Name: Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-24T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 7 s
Description: Leer DNA-schadeherstel in eierstokkanker organoïden visualiseren via immunofluorescentie. Deze methode helpt onderzoekers resistentie tegen chemotherapie en PARP-remmers te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar voor de begeleiding van Pavel Lobatsjevski, PhD bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation en het Reproductive Scientist Development Program bedanken voor hun steun aan dit project.

Tumorweefsel en ascites werden verkregen na het verkrijgen van toestemming van de patiënt als onderdeel van een gynaecologische oncologische biorepository die werd goedgekeurd door de Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Patiënten werden geïncludeerd als ze een vergevorderd stadium hadden van hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur op de bank, tenzij anders aangegeven. Alle reagentia werden bereid bij kamertemperatuur (tenzij anders aangegeven) en bewaard bij 4 °C.
1. Organoïde generatie
<ol><li>Genereer de organoïden volgens het eerder gepubliceerde rapport20.</li>
</ol>2. Beplating en bestraling van organoïden
<ol><li>Gebruik organoïden in cultuur en maak de tabbladen van de organoïden los van de kweekschaal door handmatige manipulatie van een pipetpunt. Verzamel de organoïden in een conische buis van 15 ml.</li>
	<li>Centrifugeer de conische buis bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig met behulp van een pipet het supernatant voorzichtig af.</li>
	<li>Voeg 1.000 μL van een dierlijk, recombinant enzym toe aan de pellet (zie materiaaltabel). Meng de oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.</li>
	<li>Centrifugeer de oplossing gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig af te zuigen.</li>
	<li>Na centrifugeren en aspiratie, resuspendeerde de pellet in 1.000 μL fosfaat-gebufferde zoutoplossing.</li>
	<li>Breng 10 μL van de oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en meng met 10 μL trypan blauw.</li>
	<li>Neem 10 μL van de trypan blue cell solution in een celtelkamerschuif en steek deze in de celtelmachine (zie Tabel met materialen).</li>
	<li>Plaat 40.000 cellen per 20 μL keldermembraanextract (BME) in een 8-well glazen kamerschuif (zie Materiaaltabel). Dit houdt de organoïden gedurende 3-5 dagen in stand om de cellen organoïden te laten vormen en tot een geschikte grootte te laten groeien.</li>
	<li>Om dubbelstrengs DNA-breuken te induceren, straalt u de vergulde organoïden uit met 10 grijze (Gy) ɣ-bestraling (zie materiaaltabel voor bestralingsdetails). OPMERKING: Dit kan tot 5-10 minuten duren.</li>
	<li>Incubeer de organoïden in hun kweekmedia in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 4 uur.</li>
</ol>3. Immunofluorescentiekleuring
OPMERKING: Volumes verwijzen naar de hoeveelheid per put van de 8-well chamber slide (~300 μL).
<ol><li>Na bestraling en incubatie van de organoïden, zuig de media op met een pipet, voorzichtig om de 3D-matrix niet te verstoren. Wassen met 300 μL PBS.</li>
	<li>Fixeer de organoïden in 300 μL van 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten. OPMERKINGEN: Laat niet te lang staan, omdat de BME zal depolymeriseren en kan worden afgezogen.</li>
	<li>Was de organoïden met 300 μL kleuringsbuffer (zie materiaaltabel). Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.</li>
	<li>Voeg voor permeabilisatie voorzichtig 300 μL permeabilisatiebuffer toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 20 minuten. Wassen met 300 μL kleurbuffer. Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.</li>
	<li>Voeg 300 μL kleuringsbuffer toe om de permeabilisatiestap te blokkeren. Plaats op een shaker gedurende 30 min. Zuig de vlekbuffer af met behulp van een pipet.</li>
	<li>Voeg 300 μL primaire antilichamen toe (konijn anti-RAD51, muis anti-Geminin, konijn anti-RPA, muis anti-ɣH2AX, konijn anti-Geminin, muis anti-53BP1; zie Tabel van Materialen) verdund in kleuringsbuffer. Incubeer bij 4 °C gedurende 16 uur. OPMERKING: Vermijd co-kleuring met hetzelfde gastheerdier. Laat het deksel eraf om te voorkomen dat de antilichamen zich mengen in naburige putten.</li>
	<li>Verwijder de primaire antilichaamoplossing. Voer drie wasbeurten uit met 300 μL kleuringsbuffer gedurende 5 minuten elk op de shaker.</li>
	<li>Voeg 300 μL secundaire antilichaam (geit anti-muis Alexa fluor 488 en geit anti-konijn Alexa fluor 647; zie tabel met materialen) oplossing verdund in kleurbuffer en incubeer gedurende 1 uur in het donker. OPMERKING: Alle volgende stappen moeten in het donker worden uitgevoerd.</li>
	<li>Zuig de secundaire antilichaamoplossing op. Voeg 300 μL verdunde DAPI toe. Plaats gedurende 5 minuten op een shaker.</li>
	<li>Voer drie wasbeurten uit met 300 μL kleuringsbuffer gedurende 5 minuten elk op de shaker. Verwijder de vlekbuffer en maak de kamers los met behulp van de verwijderingskit die bij de kamerglaasjes is geleverd (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Zorg ervoor dat u niet te ver naar voren duwt om de 3D-matrix te verstoren.</li>
	<li>Gebruik een p200-pipetpunt met de punt afgesneden punt om montagemedium toe te voegen (zie materiaaltabel) om elk putje te bedekken met een organoïde lipje (bijvoorbeeld 20-30 μL voor elk organoïde tabblad).</li>
	<li>Plaats een coverslip over het monster en vermijd bubbels.</li>
