Name: Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer hoe je hoogwaardige sereuze eierstokkanker-patiënt-afgeleide organoïden genereert en kweekt. Deze 3D-modellen bootsen tumorfysiologie na en zijn ideaal voor therapeutisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.

Alle menselijke weefselmonsters die voor onderzoek zijn verzameld, zijn verkregen volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol. De onderstaande protocollen werden uitgevoerd in een steriele menselijke weefselkweekomgeving. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van menselijke proefpersonen. In aanmerking komende patiënten moesten een diagnose of vermoedelijke diagnose van eierstokkanker hebben, bereid en in staat zijn om geïnformeerde toestemming te ondertekenen en ten minste 18 jaar oud zijn. Tumorweefsel (kwaadaardige primaire tumor of gemetastaseerde plaatsen), ascites en pleuravocht werden verkregen van instemmende patiënten op het moment van hun procedure. Deze monsters werden onmiddellijk naar het laboratorium vervoerd en verwerkt voor het genereren van organoïden met behulp van de hieronder beschreven methoden.
1. Mediavoorbereiding
<ol><li>Complete voorbereiding van organoïde media<ol><li>Bereid R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7. OPMERKING: R-spondin-1/Noggin geconditioneerd medium is een betaalbaarder alternatief voor in de handel verkrijgbare recombinante eiwitten. HEK293T-cellen die stabiel R-spondin-1 en Noggin afscheiden via lentivirus-gemedieerde transductie waren een genereus geschenk van Ron Bose, Washington University School of Medicine in St. Louis, en Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Commercieel geconditioneerd medium zou als substituut kunnen worden gebruikt (zie materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Om het volledige organoïde medium te maken, combineert u 10% R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/l nicotinamide, 1,25 mmol/l N-acetylcysteïne, 1 μmol/l prostaglandine E2, 10 μmol/l SB202190, 500 nmol/L A83-01 en 10 μM ROCK-remmer (zie materiaaltabel). OPMERKING: Het medium kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Dit medium is overgenomen uit Hill et al.11. De concentraties en ingrediënten van het medium zijn hetzelfde, met toevoeging van een ROCK-remmer.</li>
	<li>Bereid organoïde basismedium door 500 ml van een geavanceerde formulering van DMEM / F12 te combineren met 1% penicilline-streptomycine, 1x dipeptide, L-alanyl-L-glutamine en 1x HEPES (10 mM) (zie tabel met materialen).</li>
</ol>2. Oogsten van organoïden uit ascites en pleuravocht
OPMERKING: Ascites en pleuravocht moeten zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden. Ontdooi eerder geïniformeerde BME-, DNase- I- en DNase I-reactiebuffer (zie materiaaltabel) door deze op ijs te plaatsen totdat de inhoud vloeibaar is.
<ol><li>Verkrijg ascites en pleuravocht van instemmende patiënten op het moment van standaardzorgoperaties of -procedures en vervoer bij kamertemperatuur in een reiscontainer naar het laboratorium. OPMERKING: Alle ascites- of pleuravochtverwerking moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving.</li>
	<li>Breng 50 ml ascites of pleuravocht over naar 50 ml conische buizen (het aantal buizen is afhankelijk van het volume van de verkregen ascites). Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gebruik na het centrifugeren een glazen Pasteurpipet om het supernatant voorzichtig op te zuigen.</li>
	<li>Ga verder door 50 ml ascites of pleuravloeistof toe te voegen aan de eerder gecentrifugeerde pellet en centrifugeer opnieuw bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet. Herhaal deze stap totdat alle ascites of pleuravocht zijn verwerkt.</li>
	<li>Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren. OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12.</li>
	<li>Suspendeerde elke celpellet in 1 ml 100 μg/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen. OPMERKING: Voeg minimaal 1 ml DNase I-oplossing toe. Als 1 ml niet genoeg is om de pellet te verstoren, voeg dan nog eens 1 ml toe.</li>
	<li>Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.</li>
	<li>Resuspensie van de nieuw gevormde celkorrels in voorverwarmde 5 ml 1x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer (zie materiaaltabel). Stel de vortex in op 458 x g en vortex de oplossingen in elke conische buis. Zodra de oplossingen homogeen zijn, gebruikt u een serologische pipet om de inhoud van alle conische buizen te combineren tot een enkele conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Incubeer de conische buis met de vortexoplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet niet langer rood is.</li>
	<li>Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer de microcentrifugebuis bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Het deel van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13.</li>
	<li>Zuig het organoïde basismedium voorzichtig op (stap 1.3) met behulp van een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME (zie materiaaltabel) met behulp van koude uiteinden. OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het wordt aanbevolen om 25% organoïde basismedium (stap 1.3) te gebruiken met geresuspendeerde cellen tot 75% BME.</li>
	<li>Plaat 40 μL aliquots van de geresuspendeerde celoplossing op een 6-well plaat. Plaat maximaal vijf aliquots per put (figuur 1).</li>
	<li>Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in een incubator van 37 °C om de BME te laten stollen. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig01.jpg"> Figuur 1: Plating van patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden. Representatief beeld van de organoïde beplating. Aliquots van het organoïdemengsel worden zorgvuldig verguld, zodat er geen bubbels worden gevormd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
3. Organoïden oogsten uit weefsel
OPMERKING: Weefsel moet zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden.
<ol><li>Verzamel en transporteer de tumor op ijs in een reiscontainer met PBS.</li>
	<li>Plaats het monster op een weefselkweekschaal van 10 cm (figuur 2). Gebruik een wegwerp scalpel om het weefsel te hakken. Gebruik vervolgens het doffe uiteinde van een wegwerpspuit en plet het weefsel totdat een homogeen mengsel is gemaakt.</li>
	<li>Plaats met een tang het homogene weefselmengsel in een dissociatiebuis. Voeg voor elke 1-2 ml gehomogeniseerd weefsel 7-8 ml 1 mg/ml type II collagenaseoplossing (zie materiaaltabel) toe in organoïde basismedium (stap 1.3) en 1 ml DNase I-oplossing. Vortex de oplossing bij 458 x g. OPMERKING: De hoeveelheid weefsel bepaalt de hoeveelheid collagenase-oplossing en het aantal benodigde buizen.</li>
	<li>Gebruik de dissociatiemachine (zie materiaaltabel) om het weefsel vloeibaar te maken terwijl het zich in de collagenase-oplossing bevindt. Voer het programma 37C_h_TDK3 (1 uur) uit totdat het een eencellige suspensie is. OPMERKING: Het programma moet opnieuw worden uitgevoerd als het resulterende mengsel niet homogeen is (d.w.z. als er nog weefselstukken in het mengsel aanwezig zijn). Als het weefsel wordt verteerd maar de oplossing stroperig is, verdun dan met organoïde basismedium (stap 1.3).</li>
	<li>Breng het gehomogeniseerde mengsel over in een nieuwe conische buis van 50 ml en voeg 20-40 ml organoïde basismedium toe (stap 1.3). Filter vervolgens de oplossing door een 100 μm celzeef in een nieuw gelabelde conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Centrifugeer het gefilterde mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.</li>
	<li>Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren. OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12.</li>
	<li>Resuspendie van de cellen in 1 ml 100 ug/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.</li>
