Name: Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Leer de generatie en toepassing van runder monocyten-afgeleide dendritische cellen voor het evalueren van vaccinimmunogeniciteit in vitro. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor veeartsenijkundig vaccinonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Eveline Wodak en Dr. Angelika Loistch (AGES) voor hun steun bij het bepalen van de gezondheidsstatus van de dieren en voor het verstrekken van BTV, Dr. Bernhard Reinelt voor het verstrekken van runderbloed en Dr. Bharani Settypalli en Dr. William Dundon van de IAEA voor nuttig advies over respectievelijk de real-time PCR-experimenten en taalbewerking.

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Deze studie toont een gestandaardiseerde in vitro methode voor het genereren en fenotyperen van boviene MoDC's en hun daaropvolgende gebruik bij het meten van de vaccinimmunogeniciteit van een commercieel vaccin (bijv. RV). Runder-MoDC's kunnen worden gebruikt als een hulpmiddel voor het screenen van potentiële vaccinantigenen tegen veeziekten en het voorspellen van hun potentiële klinische impact op basis van immuunresponsen voordat wordt overgegaan tot in vivo dierproeven. De gegenereerde MoDC's werde...

Veterinaire vaccinatie is een cruciaal aspect van de veehouderij en gezondheid, omdat het bijdraagt aan het verbeteren van de voedselzekerheid en het dierenwelzijn door bescherming te bieden tegen ziekten die de veehouderij wereldwijd treffen1. Een effectieve in vitro methode om de immunogeniciteit van mogelijke vaccinkandidaten te beoordelen, zou het proces van vaccinontwikkeling en -productie helpen versnellen. Het is daarom noodzakelijk om het veld van immuuntesten uit te breiden met innovatieve methodologieën op basis van in vitro studies, omdat dit zou helpen om de complexiteit van de immuunprocessen met betrekking tot immunisatie en pathogene infectie te onthullen. Momenteel worden in vivo immunisatie- en challengestudies bij dieren, die periodieke bemonstering vereisen (bijv. Bloed en milt), gebruikt om de immunogeniciteit van kandidaat-vaccins en adjuvantia te meten. Deze testen zijn duur, tijdrovend en hebben ethische implicaties, omdat in de meeste gevallen euthanasie bij dieren wordt uitgevoerd aan het einde van de proeven.
Als alternatief voor in vivo assays zijn perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) gebruikt om vaccin-geïnduceerde immuunresponsen in vitrote evalueren 2. PBMC's zijn een heterogene populatie van cellen die bestaat uit 70% -90% lymfocyten, 10% -20% monocyten en een beperkt aantal dendritische cellen (DC's, 1% -2%)3. PBMC's herbergen antigeen-presenterende cellen (APC's) zoals B-cellen, monocyten en DC's, die voortdurend patrouilleren in het organisme op zoek naar tekenen van infectie of weefselbeschadiging. Lokaal uitgescheiden chemokines vergemakkelijken de rekrutering en activering van APC's naar deze plaatsen door zich te binden aan celoppervlakreceptoren. In het geval van monocyten richten chemokines hun lot om te differentiëren in DC's of macrofagen4. Zodra DC's een pathogeen tegenkomen en vangen, migreren ze naar secundaire lymfoïde organen, waar ze de verwerkte pathogene peptide-antigenen kunnen presenteren met behulp van major histocompatibility complex (MHC) klasse I of klasse II oppervlakte-eiwitten aan respectievelijk CD8 + T-cellen of CD4 + T-cellen, waardoor een immuunrespons 5,6 wordt geactiveerd.