	<li>Neem doorzichtige nagellak en verf deze op de zijkanten van het dekglas om de dia af te dichten. Laat het 1 uur uitharden en zet het op -20 °C. OPMERKING: Na beeldvorming kan de dia ten minste 6 maanden worden bewaard met minimaal verlies van fluorescentie.</li>
</ol>4. Beeldvorming
<ol><li>Verkrijg beelden met behulp van een confocale microscoop (zie Materiaaltabel) op 63x objectief met dompelolie. OPMERKING: Als u nucleaire eiwitten afbeeldt, is 63x voordelig, maar 40x is ook acceptabel.</li>
	<li>Gebruik DAPI om de organoïden door het oculair te lokaliseren. Selecteer de juiste filters voor microscopie op basis van de gebruikte fluoroforen. Stel de parameters in voor het vastleggen van de z-stack-afbeeldingen. OPMERKING: De fluoroforen die in de studie werden gebruikt, waren DAPI, 488 en 647. De lasers 405, 488 en 638 werden ingeschakeld om de kleuring te visualiseren. OPMERKING: De aanbevolen z-stack is afhankelijk van het oplossend vermogen van het doel.</li>
	<li>Pas het live beeld aan: stel focus in, laserintensiteit, etc. OPMERKING: Hoe hoger de laserintensiteit, hoe groter de kans dat het monster fotobleekt. Kies daarom een optimale laserintensiteit.</li>
	<li>Verkrijg de z-stack. OPMERKING: Dit kan tot 5-10 minuten duren.</li>
	<li>Van de afbeeldingen die in de z-stack zijn verzameld, screenshot ten minste drie afbeeldingen per stapel. OPMERKING: Zorg ervoor dat u screenshots in de hele stapel verkrijgt om de kernen niet te dupliceren bij het kwantificeren.</li>
	<li>Sla elk bestand op als een TIFF en ga verder met de analyse (stap 5).</li>
</ol>5. Analyse
OPMERKING: Gebruik JCountPro voor alle beeldanalyse na het eerder gepubliceerde rapport21. Om deze software te verkrijgen, raadpleegt u de bijbehorende publicatie.
<ol><li>Selecteer onder het deelvenster objectanalyse (boven aan het programma) op het tabblad bestandsselectie (onder aan het programma) de TIFF-bestanden .</li>
	<li>Klik op Toevoegen om de geselecteerde bestanden naar de geselecteerde bestandengroep te verplaatsen. Selecteer Beeldscherm.</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Segmentatie de optie blauw als de kleur van de kernen. Selecteer Automatische segmentatie om de drempel van de kernen te optimaliseren. OPMERKING: Als de automatische segmentatie de objecten niet nauwkeurig identificeert, kan de gebruiker de fijnafstelling en onbewerkte afstemming op de afbeelding aanpassen of de gebruikershandleiding raadplegen om de segmentatie verder te optimaliseren.</li>
	<li>Selecteer onder het deelvenster Objecten de optie Grote objecten automatisch splitsen en optimaliseer de grootte van de kernen. OPMERKING: De kernen hebben meestal een onvoorwaardelijke grootte van 5.000 pixels, terwijl de voorwaardelijke grootte 1.500 pixels is. Zie de gebruikershandleiding om de grootte van de objecten verder te optimaliseren.</li>
	<li>Selecteer Objecten identificeren om de parameters te testen. OPMERKING: Als deze parameters niet nauwkeurig zijn, kunnen de grootte en afstemming samen met andere instellingen worden aangepast. Zie de gebruikershandleiding voor instructies met betrekking tot verdere optimalisatie.</li>
	<li>Nadat u de parameters voor de afbeelding hebt aangepast, selecteert u Objecten in alle afbeeldingen identificeren om de kernen in alle geselecteerde afbeeldingen te identificeren.</li>
	<li>Selecteer het deelvenster Foci-analyse (boven aan het programma).</li>
	<li>Selecteer op het tabblad Bestanden selecteren (onder aan het programma) de TIFF-bestanden die zijn gebruikt voor objectanalyse en selecteer de pijlknoppen (>>) om de afbeeldingen naar de groep afbeeldingsbestanden te verplaatsen.</li>
	<li>Dubbelklik in de mapgroep onder de verplaatste afbeeldingsbestanden op de map Handmatig bewerken en selecteer deze optie om de ioc-bestanden naar de groep objectverzamelingsbestanden te verplaatsen. OPMERKING: Alle geselecteerde TIFF's moeten overeenkomen met ioc-bestanden.</li>
	<li>Druk op Selecteren om de bestanden naar de geselecteerde bestandengroep te verplaatsen. Selecteer het tabblad Foci-telling onder aan het programma.</li>
	<li>Optimaliseer de parameters door de onderstaande stappen te volgen.<ol><li>Top hat instellingen index: 12.</li>
		<li>Focuskanaal: Selecteer de kleur van de foci (groen: ɣ-H2AX; rood: RAD51).</li>
		<li>H-koepelinstellingen: koepelhoogte %: 30; drempel %: 28 en 28.</li>
		<li>Vorm/grootte instelling: Min focus grootte, pixels: 5. Selecteer Vorm/Grootte toepassen. Maximale scherpstelgrootte (voorwaardelijk): 32. Min rondheid, x100: 96. Maximale scherpstelling, pixels: 60.</li>
		<li>Ruisfilter: maat 1. OPMERKING: Als u bepaalt of een kern positief is voor gemininekleuring, selecteert u onder het tweede kanaal groen en selecteert u onder analyse intensiteit.</li>
	</ol></li>
	<li>Om de ingestelde parameters te testen, selecteert u de onderstaande knoppen in volgorde: Top Hat > H-Dome > Foci Count. OPMERKING: Als deze parameters niet werken, kunnen de grootte en afstemming samen met andere instellingen worden aangepast. Raadpleeg de gebruikershandleiding voor meer informatie over hoe de afbeelding verder kan worden geoptimaliseerd.</li>
	<li>Zodra de parameters zijn geoptimaliseerd voor de geselecteerde afbeeldingen, selecteert u Automatisch tellen om de foci in elke afbeelding per kern te tellen . Als het tweede kanaal gewenst is, bepaalt het programma de intensiteit die kan worden gebruikt.</li>
</ol>

