Bepaling van de immunogeniciteit van het vaccin met behulp van van runderen monocyten afgeleide dendritische cellen

Dit protocol vertegenwoordigt een functionele in vitro test met behulp van van rundermonocyten afgeleide dendritische cellen om de immunogeniciteit van het vaccin te meten voorafgaand aan in vivo studies. Daarom wordt een bestaande leemte in de veevaccinatie opgevuld. Het is het genereren en toepassen van dendritische cellen.

Als de krachtigste antigeen-presenterende cellen zijn dendritische cellen een belangrijk onderzoeksdoel geworden voor het begrijpen van intracellulaire immuunmechanismen, waaronder de werkzaamheid van vaccins. Deze test kan worden geïmplementeerd als een hulpmiddel voor het screenen van vaccinkandidaten, als een kwaliteitscontrolestaat voor vaccinproductie en voor antigeen- en adjuvansselectie. Richard Kangethe, wetenschapper in het laboratorium voor dierlijke productie en gezondheid, zal de procedure demonstreren.

Begin met het omkeren en mengen van het bloed verkregen uit de halsaderpunctie van het kalf met gehepariniseerde vacutainers. Breng vervolgens 20 milliliter gehepariniseerd bloed over naar een steriele buis van 50 milliliter en verdun deze met 10 milliliter fosfaat gebufferde zoutoplossing of PBS. Pipetteer 15 milliliter lymfocytenisolatiemedium tot een steriele buis van 50 milliliter en kantel de buis in een positie van 45 graden.

Leg voorzichtig 30 milliliter bloed PBS-medium op de lymfocytenisolatie met behulp van een pipet van 25 milliliter en breng de buis langzaam terug naar een verticale positie voordat u deze centrifugeert. Verzamel vervolgens de dunne witte laag perifere bloedmononucleaire cellen of PBMC-laag met behulp van een Pasteur-pipet en breng deze over in een nieuwe buis van 50 milliliter. Was de geoogste PBMC's twee keer met 40 milliliter PBS per wasbeurt en meng deze grondig.

Na het centrifugeren, resuspendien de pellet in 15 milliliter ammoniumchloride kaliumbuffer of ACK-buffer. Voeg na 10 tot 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur tot 40 milliliter PBS toe en centrifugeer de buis met maximale versnelling en vertraging. Resuspendie van de pellet in 10 milliliter volledig kweekmedium.

Voeg vervolgens vijf microliter CD14 MicroBead-buffer per 10 miljoen cellen toe en meng grondig met behulp van een pipet. Voeg voor flowcytometrie-analyse 10 microliter CD14-fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC-kleuringsantilichaam toe aan de PBMC's en incuber het gedurende 15 minuten bij vier tot acht graden Celsius voordat u doorgaat met de flowcytometrie. Voeg aan de niet-gekleurde PBMC's een milliliter faxbuffer toe en centrifugeer deze gedurende zeven minuten bij 500 g en vier graden Celsius.

Suspensie de pellet vervolgens in 500 microliter faxbuffer per 100 miljoen cellen. Steek vervolgens de immunomagnetische celscheidingskolom in de separator en plaats een opvangbuis van 50 milliliter onder de kolomuitlaat voor het opvangen van de doorstroom. Na het wassen van de kolom met één milliliter ontgaste faxbuffer, vervangt u de gebruikte buis van 15 milliliter door een nieuwe.

Pipetteer honderd miljoen cellen in 500 microliter buffer per keer waardoor de celsuspensie door de kolom kan gaan. Spoel de kolom vervolgens drie keer af met telkens drie milliliter ontgaste faxbuffer. Na het verzamelen van de doorstroming, label de eerste geëlueerde naïeve lymfocytenfractie als de CD14 negatieve celfractie.

Verwijder de kolom uit de separator en plaats een nieuwe steriele buis van 15 milliliter onder de kolom voor de effluentopvang. Voeg vijf milliliter faxbuffer toe aan de kolom en duw deze er onmiddellijk doorheen met behulp van de zuiger. Verzamel en label de tweede doorstroom of de naïeve monocytenfractie als de CD14-positieve celfractie.

Voeg een compleet kweekmedium toe aan de geoogste CD14-positieve monocyten om 1 miljoen cellen per milliliter te bereiken. Voeg vervolgens een milliliter celsuspensie toe aan elke put van een steriele 24-putplaat voordat u elke put aanvult met 40 microliter van de cytokinecocktail die in de kit wordt geleverd. Breng op dag twee de helft van de inhoud van elke put over naar afzonderlijke buizen van 1,5 milliliter met behulp van een pipet.

Nadat u de buizen van 1,5 milliliter gedurende zeven minuten op 500 g hebt gecentrifugeerd, gooit u het supernatant weg en resuspenseert u de pellet in 500 microliter vers volledig kweekmedium. Breng 500 microliter van deze geresuspendeerde celsuspensie terug naar de overeenkomstige putten, zodat het uiteindelijke volume in de put één milliliter wordt. Verrijk elke put met 20 microliter cytokinecocktail.