De sleutelrol die DC's spelen bij het orkestreren van een beschermende immuunrespons tegen verschillende pathogenen maakt ze een interessant onderzoeksdoel voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, vooral bij het ontwerpen van vaccins en adjuvantia tegen infectieuze agentia7. Aangezien de fractie van DC's die kan worden verkregen uit PBMC's vrij klein is (1%-2%), zijn monocyten in plaats daarvan gebruikt om DC's in vitro8 te genereren. Deze van monocyten afgeleide DC's (MoDC's) werden aanvankelijk ontwikkeld als een mogelijke behandelingsstrategie in kankerimmunotherapie9. Meer recent zijn MoDC's gebruikt voor vaccinonderzoek 10,11,12, en klassieke monocyten zijn het overheersende subtype (89%) voor MoDC-productie 13. De productie van MoDC's in vitro is eerder bereikt door de toevoeging van granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) gegeven in combinatie met andere cytokines zoals interleukine-4 (IL-4), tumornecrosefactor α (TNF-α) of IL-1314,15,16.
Het succes van een in vitro MoDC-test is afhankelijk van het vermogen van antigeen-gestimuleerde volwassen MoDC's om de omvang en het type van de immuunrespons te moduleren die specifiek zijn voor het type antigeen dat is gedetecteerd17. Het type pathogeen dat door MoDC's wordt herkend en gepresenteerd, bepaalt de differentiatie van CD4 + T-helper (Th) -cellen in Th1-, Th2- of Th17-effectorcellen en wordt gekenmerkt door een pathogeenspecifiek secretoir cytokineprofiel. Een Th1-respons wordt opgewekt tegen intracellulaire pathogenen en resulteert in de secretie van interferon-gamma (IFN-γ) en tumornecrosefactor bèta (TNF-β), die fagocytisch-afhankelijke bescherming moduleert. Een Th2-respons wordt geactiveerd tegen parasitaire organismen en wordt gekenmerkt door IL-4, IL-5, IL-10 en IL-13-secretie, die fagocytisch-onafhankelijke humorale bescherming initieert. Th17 biedt neutrofielafhankelijke bescherming tegen extracellulaire bacteriële en schimmelinfecties gemedieerd door de secretie van IL-17, IL-17F, IL-6, IL-22 en TNF-α 18,19,20,21. Op basis van eerdere studies is opgemerkt dat niet alle pathogenen binnen het verwachte cytokineprofiel vallen. Dermale MoDC's stimuleren bijvoorbeeld, als reactie op leishmania parasitaire infectie, IFN-γ secretie van CD4 + T-cellen en CD8 + T-cellen, waardoor een beschermende pro-inflammatoire Th1-respons wordt geïnduceerd22.
Het is ook aangetoond dat MoDC's bij kippen die zijn geprimed met Salmonella lipopolysaccharide (LPS), een variabele respons tegen Salmonella typhimurium kunnen induceren door zowel Th1- als Th2-responsen te activeren, terwijl Salmonella gallinarum alleen een Th2-respons induceert, wat de hogere weerstand van de laatste tegen MoDC-klaring23 zou kunnen verklaren. De activering van MoDC's tegen Brucella canis (B. canis) is ook gemeld in zowel honden- als menselijke MoDC's, wat betekent dat dit een zoönotisch infectiemechanisme kan vertegenwoordigen24. Menselijke MoDC's geprimed met B. canis induceren een sterke Th1-respons die weerstand biedt tegen ernstige infectie, terwijl Canine MoDC's een dominante Th17-respons induceren met een verminderde Th1-respons, wat vervolgens leidt tot de oprichting van chronische infectie25. Runder-MoDC's vertonen een verhoogde affiniteit voor mond- en klauwzeervirus (FMDV) geconjugeerd met immunoglobuline G (IgG) in vergelijking met niet-geconjugeerde FMDV alleen, aangezien de MoDC's een viraal antilichaamcomplex vormen als reactie op de eerste10. Samen laten deze studies zien hoe MoDC's zijn gebruikt om de complexiteit van immuunresponsen tijdens pathogene infectie te analyseren. De adaptieve immuunresponsen kunnen worden geëvalueerd door de kwantificering van specifieke markers geassocieerd met lymfocytenproliferatie. Ki-67, een intracellulair eiwit dat alleen in delende cellen wordt gedetecteerd, wordt beschouwd als een betrouwbare marker voor proliferatiestudies26, en evenzo komt CD25 uitgedrukt op het oppervlak van T-cellen tijdens de late fase van activering overeen met lymfocytenproliferatie27,28.