	<li>Resuspendie van de nieuw gevormde celkorrel in 5 ml voorverwarmde 1x RBC-lysisbuffer. Vortex de oplossingen in elke conische buis op 458 x g.</li>
	<li>Incubeer de conische buis met de celkorrel geresuspendeerd in de RBC-lysisbuffer gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet wit lijkt.</li>
	<li>Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. OPMERKING: Het gedeelte van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS) (stap 5.1). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13.</li>
	<li>Zuig het organoïde basismedium voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME met behulp van koude uiteinden. OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedium (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.</li>
	<li>Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put.</li>
	<li>Plaats de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64878/64878fig02v2.jpg"> Figuur 2: Tumorweefsel voorafgaand aan dissectie. Representatief beeld van tumorweefsel verkregen voor organoïde generatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64878/64878fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
4. Doorgifte van organoïden
OPMERKING: Als het monster confluent is, kan elke organoïde put wekelijks naar twee nieuwe putten worden doorgegeven.
<ol><li>Voeg met behulp van een pipet van 1 ml 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan elk putje en pipetteer het medium rechtstreeks op de organoïde tabbladen om het te dissociëren. Verzamel al het medium met de geresuspendeerde pellets in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de conische buis van 15 ml met het mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.</li>
	<li>Voeg 1 ml dierlijk, recombinant enzym (zie tabel met materialen) toe aan de celpellet, draai de oplossing op 458 x g en breng over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Laat de buis 15 minuten incuberen in een waterbad van 37 °C.</li>
	<li>Na incubatie, centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.</li>
	<li>Resuspendeerde de pellet in BME. OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.</li>
	<li>Plaats de geresuspendeerde celoplossing in een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put. Zodra alle aliquots zijn verguld, plaatst u de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.</li>
</ol>5. Invriezen en ontdooien van organoïden
<ol><li>Invriezen van organoïden<ol><li>Begin met stap 4.1-4.4.</li>
		<li>Resuspendeer de celpellet in 0,5-1 ml vriesmedium voor herstelcelcultuur (zie tabel met materialen) en breng 1 ml over naar elke cryovial.</li>
		<li>Plaats de cryovialen vervolgens in een met isopropanol gevulde container bij −80 °C gedurende maximaal 2 weken voordat u ze overbrengt naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag13.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontdooien van organoïden<ol><li>Haal de monsters uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooi bij een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Eenmaal ontdooid, overbrengen in een conische buis van 15 ml en centrifugeren bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.</li>
		<li>Resuspendeerde de pellet in BME. OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.</li>
		<li>Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaats maximaal vijf aliquots per put.</li>
		<li>Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan de putjes.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Insluiten en genereren van formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) dia's om de organoïde samenstelling te evalueren
<ol><li>Na het kweken van organoïden gedurende ten minste 10 dagen om voldoende grootte te garanderen, verwijdert u het volledige organoïde medium uit de putten en voegt u 1 ml 2% paraformaldehydefixatief (PFA) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min.</li>
	<li>Was na incubatie de gekweekte organoïde aliquots 3x gedurende 5 minuten telkens met 1 ml PBS.</li>
	<li>Verwijder de PBS uit elk putje en voeg 1 ml warme 2% agar in gedeïoniseerd H2O toe aan elk putje. Til bij het toevoegen van de agar de gekweekte organoïde aliquots van de plaat op met behulp van een spatel. OPMERKING: Het is belangrijk om de agar niet te laten verharden voordat u de gekweekte organoïde aliquots optilt.<ol><li>Laat de agar bij kamertemperatuur in de put stollen.</li>
	</ol></li>
	<li>Maak met een kleine spatel de gestolde agar uit de put en bewaar deze in een cassette gedurende maximaal 48 uur (zie materiaaltabel) bij 4 °C in 70% ethanol tot verwerking14.</li>
	<li>Sluit de monsters in paraffine 15 in, snijd de dia's tot een dikte van 5 μm en bevlek de dia's met hematoxyline en eosine (H &E, zie materiaaltabel) kleuring met behulp van een standaardprotocol15.</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Pauli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Personalized+in+vitro+and+in+vivo+cancer+models+to+guide+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine.</a> Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).</li>
<li>Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+%28PDX%29+models%3A+Characteristics+and+points+to+consider+for+the+process+of+establishment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment.</a> Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+ovarian+cancer+organoids+in+precision+medicine%3A+Key+challenges+and+current+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429(2021).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids%3A+A+promising+model+for+personalized+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology+Report%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment.</a> Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).</li>
<li>Karakasheva, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+patient-derived+head+and+neck%2C+oral%2C+and+esophageal+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).</li>
<li>Madison, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Let-7+represses+carcinogenesis+and+a+stem+cell+phenotype+in+the+intestine+via+regulation+of+Hmga2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2.</a> PLoS Genetics. 11 (8), 1005408(2015).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+and+APC+mutations+promote+altered+crypt-villus+morphology+and+marked+hyperplasia+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Passarelli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucyl-tRNA+synthetase+is+a+tumour+suppressor+in+breast+cancer+and+regulates+codon-dependent+translation+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics.</a> Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).</li>
<li>Stumm, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+postfixation+tissue+storage+and+transport+medium+to+preserve+histopathology+and+molecular+pathology+analyses+%28total+and+phosphoactivated+proteins%2C+and+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH).</a> American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Ooft, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+can+predict+response+to+chemotherapy+in+metastatic+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients.</a> Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Nanki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+ovarian+cancer+organoids+capture+the+genomic+profiles+of+primary+tumours+applicable+for+drug+sensitivity+and+resistance+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing.</a> Scientific Reports. 10, 12581(2020).</li>
<li>Mead, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+modulators+of+the+cellular+composition+of+gut+epithelia+via+organoid+models+of+intestinal+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB's hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren n...

