Mitochondriale morfologie analyseren door middel van simulatie supervised learning

We demonstreren het gebruik van een simulatie supervised machine learning tool voor het analyseren van mitochondriën in fluorescerende microscopie beelden van vaste cellen. Huidige methoden om mitochondriën in microscopiebeelden te segmenteren, omvatten automatische drempelgebaseerde methoden zoals Ostu of handmatige segmentatie. Thresholding-gebaseerde technieken presteren slecht wanneer de signaal-achtergrondverhouding laag is.

Typisch, afbeeldingen voor de morfologische analyse bevatten een groot aantal mitochondriën, waardoor handmatige segmentatie vervelend is. Begeleide deep learning-methoden voeren segmentatie uit met hoge nauwkeurigheid, maar vereisen een groot aantal input ground-truth pair-gegevens voor training. Deze aanpak maakt gebruik van een op fysica gebaseerde simulator om paren microscopiebeelden en hun 2D-grondwaarheidsvormmasker te genereren, waardoor handmatige annotatie niet meer nodig is.

Het model dat is getraind op gesimuleerde beelden wordt vervolgens gebruikt om mitochondriën te segmenteren in echte microscoopbeelden. We gebruiken een op deep learning gebaseerde segmentatietool die automatisering van deze taak met hoge nauwkeurigheid mogelijk maakt en die geen geannoteerde ground-truth dataset vereist voor training. De simulatie begint met de geometriegeneratie met behulp van parametrische curven voor het genereren van vormen.

Emitters worden gelijkmatig verdeeld en willekeurig op het oppervlak van de gegenereerde vorm geplaatst, zodat de dichtheid overeenkomt met experimentele waarden. Een 3D PSF van de microscoop wordt berekend met behulp van het Gibson-Lanni-model. Om fotorealisme te bereiken tussen de gesimuleerde beelden en de experimentele beelden, emuleren we zowel de donkere als de geschoten geluiden.

De natuurkundige grondwaarheid wordt gegenereerd in de vorm van een binaire kaart. We beoordelen het effect van CCCP-behandeling op mitochondriale morfologie van vaste cardiommyoblasten die zijn afgebeeld met behulp van een confocale microscoop. Celkweek.

Bereid je voor op het zaaien van de cellen, werkend in een steriele laminaire stromingskap, door een afdekslip voor elke experimentele toestand in een put van een 12-putplaat te plaatsen. Zorg ervoor dat de verdunde celsuspensie goed wordt gemengd door de inhoud van de centrifugebuis meerdere keren op en neer te pipetteren voordat u het juiste volume aan elke put dispenseert. Experimentele procedure.

Aspirateer celkweekmedia uit de putten van de 12 putplaat en breng vervolgens snel verse voorverwarmde media aan op de controleputten en de voorverwarmde media met 10 micromolaire CCCP-oplossing op de putjes van de testconditie. Incubeer in de 37 Celsius cel incubator gedurende twee uur. Aspirateer celkweekmedia uit de putten en breng de voorverwarmde fixatie-oplossing aan.

Kleuring en montage van cellen op afdekslips. Voeg 10 microliter montagemedia toe aan een voorbereide glazen schuif om een afdekslip te monteren. Pak de afdeksel van de 12 putplaat met een pincet en dep vocht van de afdekselglijders door de rand en de achterkant van de dekselslip kort aan te raken naar het voorbereide pluisvrije papieren handdoekje.

Laat de klep voorzichtig naar beneden glijden op de wachtende druppel van montagemedia. Microscoop en beeldvorming. Pas met behulp van de oculairen handmatig het Z-niveau aan om het monster scherp te stellen.

Schakel over naar het tabblad Verworven binnen de software. Gebruik de slimme opstelling om het fluorescentiekanaal te selecteren dat moet worden gebruikt voor beeldvorming. Array-gecentreerd op het midden van de cover slip met 12 totale posities om in beeld te brengen.

Plaats RA gecentreerd op het midden van de afdekslip. Het is mogelijk om meerdere locaties op een geautomatiseerde manier in beeld te brengen. Het genereren van gesimuleerde trainingsgegevens.

Download de code en pak de inhoud uit. Volg de instructies en leesmij om de omgeving in te stellen. Navigeer naar de map met de naam src"Maak een kopie of gebruik de map 2.

mitochondriën simulatie luchtig"en hernoem het. Deze map bevat alle bestanden met betrekking tot de simulatie van de trainingsgegevens. Er zijn drie sets parameters die moeten worden ingesteld voor de simulatie.

Stel eerst de parameters in van het aantal mitochondriën, het bereik van de diameter, het bereik van de Z-as en de dichtheid van fluoroforen voor de simulator in het batchconfiguratiebestand. Stel vervolgens optische parameters in van numeriek diafragma, vergroting en minimale golflengte van de dataset in de bestandsmicroscoopPSFmode. py"Stel de gewenste waarde in voor pixelgrootte en emissiegolflengte in de brand generate_batch_parallel.

py"Stel de derde set parameters in met betrekking tot de uitvoergegevensset, zoals de grootte van uitvoerafbeeldingen, het aantal tegels in elke afbeelding en het aantal totale afbeeldingen in het bestand generate_batch_parallel. py"Voer het bestand generate_batch_parallel uit. py"om de simulatie te starten.