Deze studie toont een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van runder-MoDC's, gevolgd door hun toepassing in een in vitro immuuntest die wordt gebruikt voor het testen van de immunogeniciteit van vaccins. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin (RV) werd gebruikt om de werkzaamheid van deze test te valideren. T-lymfocytenactivatie en -proliferatie werden gemeten door flowcytometrie, real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) door de analyse van gevestigde celactivatiemarkers zoals Ki-67 en CD25 en de secretie van IFN-γ 28,29,30,31. Er worden geen dier- of menselijke experimentele proeven uitgevoerd tijdens de MoDC-test.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>A1049201</td><td>Ammonium-Chloride-Potassium buffer voor lysis van resterende RBC's in geoogste PBMC fractie</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Heparine Tubes</td><td>Becton, Dickinson (BD) and Company</td><td>366480</td><td>10 mL, additief natriumheparine 158 USP eenheden, glazen buis, 16 x 100 mm formaat</td></tr><tr><td>Bovine Dendritic Cell Growth Kit</td><td>Bio-Rad, UK</td><td>PBP015KZZ</td><td>Cytokine cocktail bestaande uit recombinant bovien IL-4 en GM-CSF</td></tr><tr><td>Bovine IFN-&gamma; ELISA Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA5638KZZ</td><td>Kit voor het meten van IFN-&gamma; expressie in cultuursupernatant</td></tr><tr><td>CD14 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2678F</td><td>Muis anti-bovens CD14 monoklonaal antilichaam, klon CC-G33, isotype IgG1</td></tr><tr><td>CD25 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2430PE</td><td>Muis anti bovien CD25 monoklonaal antilichaam, klon IL-A11, isotype IgG1</td></tr><tr><td>CD4 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1653A647</td><td>Muis anti bovien CD4 monoklonaal antilichaam, klon CC8, isotype IgG2a</td></tr><tr><td>CD40 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2431F</td><td>Muis anti-bovens CD40 monoklonaal antilichaam, klon IL-A156, isotype IgG1</td></tr><tr><td>CD8 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA837F</td><td>Muis anti bovien CD8 monoklonaal antilichaam, klon CC63, isotype IgG2a</td></tr><tr><td>CD86 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2437PE</td><td>Muis anti-bovens CD86 monoklonaal antilichaam, klon IL-A190, isotype IgG1</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>-</td><td>Thermische cyclus PCR machine</td></tr><tr><td>Corning Centrifuge Tube</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352096 &amp; 352070</td><td>15 mL en 50 mL, hoge helderheid polypropyleen conische bodem, gegradueerd, sterieel, schroefdop, falcon buis</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Plus</td><td>BD Bio Sciences</td><td>555028</td><td>Fixatie/permeabilisatie kit met BD golgiPlug, gebruikt voor flow cytometer celkleuring</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1009832500</td><td>Absoluut voor analyse EMSURE&nbsp;ACS,ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Fetaal bovien Serum (FBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10500064</td><td>Gekwalificeerd, warmte geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Ficoll Plaque PLUS</td><td>GE Health care Life Sciences, USA</td><td>341691</td><td>Lymfocyte-isolatie