Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur

Dit is een niet-invasieve hydroponische methode om de architectuur van het wortelsysteem te meten met behulp van routinematige laboratoriumapparatuur. Dit protocol maakt de volledige visualisatie van het gehele wortelstelsel van de plant mogelijk door het handmatig te verspreiden. Een van de belangrijkste voordelen van de RSA-analyse is dat het mogelijk is om het wortelstelsel van planten te bestuderen zonder dat dit ongewenste elementaire besmetting kan veroorzaken.

Deze methode kan de directe omgevingsinteractie registreren, inclusief hormonale, voedings- en klimatologische omstandigheden met de RSA van plantensystemen. Begin met de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden door een klein schepje van ongeveer 100 zaden in gedestilleerd water bij kamertemperatuur te weken. Centrifugeer na 30 minuten de zaden kort op 500 G gedurende vijf seconden met behulp van een tafelcentrifuge.

Decanteer vervolgens het water en voeg 700 microliter 70% ethanol toe voordat je de buis een paar seconden vortext. Centrifugeer de zaden opnieuw. Herhaal indien nodig vortexing en centrifugatie, waarbij u ervoor zorgt dat de behandeling met 70% ethanol niet langer duurt dan drie minuten.

Spoel de zaden na drie minuten onmiddellijk af met steriel water. Behandel vervolgens de zaden met verdund commercieel bleekmiddel met een druppel TWEEN 20 gedurende zeven minuten. Meng de zaden met bleekoplossing door de buisjes acht tot 12 keer snel om te keren.

Na een korte centrifugatie decanteer je het supernatant met een pipet van één milliliter en spoel je de zaden minstens vijf keer af met steriel water, volgens dezelfde vortexingprocedure. Laat de oppervlakte gesteriliseerde zaden in water en incubeer ze gedurende twee tot drie dagen bij vier graden Celsius voor stratificatie. Autoclaaf de standaard magenta doos half gevuld met gedestilleerd water.

Snijd de geautoclaveerde polycarbonaatplaat in rechthoeken van vier bij acht centimeter met een middelpunt dat meer dan halverwege de rechthoek is ingekerfd, zodat twee rechthoeken samen kunnen glijden om een X-vorm te vormen. Gebruik deze opstelling om het polypropyleengaas van 250 micrometer poriegrootte vast te houden dat in vierkanten van zes bij zes centimeter is gesneden. Voeg in de laminaire luchtstroomkast steriele halve MS-basale media met vitamines plus 1,5% sucrose toe aan elke doos om de onderkant van het polypropyleengaas te bereiken.

Zaai de oppervlakte gesteriliseerde zaden hydroponisch op het gaas en laat ze drie dagen groeien. Breng de zaailingen na drie dagen over op een poriegroot gaas van 500 micrometer en laat ze twee dagen groeien. Breng vervolgens de zaailingen over op de controlemedia en op de experimentele media en laat de zaden zeven dagen groeien.

Voeg 10 tot 20 milliliter gefilterd kraanwater in autoclaaf toe aan de petriplaat. Trek de zaailingen voorzichtig uit het gaas van 500 micrometer. Verspreid met behulp van een ronde kunstkwast plantachtige wortels in de met water gevulde plaat en dompel ze onder in water.

Kantel de plaat iets om het water te verwijderen. Scan of fotografeer deze petriplaten op de juiste manier. Meet de architectuur van het rootsysteem, of RSA-kenmerken, met behulp van vrij beschikbare ImageJ-software en open vervolgens het bestand dat moet worden geanalyseerd.

Nadat u de schaal hebt ingesteld, gebruikt u het gereedschap Rechte lijn om een lijnselectie te maken die de schaalbalk omlijnt. Voltooi het schetsen door met de rechtermuisknop te klikken, te dubbelklikken of te klikken in het vak aan het begin. Om de lengte van de bekende schaalbalk in pixels te meten, klikt u op analyseren, gevolgd door meten op de werkbalk.

Noteer de pixellengte. Open het dialoogvenster Schaal instellen door op het tabblad Schaal instellen op het tabblad Analyseren te klikken. Controleer de pixellengte in de verte in het veld pixels.

Voer vervolgens de waarde van de schaalbalk in het bekende afstandsveld in en stel de lengte-eenheid in op millimeters. Vergrendel de schaal voor deze specifieke afbeelding door op OK te klikken. Gebruik het gereedschap Gesegmenteerde lijn voor een lijnselectie die de wortellengte omlijnt.