<ol><li>Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Epithelial ovarian cancer.</a> Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).</li>
<li>Tew, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitors+in+the+management+of+ovarian+cancer%3A+ASCO+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline.</a> Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).</li>
<li>Tomasova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+and+ovarian+carcinogenesis%3A+impact+on+risk%2C+prognosis+and+therapy+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome.</a> Cancers. 12 (7), 1713(2020).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+functional+assay+for+homologous+recombination+status+in+primary+cultures+of+epithelial+ovarian+tumor+and+correlation+with+sensitivity+to+poly%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors.</a> Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).</li>
<li>Graeser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+marker+of+homologous+recombination+predicts+pathologic+complete+response+to+neoadjuvant+chemotherapy+in+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer.</a> Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).</li>
<li>Hill, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+DNA+repair+inhibitor+response+in+short-term+patient-derived+ovarian+cancer+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids.</a> Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).</li>
<li>Naipal, K. A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+ex+vivo+assay+to+select+homologous+recombination-deficient+breast+tumors+for+PARP+inhibitor+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment.</a> Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).</li>
<li>Tumiati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+homologous+recombination+assay+predicts+primary+chemotherapy+response+and+long-term+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients.</a> Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinicopathological+features+of+homologous+recombination-deficient+epithelial+ovarian+cancers%3A+sensitivity+to+PARP+inhibitors%2C+platinum%2C+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival.</a> Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).</li>
<li>Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platinum-DNA+damage+tolerance+is+associated+with+cisplatin+resistance+and+cross-resistance+to+various+chemotherapeutic+agents+in+unrelated+human+ovarian+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines.</a> Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).</li>
<li>Stefanou, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+DNA+damage+response+pathways+may+predict+the+outcome+of+platinum+chemotherapy+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer.</a> PLoS One. 10 (2), 0117654(2015).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).</li>
<li>Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+%CE%B3-H2AX+assay+to+monitor+DNA+damage+and+repair+in+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research.</a> Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).</li>
<li>Fuh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+deficiency+real-time+clinical+assays%2C+ready+or+not%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not.</a> Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).</li>
<li>Cong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+are+a+key+determinant+of+PARP+inhibitor+synthetic+lethality+with+BRCA+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency.</a> Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).</li>
<li>Lee, E. K., Matulonis, U. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP+inhibitor+resistance+mechanisms+and+implications+for+post-progression+combination+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies.</a> Cancers. 12 (8), 2054(2020).</li>
<li>Panzarino, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+gaps+underlie+BRCA+deficiency+and+therapy+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response.</a> Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).</li>
<li>Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+modelling+of+ovarian+cancer%3A+from+cell+lines+to+organoids+for+discovery+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984(2022).</li>
<li>Regan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+staining+of+colorectal+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids.</a> Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).</li>
<li>Graham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+culturing+of+high-grade+serous+ovarian+cancer+patient+derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).</li>
<li>Jakl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+JCountPro+software+for+efficient+assessment+of+ionizing+radiation-induced+foci+in+human+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes.</a> International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).</li>
<li>Mullen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAS6%2FAXL+inhibition+enhances+ovarian+cancer+sensitivity+to+chemotherapy+and+PARP+inhibition+through+increased+DNA+damage+and+enhanced+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress.</a> Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).</li>
<li>van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+resolution+three-dimensional+imaging+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids.</a> Journal of Visualized Experiments. (160), e60709(2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+mouse+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells.</a> Bio Protocols. 6 (4), 1732(2016).</li>
<li>Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+microenvironment+in+high+grade+serous+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer.</a> Cancers. 10 (8), 266(2018).</li>
<li>Ghoneum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+clinical+value+of+tumor+microenvironment+in+platinum-resistant+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer.</a> Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).</li>
<li>Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+in+ovarian+cancer%3A+function+and+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758(2020).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+liver+cancer-derived+organoid+cultures+for+disease+modeling+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening.</a> Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Cybulla, E., Vindigni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+replication+stress+response+to+optimize+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy.</a> Nature Reviews. , (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De DNA-schaderespons speelt een integrale rol bij zowel de ontwikkeling van eierstokkanker als chemotherapieresistentie. Daarom is een grondig begrip van DNA-reparatiemechanismen noodzakelijk. Hier wordt een methodologie gepresenteerd om DNA-schadehersteleiwitten in 3D, intacte organoïden te bestuderen. Een reproduceerbaar, betrouwbaar protocol wordt ontwikkeld met behulp van kenmerkende antilichamen om DNA-schade, homologe recombinatie, niet-homologe eindverbinding en replicatiestress te evalueren. Belangrijk is dat dez...