medium</td></tr><tr><td>FlowClean Reinigingsmiddel</td><td>Beckman Coulter, Life Sciences</td><td>A64669</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, Becton, Dickinson (BD) and Company, LLC, USA</td><td>-</td><td>Flow cytometer Histogram software</td></tr><tr><td>FlowTubes/ FACS&nbsp; (Fluorescentie-geactiveerde single-cel sortering) Buis</td><td>Falcon Corning&nbsp;</td><td>352235</td><td>5 mL, sterieel, ronde bodem polystyreen testbuis met celzeef snap cap, gebruikt in flow cytometrie analyse</td></tr><tr><td>Fluoresceïnisothiocyanaat-Dextran</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>60842-46-8</td><td>FITC-dextran MW</td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>-</td><td>Flow cytometer machine</td></tr><tr><td>Hard-Shell 96-Well PCR Plates</td><td>Bio-Rad</td><td>HSP9601</td><td>96 well, laag profiel, dunne wand, gerand, wit/helder</td></tr><tr><td>Human CD14 MicroBeads</td><td>Miltenyi Bioteck, Germany</td><td>130-050-201</td><td>2 mL microbeads geconjugeerd aan monoklonaal anti-human CD14 antilichaam isotype IgG2a, gebruikt voor selectie van boviene monocyten uit PBMC's</td></tr><tr><td>Kaluza</td><td>Beckman Coulter, Germany</td><td>-</td><td>Flow cytometer software voor multicolor data analyse</td></tr><tr><td>MACS Column</td><td>Miltenyi Bioteck, Germany</td><td>130-042-401</td><td>Magneet geactiveerde cel sortering of immuun magneet scheiding kolom voor scheiding van verschillende CD14 cel populaties op basis van celoppervlakte antigenen</td></tr><tr><td>MHC Klasse II DQ DR Polymorfe Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA2228F</td><td>Muis anti-schapen MHC Klasse II DQ DR Polymorf:FITC, klon 49.1, isotype IgG2a, kruis reactief met bovien</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4325</td><td>1.5 mL, conische bodem, gegradueerd, steriele buis</td></tr><tr><td>Microsoft Power Point</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>De grafische illustraties van experimenteel ontwerp</td></tr><tr><td>Muis IgG1 Negatieve Controle:FITC voor CD14, CD40 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928F</td><td>Isotype controle CD14 en CD40 monoklonaal antilichaam&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis IgG1 Negatieve Controle:PE voor CD86 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Isotype controle CD86 monoklonaal antilichaam&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis IgG1 Negatieve Controle:RPE voor CD25 Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA928PE</td><td>Isotype controle CD25 monoklonaal antilichaam&nbsp;</td></tr><tr><td>Muis IgG2a Negatieve Controle:FITC voor MHC Klasse II Antilichaam</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA929F</td><td>Isotype controle voor MHC klasse II monoklonaal antilichaam&nbsp;</td></tr><tr><td>Nobivac Rabies</td><td>MSD Animal Health, UK</td><td>-</td><td>1 &micro;L/mL van cel gekweekte geïnactiveerde vaccin bevattende > 2 I.U./mL Rabies virus stam</td></tr><tr><td>Optische afdichtingen</td><td>Bi0-Rad</td><td>TCS0803</td><td>0.2 mL platte PCR buis 8-cap strips, optisch, ultrahelder, compatibel voor qPCR machine</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Saline (PBS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td>pH 7.4, 1x concentratie</td></tr><tr><td>Prism - GraphPad 5 Software&nbsp;</td><td>Dotmatics</td><td>-</td><td>Statistisch software</td></tr><tr><td>Gezuiverde Anti-mens Ki-67 antilichaam</td><td>Biolegend, USA</td><td>350501</td><td>Monoklonaal antilichaam, kruis reactief met koe, klon ki-67</td></tr><tr><td>Gezuiverde Muis IgG1 k Isotype Ctrl Antilich

bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritische cellen (DC's) zijn de krachtigste antigeen-presenterende cellen (APC's) binnen het immuunsysteem. Ze patrouilleren in het organisme op zoek naar ziekteverwekkers en spelen een unieke rol binnen het immuunsysteem door de aangeboren en adaptieve immuunresponsen te koppelen. Deze cellen kunnen fagocytiseren en vervolgens gevangen antigenen presenteren aan effector-immuuncellen, waardoor een breed scala aan immuunresponsen wordt geactiveerd. Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor de in vitro generatie van van runderen monocyten-afgeleide dendritische cellen (MoDC's) geïsoleerd uit perifere bloedmononucleaire cellen van runderen (PBMC's) en hun toepassing bij het evalueren van vaccinimmunogeniciteit.
Magnetische celsortering werd gebruikt om CD14+ monocyten uit PBMC's te isoleren, en de suppletie van compleet kweekmedium met interleukine (IL)-4 en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor (GM-CSF) werd gebruikt om de differentiatie van CD14+ monocyten in naïeve MoDC's te induceren. De generatie van onrijpe MoDC's werd bevestigd door het detecteren van de expressie van belangrijke histocompatibiliteitscomplex II (MHC II), CD86 en CD40 celoppervlakmarkers. Een in de handel verkrijgbaar rabiësvaccin werd gebruikt om de onrijpe MoDC's te pulseren, die vervolgens samen met naïeve lymfocyten werden gekweekt.
De flowcytometrie-analyse van de antigeen-gepulseerde MoDC's en lymfocytenco-cultuur onthulde de stimulatie van T-lymfocytenproliferatie door de expressie van Ki-67-, CD25-, CD4- en CD8-markers. De analyse van de mRNA-expressie van IFN-γ en Ki-67, met behulp van kwantitatieve PCR, toonde aan dat de MoDC's de antigeenspecifieke priming van lymfocyten in dit in vitro co-cultuursysteem konden induceren. Bovendien toonde IFN-γ secretie beoordeeld met behulp van ELISA een significant hogere titer (**p < 0,01) in de rabiësvaccin-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur dan in de niet-antigeen-gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur. Deze resultaten tonen de validiteit van deze in vitro MoDC-test om vaccinimmunogeniciteit te meten, wat betekent dat deze test kan worden gebruikt om potentiële vaccinkandidaten voor runderen te identificeren voordat wordt overgegaan tot in vivo onderzoeken, evenals in vaccinimmunogeniciteitsbeoordelingen van commerciële vaccins.