Als u de uiteindelijke afbeelding wilt verkrijgen, maakt u een kopie van de map met de naam 5. Datavoorbereiding en training/datavoorbereiding" en navigeer erin. Stel de parameters in van batchnummer en het aantal afbeeldingen per batch, het bereik van ruis dat moet worden toegevoegd aan het bestand Data_generator.

py"Voer het bestand Data_generator uit. py"maak de montagebeelden. Kopieer de mappen met de naam image"en segmenteer" naar de datatrain/train"map.

Deep learning gebaseerde segmentatie. Voor het trainen van het segmentatiemodel voor een nieuwe microscoopbeeldinstelling navigeert u naar de map met de naam train" en stelt u de parameters in van bachgrootte, backbonemodel voor de segmentatie, het aantal tijdperken en de leersnelheid voor training in het bestand met de naam train_unet. py"Voer het bestand train_unet uit.

py"om de training te starten. Het trainingsproces geeft de statistiek weer voor het evalueren van het segmentatiemodel op de gesimuleerde validatieset. Nadat de training is voltooid, wordt het model opgeslagen als best_model.

h5"in de map met de naam trein"Om het model op de microscoopbeelden te testen, moeten de beelden worden gesplitst tot de grootte die door het treinmodel wenselijk is. Navigeer hiervoor naar de map met de naam 6. Bereid testgegevens voor"en kopieer de PNG-indelingsbestanden van de gegevens naar de png-map" en voer het bestand uit split_1024_256.

py"Hiermee worden 256 bij 256 bij 256 bijgesneden van de afbeeldingen in de gegevensmap gemaakt. Als u afbeeldingsuitsnedes wilt segmenteren, gaat u naar de map met de naam 7. Test segmentatie" en voer het bestand met de naam segment uit.

py"na het instellen van de naam van het opgeslagen model dat moet worden gebruikt. De gesegmenteerde afbeeldingen worden opgeslagen in de uitvoermap. Morfologische analyse.

Plaats het bestand met de naam make_montage. py"in de map met de naam 7. Test segmentatie" en voer het bestand uit om de gesegmenteerde uitvoer terug te voegen naar de oorspronkelijke grootte van de afbeelding.

Maak een nieuwe map met de naam 9. Morfologische analyse" in de bronmap en navigeer erin. Installeer de skan- en zeevaartbibliotheken met behulp van de commandopijp install seaborn skan"De segmentatiemaskers worden geskeletiseerd met behulp van de bibliotheek met de naam skan" om het analyseren van de topologie van het individuele mitochondrion mogelijk te maken.

Plaats het bestand in de map 9. Morfologische analyse"Rangschik de afbeeldingen van verschillende groepen van het experiment in verschillende mappen in de map 7. Testsegmentatie"Voer het bestand uit om plots voor de analyse te maken. Resultaten.

De uit te voeren kwantitatieve analyse is afhankelijk van de onderzoeksvragen of hypothese. In ons experiment waren we geïnteresseerd in de drie verschillende morfologieën van mitochondriën, namelijk stippen "kleine mitochondriale bits, staafjes"vezelachtige of stringachtige mitochondriën en multi-vertakte netwerken"Om de morfologie te identificeren, skeletoniseren we eerst de segmentatie-output en analyseren we de taklinks van de verschillende klassen. We tonen de resultaten van de analyse voor de twee groepen galactosen aangepaste cellen, de controlegroep en de cccp behandelde groep.

We zien een significante toename van de gemiddelde taklengtes van stippen, wat wordt verwacht, gezien de zwelling die mitochondriën ondergaan bij blootstelling aan CCCP. Het percentage mitochondriën in individuele lengtes van zowel staafjes als netwerkklassen is aanzienlijk verminderd ten opzichte van de controle wanneer de cellen zijn behandeld met CCCP, waardoor onze hypothese wordt geverifieerd. Een uitdagend scenario voor onze methode is wanneer het beeld dicht opeengepakte mitochondriën heeft.

De roze kleur geeft het langste enkele mitochondrion aan dat in de afbeelding is gedetecteerd, wat wordt veroorzaakt door de verhoogde fout in de segmentatieresultaten. Deze faalgevallen kunnen worden gedetecteerd door een controle van de lengtes van mitochondriën en met behulp van morfologische operatoren. Hoewel onze applicatie een voorbeeld is van hoe we analyse van mitochondriale morfologie hebben uitgevoerd, geloven we dat een dergelijke analyse en onderzoeksvragen eromheen kunnen worden geformuleerd voor verschillende aspecten van mitofagie en gerelateerde biologische experimenten.