Eierstokkanker is de belangrijkste doodsoorzaak als gevolg van gynaecologische maligniteit. De meerderheid van de patiënten wordt behandeld met DNA-beschadigende geneesmiddelen zoals carboplatine, en degenen met homologe recombinatieherstel (HRR)-deficiënte tumoren kunnen poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -remmers 1,2 krijgen. De meeste patiënten ontwikkelen echter resistentie tegen deze therapieën en sterven binnen 5 jaar na de diagnose. Ontregeling van de DNA-schaderespons (DDR) is in verband gebracht met de ontwikkeling van eierstokkanker en zowel chemotherapie als PARP-remmerresistentie3. Studie van de DDR is dus noodzakelijk om de pathofysiologie van eierstokkanker, potentiële biomarkers en nieuwe gerichte therapieën te begrijpen.
De huidige methoden om de DDR te evalueren maken gebruik van immunofluorescentie (IF), omdat dit de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van DNA-schade-eiwitten en nucleotide-analogen mogelijk maakt. Zodra er een dubbelstrengsbreuk (DSB) in het DNA is, wordt het histoneiwit H2AX snel gefosforyleerd en vormt het een focus waar DNA-schadehersteleiwitten samenkomen4. Deze fosforylering kan eenvoudig worden geïdentificeerd met behulp van IF; in feite is de ɣ-H2AX-test vaak gebruikt om de inductie van een DSB 5,6,7,8,9 te bevestigen. Verhoogde DNA-schade is in verband gebracht met platinagevoeligheid en werkzaamheid van DNA-schadelijke stoffen 10,11,12, en ɣ-H2AX is voorgesteld als een biomarker geassocieerd met chemotherapierespons in andere kankerbehandelingen 13. Bij een DSB voert een cel die bedreven is in HRR een reeks gebeurtenissen uit die ertoe leiden dat BRCA1 en BRCA2 RAD51 rekruteren om replicatie-eiwit A (RPA) te vervangen en aan het DNA te binden. HRR-reparatie maakt gebruik van een DNA-sjabloon om de DSB getrouw te repareren. Wanneer tumoren echter een tekort aan HRR hebben, vertrouwen ze op alternatieve reparatieroutes zoals niet-homologe eindverbinding (NHEJ). Van NHEJ is bekend dat het foutgevoelig is en een hoge mutatiebelasting op de cel creëert, die 53BP1 als positieve regulatorgebruikt 14. Deze DNA-schade-eiwitten kunnen allemaal nauwkeurig worden geïdentificeerd als foci met behulp van IF. Naast kleuring voor eiwitten, kan IF worden gebruikt om vorkbescherming en enkelstrengs DNA-kloofvorming te bestuderen. Het vermogen om stabiele vorken te hebben is gecorreleerd met platinarespons en onlangs hebben gap-assays het potentieel aangetoond om de respons op PARP-remmers 6,15,16,17 te voorspellen. Daarom is kleuring voor de nucleotide-analogen na introductie in het genoom een andere manier om de DDR te bestuderen.
Tot op heden is de evaluatie van de DDR bij eierstokkanker grotendeels beperkt gebleven tot homogene 2D-cellijnen die de klonale heterogeniteit, micro-omgeving of architectuur van in vivo tumoren niet samenvatten18,19. Recent onderzoek suggereert dat organoïden superieur zijn aan 2D-cellijnen bij het bestuderen van complexe biologische processen zoals DDR-mechanismen6. De huidige methodologie evalueert RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA en geminin in BOB's. Deze methoden beoordelen de intacte organoïde en maken de studie van DDR-mechanismen mogelijk in een omgeving die meer lijkt op de in vivo tumormicro-omgeving. Samen met confocale microscopie en geautomatiseerde foci-telling kan deze methodologie helpen bij het begrijpen van de DDR-route bij eierstokkanker en het personaliseren van behandelplannen voor patiënten.