In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.
Kankercellijnen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) gemaakt van primaire eierstoktumoren zijn de belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in onderzoek naar eierstokkanker. Een groot voordeel van kankercellijnen is hun snelle expansie. Hun voortdurende cultuur resulteert echter in fenotypische en genotypische veranderingen die ervoor zorgen dat de kankercellijnen afwijken van het oorspronkelijke primaire kankertumormonster. Vanwege de bestaande verschillen tussen de kankercellijn en de primaire tumor, hebben medicijntests met positieve effecten in cellijnen niet dezelfde effecten in klinische onderzoeken2. Om deze beperkingen te overwinnen, worden PDX-modellen gebruikt. Deze modellen worden gemaakt door vers eierstokkankerweefsel te implanteren in immunodeficiënte muizen. Omdat het in vivo modellen zijn, lijken ze nauwkeuriger op menselijke biologische kenmerken en zijn ze op hun beurt meer voorspellend voor de uitkomsten van geneesmiddelen. Deze modellen hebben echter ook aanzienlijke beperkingen, waaronder de kosten, tijd en middelen die nodig zijn om ze te genereren4.
BOB's bieden een alternatief model voor preklinisch onderzoek dat de beperkingen van zowel kankercellijnen als PDX-modellen overwint. BOB's recapituleren de tumor en tumormicro-omgeving van een patiënt en bieden zo een in vitro tracteerbaar model dat ideaal is voor preklinisch onderzoek 2,3,5. Deze 3D-modellen hebben zelforganisatiemogelijkheden die de primaire tumor modelleren, wat een kenmerk is dat hun tweedimensionale (2D) cellijn-tegenhangers niet bezitten. Verder is aangetoond dat deze modellen genetisch en functioneel hun oudertumoren vertegenwoordigen en dus betrouwbare modellen zijn voor het bestuderen van nieuwe therapieën en biologische processen. Kortom, ze bieden uitbreidings- en opslagmogelijkheden op lange termijn die vergelijkbaar zijn met cellijnen, maar omvatten ook de micro-omgeving en cel-celinteracties die inherent zijn aan muismodellen 4,6.
Het huidige protocol beschrijft de creatie van BOB's uit patiënt-afgeleide tumoren, ascites en pleuravloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De BOB-culturen kunnen vervolgens gedurende meerdere generaties worden uitgebreid en worden gebruikt om de gevoeligheid voor medicamenteuze therapie en voorspellende biomarkers te testen. Deze methode vertegenwoordigt een techniek die kan worden gebruikt om behandelingen te personaliseren op basis van de therapeutische reacties van BOB's.