Nadat u de omtrek hebt voltooid, past u de lijnselectie aan door op de kleine zwart-witte handgrepen te klikken en deze langs de omtrek te slepen. Selecteer op het tabblad analyseren van ImageJ de opdracht meten en kwantificeer de wortellengte. Breng de gemeten gegevens over naar een spreadsheet door met de rechtermuisknop op het resultatenvenster te klikken, Alles kopiëren te selecteren in het pop-upmenu, over te schakelen naar de spreadsheet en de gegevens te plakken.

Meet voor het meten en berekenen van RSA-kenmerken de primaire wortellengte tussen de hypocotylverbinding en het uiteinde van de wortelpunten. Meet vervolgens de eerste orde laterale wortels, of één graad LR-lengte, en tweede orde laterale wortels, of twee graden LR-lengte. Als u klaar bent, kopieert en plakt u alle metingen in de spreadsheet.

Meet en registreer de vertakkingszone van de primaire wortel, of BZPR, die het eerste opkomende punt van de laterale wortel overspant tot het laatste opkomende punt van de laterale wortel. Noteer ook het aantal zijwortels afkomstig binnen de grens van de BZPR. Meet vervolgens de gemiddelde lengte van de eerste en hogere orde laterale wortels.

Leid de gemiddelde lengte van de primaire laterale wortels af door de totale lengte van de primaire laterale wortels te delen door het totale aantal primaire laterale wortels. Om vervolgens de gemiddelde lengte van de tweede orde laterale wortels te meten, berekent u de gemiddelde lengte van de secundaire laterale wortels door de totale lengte van de secundaire laterale wortels te delen door het totale aantal secundaire laterale wortels. Meet de primaire laterale worteldichtheid door het aantal primaire laterale wortels te delen door de lengte van de BZPR.

Meet vervolgens de vertakkingszone van individuele laterale wortels en bereken de secundaire laterale worteldichtheid door het aantal secundaire laterale wortels te delen door de lengte van de vertakkingszones van tweede orde laterale wortellengtes. Als u klaar bent, meet u de totale wortellengte of TRL. Dit is het totaal van primaire wortels en primaire en secundaire laterale wortellengtes.

Het hydroponische systeem dat in dit experiment werd gebruikt, werkte goed en weerspiegelde het schijnbare contrasterende fenotype onder anorganisch fosfaatdeficiënte en voldoende omstandigheden. Verschillende RSA-eigenschappen werden geanalyseerd onder contrasterende anorganische fosfaatregimes in hydroponische omstandigheden. De anorganische fosfaatdeficiënte behandeling riep een wortelfenotype op dat een kortere, ondiepere en minder vertakte RSA vertoonde, vergeleken met de anorganische fosfaatconditie.

De primaire wortellengte was significant verzwakt onder de anorganische fosfaatdeficiënte toestand. Significante en snelle toename van de primaire wortellengte in de aanwezigheid van 1,25 millimolair anorganisch fosfaat of controlemedia gaf de efficiëntie van het hydroponische systeem aan en weerspiegelde de fysiomorfologische veranderingen adequaat. De vertakkingszone werd aanzienlijk verminderd onder de anorganische fosfaatdeficiënte toestand.

De gemiddelde lengte van de primaire laterale wortel was significant verminderd in de pi-deficiënte toestand. De gemiddelde secundaire laterale wortellengte was op dezelfde manier verminderd als gevolg van de fosfaatdeficiënte toestand, maar het was lager in hoeveelheid dan de gemiddelde primaire laterale wortellengte. Het aantal primaire en secundaire zijwortels nam sterk af onder de fosfaatdeficiënte conditie, vergeleken met de controle, 1,25 millimolar anorganische fosfaatconditie.

De primaire laterale worteldichtheid was niet veranderd onder de fosfaatdeficiënte toestand, ten opzichte van de controle, 1,25 millimolar anorganisch fosfaat. De secundaire laterale worteldichtheid vertoonde geen significante verandering, wat wijst op het belang van laterale worteldichtheid voor het verkrijgen van inzicht in de RSA-plasticiteit. Ik heb voorzichtig zaailingen uit gaas verwijderd met een pincet.

Ik spreid wortels in een met water gevulde plaat met een ronde borstel, alle primaire wortels, en spreid het recht, spreid laterale wortels symmetrisch, verspreid tweede orde laterale wortels gekoppeld aan eerste orde laterale wortels. Een vergelijkbare methode kan worden gebruikt om het roetoppervlak van Arabidopsis-plantentips te berekenen. De Arabidopsis-bladeren kunnen op de andere plaat worden verspreid, gevolgd door beeldopname en analyse met behulp van vrij beschikbare ImageJ-software om het roetgebied te bepalen.

Dit protocol kan worden gebruikt om vragen te beantwoorden over de invloed van de omgeving op de plasticiteit van het wortelstelsel.