<table><tbody><tr><td>1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++)</td><td>Sigma</td><td>14-040-133</td><td></td></tr><tr><td>1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>ICN1860454</td><td></td></tr><tr><td>Ant-53BP1 Antibody&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>612522</td><td>verdund tot 1:500 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Ant-Geminin Antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab104306</td><td>verdund tot 1:200 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Anti-Geminin Antibody&nbsp;</td><td>ProteinTech</td><td>10802-1-AP</td><td>verdund tot 1:400 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Anti-RAD51 Antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab133534</td><td>verdund tot 1:1000 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Anti-yH2AX Antibody&nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>05-636</td><td>verdund tot 1:500 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody</td><td>Bethyl Laboratories&nbsp;</td><td>A300-245A-M</td><td>verdund tot 1:200 in kleuringsbuffer</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP1605 100</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000</td><td>Leica&nbsp;</td><td>389584</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tubes, 15 mL</td><td>Corning&nbsp;</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>AMQAF2000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slip</td><td>LA Colors</td><td></td><td>Elke heldere nagellak is voldoende</td></tr><tr><td>Cultrex&nbsp;RGF Basement Membrane Extract, Type 2</td><td>&nbsp;R&amp;D Systems&nbsp;</td><td>3533-010-02</td><td>Zou waarschijnlijk Matrigel of andere BME Matrix kunnen gebruiken&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp;R37606</td><td>NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagens, Verdund in 1x PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>Glycine&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC0756056</td><td></td></tr><tr><td>JCountPro</td><td>JCountPro</td><td></td><td>Voor toegang tot de software, E-mail: jcountpro@gmail.com&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>07-000-243</td><td></td></tr><tr><td>Nail Polish&nbsp;</td><td>StatLab</td><td>SL102450</td><td></td></tr><tr><td>Parafomraldehyde (PFA), 2%&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>157-4</td><td>Verdun tot 4% PFA in PBS++ om 2% PFA te verkrijgen</td></tr><tr><td>Permeabilisatie Buffer</td><td>Gemaakt in Lab</td><td></td><td>0,2% X-100 Triton in PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Rainin</td><td>17014382</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips&nbsp;</td><td>Rainin&nbsp;</td><td>17014967</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>&nbsp;P36930</td><td></td></tr><tr><td>Kleuringsbuffer&nbsp;</td><td>Gemaakt in Lab</td><td></td><td>0,5% BSA, 0,15% Glycine, 0,1% X-100 Triton in PBS++&nbsp;</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System&nbsp;</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>12-565-8</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Alderich&nbsp;</td><td>11332481001</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0,4%</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604013</td><td>vrij van dierlijke oorsprong, recombinant enzym</td></tr><tr><td>X-RAD 320 Biological Irradiator&nbsp;</td><td>Precision X-Ray Irradiation&nbsp;</td><td>X-RAD320</td><td></td></tr></tbody></table>