<table><tbody><tr><td>1% HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1% Penicillin-Streptomycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>30002CI</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Eppendorf Tubes&nbsp;</td><td>Genesee Scientific</td><td>14125</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Tissue Culture Dish&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serological Pipet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &micro;m Cell Filter</td><td>MidSci</td><td>100ICS</td><td></td></tr><tr><td>15 mL centrifuge tubes</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Cryovial</td><td>Simport Scientific</td><td>T301-2</td><td></td></tr><tr><td>2% Paraformaldehyde Fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C water bath&nbsp;</td><td>NEST</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCM104</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R31541GA</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Lamda Biotech</td><td>C121</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Type 2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3533-010-02</td><td>basement membrane extract</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>DNase I Reaction Buffer</td><td>New England Bio Labs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>PeproTech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td><td>Miltenyi BioTech</td><td>130-096-427</td><td>We gebruiken het protocol van de fabrikant.</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td>dipeptide, L-alanyl-L-glutamine</td></tr><tr><td>Hematoxylin and Eosin Staining Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1470670</td><td></td></tr><tr><td>Histoplast Paraffin Wax</td><td>Fisher Scientific</td><td>22900700</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Fisher Scientific</td><td>07202363S</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>p1000 Pipette with Tips&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipette with Tips&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes 9"</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820D</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21031CM</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Controller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prostaglandin E2</td><td>R&amp;D Systems</td><td>2296</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Murine Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Recovery Cell Culture Freezing Medium</td><td>Invitrogen</td><td>12648010</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>ROCK Inhibitor (Y-27632)</td><td>R&amp;D Systems</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7076</td><td></td></tr><tr><td>T75 Flask</td><td>MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue Embedding Cassette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>dierpvrij, recombinant enzym</td></tr><tr><td>Type II Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB's een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.

