is een waardevol instrument voor onderzoek naar de pancreas.
- Het helpt bij het onderzoeken van pancreastumoren en ontstekingen.
- Het kan de ontdekking van nieuwe biomarkers en behandelingen ondersteunen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Efficiënte isolatie van levensvatbare enkelcellen uit pancreasweefsel is cruciaal voor vroege ontdekking en targetvalidatie in onderzoek naar pancreasziekten. Dit protocol pakt de uitdaging aan om fragiele acinaire en andere pancreasceltypen terug te winnen, waardoor hoogwaardige input mogelijk wordt voor daaropvolgende moleculaire en cellulaire analyses. De toepasbaarheid op normaal, premaligne en tumorweefsel ondersteunt de translationele continuïteit en de risico-gecorrigeerde vooruitgang van het portfolio.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar celtype-specifieke signaalpaden bij de progressie van pancreasziekten mogelijk.
- Ondersteunt de functionele validatie van targets in zowel gezonde als zieke weefselcontexten.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door het leveren van single-cell suspensies met een hoge levensvatbaarheid voor moleculaire profilering.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt gevalideerde single-cell preparaties voor kwantitatieve downstream assays zoals flowcytometrie en single-cell RNA-sequencing.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van assays door celdood en contaminatie door proteasen en RNasen te minimaliseren.
- Maakt schaalbare preparatie van primaire cellen mogelijk voor compound screening en fenotypische assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt de ontwikkeling van ziekterelevante modellen door het isoleren van cellen uit premaligne en tumorweefsels.
- Maakt de ontdekking en validatie van biomarkers mogelijk door middel van transcriptomische analyse van enkelcellen van hoge kwaliteit.
- Faciliteert het onderzoek naar interacties in de tumormicro-omgeving door het terugwinnen van stromale en immuuncellen naast acinaire cellen.
Integratie van pipeline & workflow
Dit protocol bevindt zich op het snijvlak van weefselwerving en single-cell analyse, en slaat hiermee een brug tussen vroege ontdekkingen en translationeel onderzoek naar pancreasaandoeningen.
- Discovery Biology: Levert hoogwaardige enkelvoudige cellen voor hypothesetoetsing en pathway-analyse.
- Screening: Levert reproduceerbare, levensvatbare celsuspensies voor assayontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve readouts mogelijk, zoals cellevensvatbaarheid, celtypecompositie en transcriptomische profilering.
- Translationeel Onderzoek: Sluit aan bij inspanningen voor biomarker- en targetvalidatie in ziekterelateerde systemen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is aan verschillende toestanden van pancreasweefsel en onderzoeksdoelstellingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid van target- en biomarkerstudies door cellevensvatbaarheid en -integriteit te waarborgen.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de weefselverwerking met reproduceerbare, schaalbare stappen die geschikt zijn voor standaardisatie tussen verschillende studies.
- Strategische waarde: Vermindert biologische risico's en ondersteunt gefundeerde go/no-go beslissingen in vroege stadia van pancreasonderzoek.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van targets en modellen mogelijk voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking en technieken voor dissociatie van enkelcellen.
- Toegang tot instrumenten voor het beoordelen van celviabiliteit en flowcytometrie- of single-cell sequencing-platforms is noodzakelijk.
- Strikte naleving van timing en temperatuurcontroles is vereist om de celviabiliteit te behouden.
- Aanpasbaar aan diverse typen pancreasweefsel, waaronder normale, premaligne en tumorale monsters.
- Viabiliteitsdrempels en het herstel van celtypen moeten routinematig worden gemonitord om de consistentie van het protocol te waarborgen.