het visualiseren van dna-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Visualizing DNA Damage Repair Proteins in Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids via Immunofluorescence Assays

Immunofluorescentie is een van de meest gebruikte technieken om doelantigenen met een hoge gevoeligheid en specificiteit te visualiseren, waardoor de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van eiwitten, glycanen en kleine moleculen mogelijk is. Hoewel deze techniek goed ingeburgerd is in tweedimensionale (2D) celcultuur, is er minder bekend over het gebruik ervan in driedimensionale (3D) celmodellen. Eierstokkankerorganoïden zijn 3D-tumormodellen die de klonale heterogeniteit van tumorcellen, de micro-omgeving van de tumor en cel-cel- en cel-matrixinteracties samenvatten. Ze zijn dus superieur aan cellijnen voor de evaluatie van medicijngevoeligheid en functionele biomarkers. Daarom is het vermogen om immunofluorescentie te gebruiken op primaire eierstokkankerorganoïden uiterst gunstig voor het begrijpen van de biologie van deze kanker. De huidige studie beschrijft de techniek van immunofluorescentie om DNA-schadehersteleiwitten te detecteren in hoogwaardige sereuze patiënt-afgeleide ovariumkankerorganoïden (PDO's). Na blootstelling van de BOB's aan ioniserende straling, wordt immunofluorescentie uitgevoerd op intacte organoïden om nucleaire eiwitten als foci te evalueren. Beelden worden verzameld met behulp van z-stack imaging op confocale microscopie en geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde foci-telsoftware. De beschreven methoden maken de analyse van temporele en speciale rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten en colocalisatie van deze eiwitten met celcyclusmarkers mogelijk.