Om BOB's te genereren, werden de monsters mechanisch en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in BME en aangevuld met specifiek ontworpen media (figuur 3). Organoïden worden meestal vastgesteld over een tijdsbestek van 10 dagen, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertonen (figuur 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ft...

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Patiëntgestuurde organoïde modellen vertegenwoordigen genetisch en functioneel hun oudertumoren en zijn dus betrouwbare modellen voor het bestuderen van nieuwe therapieën en complexe biologische processen bij eierstokkanker. Door klonale heterogeniteit, de micro-omgeving van de tumor en in vitro cel-tot-celinteracties samen te vatten, overwinnen deze modellen de beperkingen van kankercellijnen en van patiënten afgeleide xenografts. Van de patiënt afgeleide organoïden bieden langdurige uitbreidings- en opslagmogelijkheden en bootsen tumorfysiologie na.Als gevolg hiervan zijn het ideale modellen voor de studie van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers. Begin met het oogsten van de organoïden door de tumormonsters in een weefselkweekschaal van 10 centimeter te plaatsen en het weefsel te hakken om een homogeen mengsel te maken met behulp van een wegwerpscalpel. Plaats het homogene weefselmengsel met een tang in een dissociatiebuis.Voeg voor elke één tot twee milliliter gehomogeniseerd weefsel zeven tot acht milliliter van één milligram per milliliter type twee collagenase-oplossing in organoïde basismedium en één milliliter DNase One-oplossing toe. Vortex de oplossing bij 458 G

generation-culturing-high-grade-serous-ovarian-cancer-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt voor het vaststellen van menselijke borstorganoïden uit van de patiënt afgeleide borsttumorresecties of normaal borstweefsel. Het protocol biedt uitgebreide stapsgewijze instructies voor het kweken, bevriezen en ontdooien van menselijke patiënten afgeleide borstorganoïden.

Oprichting en kweek van van de patiënt afgeleide borstorganoïden

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.

Oprichting van van alvleesklierkanker afgeleide tumororganoïden en fibroblasten uit vers weefsel

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

Dit protocol beschrijft het maken van driedimensionale (3D) weefselorganoïden uit primaire menselijke ovariumoppervlakte-epitheel (hOSE) cellen. Het protocol omvat isolatie van hOSE uit vers verzamelde eierstokken, cellulaire expansie van de hOSE, cryopreservatie-ontdooiprocedures en organoïde-afleiding. Immunofluorescentie, kwantitatieve analyse en het demonstreren van het nut als screeningplatform zijn inbegrepen.

Menselijke ovariële oppervlakte-epitheel organoïden als een platform om weefselregeneratie te bestuderen

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van hooggradig sereus ovariumcarcinoom (HGSOC) muismodellen in vitro en in vivo. Van de afleiding van muizen eileiderorganoïden, hun genetische modificatie om menselijke HGSOC-genetica samen te vatten, en hun introductie in de eierstokslijmbeurs van syngene muizen voor in vivo ontwikkeling van tumoren.

Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

We beschrijven methoden om somatische cellen van muis-ovariumcellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van de eierstok en om somatische organoïden van muis-ovarium te genereren met een steigervrije benadering.

Onderzoek naar de ovariummicroomgeving: Methoden voor isolatie, 2D-kweek en organoïde kweek van somatische cellen van muis eierstokcellen

Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Patiënten-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen meer robuust even melanoom moleculaire en biologische kenmerken en zijn meer voorspellend van therapie respons in vergelijking met traditionele kunststof weefselcultuur gebaseerde assays. Hier beschrijven we ons standaard Besturingsprotocol voor de oprichting van nieuwe PDX-modellen en de karakterisatie/experimenten van bestaande PDX-modellen.

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Leer hoe je hoogwaardige sereuze eierstokkanker-patiënt-afgeleide organoïden genereert en kweekt. Deze 3D-modellen bootsen tumorfysiologie na en zijn ideaal voor therapeutisch onderzoek.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Meer video's verkennen