Deze methodologie beschrijft de in vitro generatie van runder-MoDC's voor de evaluatie van kandidaat-vaccinantigenen voorafgaand aan het uitvoeren van in vivo studies. Figuur 1 illustreert het experimentele schema van de productie van MoDC's bij runderen en de toepassing van de MoDC's voor de in vitro test. Met behulp van de magnetische celsorteertechniek was het mogelijk om ongeveer 26 miljoen CD14+ myocyten te verzamelen uit de geoogste PBMC's, die eer...

De methodologie beschrijft de generatie van van boviene monocyten afgeleide dendritische cellen (MoDC's) en hun toepassing voor de in vitro evaluatie van antigene kandidaten tijdens de ontwikkeling van potentiële veterinaire vaccins bij runderen.

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

Dit protocol vertegenwoordigt een functionele in vitro test met behulp van van rundermonocyten afgeleide dendritische cellen om de immunogeniciteit van het vaccin te meten voorafgaand aan in vivo studies. Daarom wordt een bestaande leemte in de veevaccinatie opgevuld. Het is het genereren en toepassen van dendritische cellen.Als de krachtigste antigeen-presenterende cellen zijn dendritische cellen een belangrijk onderzoeksdoel geworden voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, waaronder de werkzaamheid van vaccins. Deze test kan worden geïmplementeerd als een hulpmiddel voor het screenen van vaccinkandidaten, als een kwaliteitscontrolestaat voor vaccinproductie en voor antigeen- en adjuvansselectie. Richard Kangethe, wetenschapper in het laboratorium voor dierlijke productie en gezondheid, zal de procedure demonstreren.Begin met het omkeren en mengen van het bloed verkregen uit de halsaderpunctie van het kalf met gehepariniseerde vacutainers. Breng vervolgens 20 milliliter gehepariniseerd bloed over naar een steriele buis van 50 milliliter en verdun deze met 10 milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS. Pipetteer 15 milliliter lymfocytenisolatiemedium tot een steriele buis van 50 milliliter en kantel de buis in een positie van 45 graden.Leg voorzichtig 30 milliliter bloed PBS-medium op de lymfocytenisolatie met behulp van een pipet van 25 milliliter en breng de buis langzaam terug naar een verticale positie voordat u deze centrifugeert. Verzamel vervolgens de dunne witte laag perifere bloedmononucleaire cellen of PBMC-laag met behulp van een Pasteur-pipet en breng deze over in een nieuwe buis van 50 milliliter. Was de geoogste PBMC's twee keer met 40 milliliter PBS per wasbeurt en meng deze grondig.Na het centrifugeren, resuspendien de pellet in 15 milliliter ammoniumchloride kaliumbuffer of ACK-buffer. Voeg na 10 tot 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur tot 40 milliliter PBS toe en centrifugeer de buis met maximale versnelling en vertraging. Resuspendie van de pellet in 10 milliliter volledig kweekmedium.Voeg vervolgens vijf microliter CD14 MicroBead-buffer per 10 miljoen cellen toe en meng grondig met behulp van een pipet. Voeg voor flowcytometrie-analyse 10 microliter CD14-fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC-kleuringsantilichaam toe aan de PBMC's en incuber het gedurende 15 minuten bij vier tot acht graden Celsius voordat u doorgaat met de flowcytometrie. Voeg aan de niet-gekleurde PBMC's een milliliter faxbuffer toe en centrifugeer deze gedurende zeven minuten bij 500 g en vier graden Celsius.Suspensie de pellet vervolgens in 500 microliter faxbuffer per 100 miljoen cellen. Steek vervolgens de immunomagnetische celscheidingskolom in de separator en plaats een opvangbuis van 50 milliliter onder de kolomuitlaat voor het opvangen van de doorstroom. Na het wassen van de kolom met één milliliter ontgaste faxbuffer, vervangt u de gebruikte buis van 15 milliliter door een nieuwe.Pipetteer honderd miljoen cellen in 500 microliter buffer per keer waardoor de celsuspensie door de kolom kan gaan. Spoel de kolom vervolgens drie keer af met telkens drie milliliter ontgaste faxbuffer. Na het verzamelen van de doorstroming, label de eerste geëlueerde naïeve lymfocytenfractie als de CD14 negatieve celfractie.Verwijder de kolom uit de separator en plaats een nieuwe steriele buis van 15 milliliter onder de kolom voor de effluentopvang. Voeg vijf milliliter faxbuffer toe aan de kolom en duw deze er onmiddellijk doorheen met behulp van de zuiger. Verzamel en label de tweede doorstroom of de naïeve monocytenfractie als de CD14-positieve celfractie.Voeg een compleet kweekmedium toe aan de geoogste CD14-positieve monocyten om 1 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Voeg vervolgens een milliliter celsuspensie toe aan elke put van een steriele 24-putplaat voordat u elke put aanvult met 40 microliter van de cytokinecocktail die in de kit wordt geleverd. Breng op dag twee de helft van de inhoud van elke put over naar afzonderlijke buizen van 1,5 milliliter met behulp van een pipet.Nadat u de buizen van 1,5 milliliter gedurende zeven minuten op 500 g hebt gecentrifugeerd, gooit u het supernatant weg en resuspenseert u de pellet in 500 microliter vers volledig kweekmedium. Breng 500 