Het gepresenteerde protocol kan met succes nucleaire DNA-schadehersteleiwitten in organoïden kleuren, visualiseren en kwantificeren. Deze techniek werd gebruikt om BOB's zowel voor als na de bestraling te kleuren en te evalueren. BOB's werden blootgesteld aan 10 Gy straling en geëvalueerd op de volgende biomarkers: ɣ-H2AX (figuur 1), een marker van DNA-schade; RAD51 (figuur 2), een marker voor HRR; 53BP1, een marker van NHEJ; RPA, een marker van replicatiestress...

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Immunofluorescence is one of the most widely used techniques to visualize target antigens with high sensitivity and specificity, allowing for the accurate ...

De studie van de DNA-schaderespons is noodzakelijk om de pathofysiologie van potentiële biomarkers van eierstokkanker in nieuwe gerichte therapie te begrijpen. Deze techniek zorgt ervoor dat het monster intact blijft en maakt het mogelijk om antigenen op hun werkingslocatie te onderzoeken. Dit protocol is snel en kan worden aangepast aan elk antigeen dat vatbaar is voor immunofluorescentie.Deze methode geeft inzicht in eierstokkanker en DNA-schadeherstelprocessen die betrokken zijn bij chemotherapeutische en PARP-remmerresistentie. Deze methoden kunnen worden toegepast op andere studiegebieden met betrekking tot het gebruik van 3D-culturen en organoïden. Om te beginnen, zuig de media van de bestraalde en geïncubeerde organoïden zonder de 3D-matrix te verstoren.Was vervolgens met 300 microliter PBS. Fixeer de organoïden gedurende 10 minuten in 300 microliter 2% paraformaldehyde. Was na het fixeren de organoïden met 300 microliter kleuringsbuffer en plaats ze gedurende vijf minuten op een shaker.Permeabiliseer vervolgens de organoïde door voorzichtig 300 microliter permeabilisatiebuffer toe te voegen. Verwijder na 20 minuten incubatie de buffer en was met 300 microliter kleuringsbuff

visualizing-dna-damage-repair-proteins-patient-derived-ovarian-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video describes a protocol to detect radiation-induced DNA repair foci in the colon cancer cell lines using immunofluorescence staining. DNA repair proteins get activated at the DNA damage site; therefore, we can detect them using specific antibodies and visualize them under a fluorescence microscope.

Assessing DNA Damage Foci: To Identify Radiation-Induced DNA Damage Foci in Cancer Cell Line Using Immunofluorescence Staining

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Hier beschrijven we een op immunofluorescentie gebaseerde methode om de niveaus van enkelstrengs DNA in cellen te kwantificeren. Deze efficiënte en reproduceerbare methode kan worden gebruikt om replicatiestress te onderzoeken, een gemeenschappelijk kenmerk bij verschillende eierstokkankers. Bovendien is deze test compatibel met een geautomatiseerde analysepijplijn, wat de efficiëntie verder verhoogt.

Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Dit protocol biedt een systematisch kader voor de oprichting van organoïden van eierstokkanker uit verschillende ziektestadia en pakt de uitdagingen van patiëntspecifieke variabiliteit aan om de opbrengst te verhogen en robuuste uitbreiding op lange termijn mogelijk te maken voor volgende toepassingen. Het bevat gedetailleerde stappen voor weefselverwerking, zaaien, het aanpassen van mediavereisten en immunofluorescentiekleuring.

Strategie voor biobanking van organoïden van eierstokkanker: aanpak van de heterogeniteit tussen patiënten tussen histologische subtypes en ziektestadia

De bepaling van de komeet is een efficiënte methode om op te sporen DNA schade met inbegrip van single- en double-stranded DNA breekt. We beschrijven alkalisch en neutraal komeet testen voor het meten van DNA-beschadiging in kankercellen het therapeutische effect van chemotherapie te beoordelen.

Evaluatie van de In Vitro DNA schade, met behulp van komeet Assay

Leer DNA-schadeherstel in eierstokkanker organoïden visualiseren via immunofluorescentie. Deze methode helpt onderzoekers resistentie tegen chemotherapie en PARP-remmers te bestuderen.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Meer video's verkennen