Om antigeen-gepulseerde MoDC's te genereren, voegt u één microliter per milliliter rabiësvirusvaccin of RV-suspensie toe aan één milliliter naïeve MoDC-cultuur in de 24-wellplaat en incubeert u de plaat gedurende 48 uur bij 5% koolstofdioxide en 37 graden Celsius. Houd op dag zeven de 24-well-plaat met de antigeen-gepulseerde MoDC's gedurende 10 minuten op ijs voordat u een milliliter ijskoude PBS per put toevoegt en deze grondig mengt. Breng de suspensie over in een buis van 15 milliliter.

Was de putjes met twee milliliter ijskoude PBS. Verzamel de resterende cellen in elke put en breng de gewassen inhoud over in hun respectieve buizen. Centrifugeer de celsuspensie gedurende zeven minuten op 500 g.

Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de antigeen-gepulseerde MoDCs-celpellet in een compleet kweekmedium om de uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter aan te passen. Voor MoDC-lymfocytencocultuur zaait u de putjes van een steriele 24-putplaat met één milliliter van de naïeve lymfocytencelsuspensie en één milliliter antigeen-gepulseerde of niet-antigeen-gepulseerde MoDC-suspensie op de zevende dag van de antigeenpuls. Na twee dagen incubatie, vul elke put aan met 20 nanogram per milliliter recombinant interleukine-2 en zet de incubatie nog eens 120 uur voort.

Breng op dag 14 een milliliter van de co-cultuur over in een steriele buis van 1,5 milliliter en centrifugeer de buis. Vervolgens resuspendeerde de celpellet met één milliliter antigeengepulseerde of niet-gepulste MoDC's. Meng goed en breng de celsuspensies over naar de bijbehorende putjes.

Na celoppervlakkleuring van de PBMC's en naïeve lymfocyten en monocyten, breng een milliliter van de celsuspensie over naar een steriele buis van 1,5 milliliter met behulp van een pipet en centrifuge gedurende 10 minuten bij 500 g. Breng de pellet vervolgens terug in één milliliter PBS en breng deze over in een buis van 15 milliliter. Verzamel ook de resterende cellen en de bijbehorende buizen met behulp van één milliliter PBS.

Voeg vervolgens 10 milliliter PBS toe aan de buis van 15 milliliter met de cellen en meng door pipetteren. Na het centrifugeren van de buis gedurende zeven minuten bij 850 g, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de celkorrel voorzichtig met resterende suspensie die overblijft na het decanteren van het supernatant. Breng de celophanging over op een V-bodem 96-putplaat en sluit de putten af om morsen te voorkomen.

Zodra de kleuring is voltooid, voert u de flowcytometeranalyse uit. Pas vanuit de realtime preview de drempel van fluorescentie aan, inclusief spanning en versterking en celgrootte om uiteindelijk poorten rond de gewenste celpopulatie te tekenen terwijl cellulair puin wordt uitgesloten. CD14-celkleuring en flowcytometrie toonden aan dat de naïeve monocytenfractie voor 98% CD14-positieve monocytencellen bestond en functioneel in staat was tot antigeenopname.

De naïeve MoDC's fenotypisch gekenmerkt door het beoordelen van de expressie van MHC Klasse 2 en co-stimulerende CD86 en CD40 celoppervlak markers valideerden de dendritische cellen of DC-achtig fenotype. Tijdens de MoDC-lymfocytencocultuur op dag negen werd een morfologische verandering waargenomen die dendrietuitbreiding liet zien in de RV-puls naar MoDC's. Vergeleken met de niet-gepulseerde MoDC-lymfocytencultuur werd een significante toename van lymfocytenproliferatie aangetoond door de upregulatie van de Ki67- en CD25-activeringsmarkers op de CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen op dag 16 in de gepulseerde MoDC-lymfocytencocultuur.

De CD8-positieve T-cellen uit de volwassen RV-gepulseerde MoDC-coculturen vertoonden een achtvoudige upregulatie van Ki67 in vergelijking met de niet-specifieke groep. De CD4-positieve cellen in dezelfde co-cultuur vertoonden een zevenvoudige toename van Ki67 in vergelijking met controles, wat het vermogen van RV-geprimeerde MoDC's aantoont om het RV-antigeen aan naïeve lymfocyten te presenteren en ze in een in vitro toestand te activeren. De qPCR-kwantificering van coculturen toonde meer dan 30% toename in interferon gamma-expressie en meer dan 5% toename in Ki67-expressie in alle co-culturen die GAPDH als kalibrator gebruikten.

Een significant hogere concentratie van uitgescheiden interferon gamma werd waargenomen in de RV gepulseerde MoDC lymfocyt co-cultuur in vergelijking met de niet-specifieke behandelingsgroep. Voer de gelaagdheidsstap zeer langzaam en voorzichtig uit en zorg ervoor dat er bloed op het lymfocytenisolatiemedium wordt gelegd. Wees extra voorzichtig om alle PBMC's te verzamelen zonder te veel materiaal van de andere lagen te verzamelen.

Andere methoden zoals flowcytometrie, ELISA en kwantitatieve PCR, onder andere, kunnen na deze procedure worden toegepast om de activering van immuunmarkers te evalueren.