microliter van deze geresuspendeerde celsuspensie terug naar de overeenkomstige putten, zodat het uiteindelijke volume in de put één milliliter wordt. Verrijk elke put met 20 microliter cytokinecocktail.Om antigeen-gepulseerde MoDC's te genereren, voegt u één microliter per milliliter rabiësvirusvaccin of RV-suspensie toe aan één milliliter naïeve MoDC-cultuur in de 24-wellplaat en incubeert u de plaat gedurende 48 uur bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Houd op dag zeven de 24-well-plaat met de antigeen-gepulseerde MoDC's gedurende 10 minuten op ijs voordat u een milliliter ijskoude PBS per put toevoegt en deze grondig mengt. Breng de suspensie over in een buis van 15 milliliter.Was de putjes met twee milliliter ijskoude PBS. Verzamel de resterende cellen in elke put en breng de gewassen inhoud over in hun respectieve buizen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende zeven minuten op 500 g.Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de antigeen-gepulseerde MoDCs-celpellet in een compleet kweekmedium om de uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter aan te passen. Voor MoDC-lymfocytencocultuur zaait u de putjes van een steriele 24-putplaat met één milliliter van de naïeve lymfocytencelsuspensie en één milliliter antigeen-gepulseerde of niet-antigeen-gepulseerde MoDC-suspensie op de zevende dag van de antigeenpuls. Na twee dagen incubatie, vul elke put aan met 20 nanogram per milliliter recombinant interleukine-2 en zet de incubatie nog eens 120 uur voort.Breng op dag 14 een milliliter van de co-cultuur over in een steriele buis van 1,5 milliliter en centrifugeer de buis. Vervolgens resuspendeerde de celpellet met één milliliter antigeengepulseerde of niet-gepulste MoDC's. Meng goed en breng de celsuspensies over naar de bijbehorende putjes.Na celoppervlakkleuring van de PBMC's en naïeve lymfocyten en monocyten, breng een milliliter van de celsuspensie over naar een steriele buis van 1,5 milliliter met behulp van een pipet en centrifuge gedurende 10 minuten bij 500 g. Breng de pellet vervolgens terug in één milliliter PBS en breng deze over in een buis van 15 milliliter. Verzamel ook de resterende cellen en de bijbehorende buizen met behulp van één milliliter PBS.Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe aan de buis van 15 milliliter met de cellen en meng door pipetteren. Na het centrifugeren van de buis gedurende zeven minuten bij 850 g, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de celkorrel voorzichtig met resterende suspensie die overblijft na het decanteren van het supernatant. Breng de celophanging over op een V-bodem 96-putplaat en sluit de putten af om morsen te voorkomen.Zodra de kleuring is voltooid, voert u de flowcytometeranalyse uit. Pas vanuit de realtime preview de drempel van fluorescentie aan, inclusief spanning en versterking en celgrootte om uiteindelijk poorten rond de gewenste celpopulatie te tekenen terwijl cellulair puin wordt uitgesloten. CD14-celkleuring en flowcytometrie toonden aan dat de naïeve monocytenfractie voor 98% CD14-positieve monocytencellen bestond en functioneel in staat was tot antigeenopname.De naïeve MoDC's fenotypisch gekenmerkt door het beoordelen van de expressie van MHC Klasse 2 en co-stimulerende CD86 en CD40 celoppervlak markers valideerden de dendritische cellen of DC-achtig fenotype. Tijdens de MoDC-lymfocytencocultuur op dag negen werd een morfologische verandering waargenomen die dendrietuitbreiding liet zien in de RV-puls naar MoDC's. Vergeleken met de niet-gepulseerde MoDC-lymfocytencultuur werd een significante toename van lymfocytenproliferatie aangetoond door de upregulatie van de Ki67- en CD25-activeringsmarkers op de CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen op dag 16 in de gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur.De CD8-positieve T-cellen uit de volwassen RV-gepulseerde MoDC-coculturen vertoonden een achtvoudige upregulatie van Ki67 in vergelijking met de niet-specifieke groep. De CD4-positieve cellen in dezelfde co-cultuur vertoonden een zevenvoudige toename van Ki67 in vergelijking met controles, wat het vermogen van RV-geprimeerde MoDC's aantoont om het RV-antigeen aan naïeve lymfocyten te presenteren en ze in een in vitro toestand te activeren. De qPCR-kwantificering van coculturen toonde meer dan 30% toename in interferon gamma-expressie en meer dan 5% toename in Ki67-expressie in alle co-culturen die GAPDH als kalibrator gebruikten.Een significant hogere concentratie van uitgescheiden interferon gamma werd waargenomen in de RV gepulseerde MoDC lymfocyt co-cultuur in vergelijking met de niet-specifieke behandelingsgroep. Voer de gelaagdheidsstap zeer langzaam en voorzichtig uit en zorg ervoor dat er bloed op het lymfocytenisolatiemedium wordt gelegd. Wees extra voorzichtig om alle PBMC's te verzamelen zonder te veel materiaal van de andere lagen te verzamelen.Andere methoden zoals flowcytometrie, ELISA en kwantitatieve PCR, onder andere, kunnen na deze procedure worden toegepast om de activering van immuunmarkers te evalueren.

determination-vaccine-immunogenicity-using-bovine-monocyte-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a monocyte-derived dendritic cell, MoDC-based assay to measure the immunogenicity of commercially available vaccines. MoDC assays investigate dendritic cell responses to antigens, pathogens, or treatments and can provide insights into immune responses, vaccine development, and immunotherapy research.

A Vaccine-Pulsed Dendritic Cell-Based In Vitro Assay to Induce Lymphocyte Proliferation

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

Lange-termijn gekweekte interferon-γ enzymgebonden immunospot assay wordt gebruikt als maat voor centraal geheugen responsen en correleert met beschermende anti-mycobacteriële vaccinresponsen. Met deze assay worden perifeer bloed mononucléaire cellen gestimuleerd met mycobacteriële antigenen en interleukine-2 voor 14 dagen, waardoor differentiatie en expansie van centrale geheugen T-cellen.

Toepassing van Lange-termijn gekweekte interferon-γ Enzyme-linked immunospot Assay voor het beoordelen van effector en geheugen T cel responsen in Vee

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Een nieuwe techniek voor snelle antigeen weergave op een bacteriële oppervlak wordt gepresenteerd, waarbij het oppervlak biotinylation gevolgd door blootstelling aan proteïnen van belang in fusie met monomere avidin. Laden van BCG met geselecteerde antigenen met succes verbetert de immunogeniciteit, suggereren dat oppervlakte decoratie traditionele genetische benaderingen kan vervangen.

Expressie van exogene antigenen in de Mycobacterium bovis -BCG-vaccin via niet-genetische oppervlak decoratie met het systeem Avidin-Biotine

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Experimentele procedures voor de verdere winning van lymfatische weefsels voor het testen van lymfoïde dendritische cel activatie worden beschreven na behandeling van een immuniteitsverhoging nanomateriaal.

Immunostimulerende Agent evaluatie: Lymfoïde weefsel extractie en injectie Route-afhankelijke dendritische cel activeren

We beschrijven een protocol voor de chemische conjugatie van het modelantigeen ovalbumine naar een endocytosereceptorspecifiek antilichaam voor in vivo dendritische celtargeting. Het protocol omvat zuivering van het antilichaam, chemische conjugatie van het antigeen, evenals zuivering van het conjugaat en de verificatie van efficiënte conjugatie.

Chemische conjugatie van een gezuiverd DEC-205-gericht antilichaam met eiwit over de volledige lengte voor het richten van dendritische cellen van muizen in vitro en in vivo

Er wordt een uniek, uitgebreid protocol gepresenteerd voor het genereren van gedesialyleerde humane monocyt-afgeleide dendritische cellen (mo-DC's) uit geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) met behulp van een sialidasebehandeling. Verder worden methoden beschreven om de fenotypische en functionele karakterisering van mo-DC's te beoordelen en te evalueren hoe behandeling met sialidase het rijpingsniveau van mo-DC's verbetert.

Generatie van monocyt-afgeleide dendritische cellen met verschillende gesialyleerde fenotypes

We beschrijven een procedure om het vermogen van farmacologische middelen te beoordelen om tolerogene dendritische cellen te genereren uit naïeve van monocyten afgeleide dendritische cellen in vitro en om hun potentie te valideren door autologe regulerende T-celgeneratie te genereren.

Een eenvoudige en efficiënte methode voor het testen van immunomodulerende middelen voor het genereren van tolerogene dendritische cellen uit menselijke CD14+ -monocyten

Leer de generatie en toepassing van runder monocyten-afgeleide dendritische cellen voor het evalueren van vaccinimmunogeniciteit in vitro. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor veeartsenijkundig vaccinonderzoek.

Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Meer video's verkennen