Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters
3 februari 2023
Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.
Dit protocol is relevant voor de isolatie van endotheelcellen uit weefselmonsters of zeer kleine stukjes bloedvaten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het in elk onderzoekslaboratorium kan worden gereproduceerd en het maakt het mogelijk om een goede zuiverheid van endotheelcellen te verkrijgen, zelfs uit zeer kleine monsters. Begin met het voorbereiden van het longparenchymmonster door de verzamelde monsters te wassen in een buis van 50 milliliter met PBS zonder calciumchloride en magnesiumchloride, of PBS minus min.
Breng de monsters over in een steriele petrischaal en hak handmatig in kleine fragmenten van ongeveer drie tot vier millimeter met een chirurgische schaar. Voor het slagadersegment, was de verzamelde monsters in een buis van 50 milliliter met PBS minus minus minus en breng het over in een steriele petrischaal zonder te hakken. Om het grootste deel van het resterende bloed te verwijderen, geeft u twee wasbeurten PBS minus minus aan het in blokjes gesneden longparenchym of het longslagadersegment.
Plaats vervolgens de monsters in buizen van 15 milliliter en incubeer met vijf milliliter type II collagenase gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Om de grote fragmenten te verwijderen, plaatst u een steriele zeef van één millimeter maaswijdte op de bovenkant van de 50 milliliter verzamelbuis en giet u de volledige inhoud van de 15 milliliterbuis op de zeef. Masseer vervolgens het verteerde weefsel voorzichtig met een spatel voordat u het monster spoelt met PBS minus minus totdat de verzamelbuis is gevuld.
Om niet-vasculaire endotheelcellen te verwijderen, filtert u de uitstroom verzameld uit verteerde cellen in een verse buis van 50 milliliter met behulp van een 70 micrometer maasgrote celzeef. Verzamel vervolgens met behulp van een 40 micrometer maasgrote celzeef de uitstroom in een verse buis van 50 milliliter met het label Tube 1. Centrifugeer de monsters bij 30 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om de celclusters te bezinken.
Gebruik een steriele pipet om het supernatant over te brengen naar een verse buis van 50 milliliter met het label Tube 2. Suspensie de pellet in buis 1 en vul de buis tot 50 milliliter met PBS minus min. Vul op dezelfde manier Tube 2 tot 50 milliliter met PBS minus min.
Als u klaar bent, centrifugeert u de monsters gedurende vijf minuten bij 300 G bij kamertemperatuur. Suspensie de pellets met twee milliliter groeimedium en zaai de suspensie in twee afzonderlijke putjes van een voorgecodeerde plaat met zes putten. Er werd waargenomen dat een deel van de behandelde celaggregaten, waaronder de gladde spiercellen of SMC's en fibroblasten, gebonden waren aan lange vezels.
Ook vertegenwoordigden SMC's de meerderheid van de niet-bloedcel singlets. Kleine compacte clusters van cellen met een diameter van niet meer dan 10 tot 20 micrometer waren zonder elementen die toe te schrijven waren aan fragmenten van stromaal weefsel. Ongeveer 70% zuivere menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen, of HLMVEC, enkele cellen werden verkregen.
Bij het verkrijgen van zuivere HLMVEC-preparaten namen de gesorteerde cellen de karakteristieke endotheelachtige vorm aan. Bij focale microscopie bleek dat bijna 100% van de gezuiverde cellen van het vet positief kleurden voor endotheelcelantigenen, namelijk CD31 en de meer specifieke von Willebrand-factor. Wanneer deze cellen in matrigel zaten, genereerden ze buisvormige structuren en HUVECs, wat hun endotheelfenotype bevestigde.
Vanwege de korte incubatietijd tijdens de enzymatische vertering is het belangrijk om het collagenase voor te verwarmen. En een ander punt is dat het tijdens de sedimentatie van celclusters belangrijk is om het supernatant voorzichtig te verwijderen zonder de celaggregaten in het pallet aan te raken. Deze procedure is gebaseerd op het gebruik van centrifugatie en filtraties, en zou daarom nieuwe inzichten kunnen opleveren om andere celtypen te scheiden op basis van hun kenmerken, zoals grootte en clustering.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor het isoleren van pulmonale endotheelcellen, wat essentieel is voor het onderzoeken van longontsteking. De methode levert endotheelcellen van hoge zuiverheid op uit zowel macrovasculaire als microvasculaire bronnen.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Vasculaire biologie
- Onderzoek naar longontsteking
Achtergrond
- Endotheelcellen spelen een sleutelrol bij longontsteking.
- Isolatietechnieken kunnen variëren in efficiëntie en zuiverheid.
- Hoge reproduceerbaarheid in laboratoriumomstandigheden is cruciaal voor consistente resultaten.
Gebruikte methoden
- Enzymatische digestie met gebruik van type II collagenase
- Humane microvasculaire endotheelcellen van de long (HLMVEC)
- Centrifugatie- en filtratietechnieken
Belangrijkste resultaten
- Een hoge opbrengst van ongeveer 70% gezuiverde HLMVEC werd bereikt.
- Gezuiverde cellen vertoonden een typische endothele morfologie en kleurden positief voor endothele markers.
- De techniek maakt de isolatie van zuivere endotheelcellen mogelijk, wat potentieel inzicht biedt in celseparatie op basis van grootte en clustering.
Conclusies
- Het protocol bevordert het begrip van de biologie van endotheelcellen in longonderzoek.
- Het is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van mechanismen van longontsteking en vasculaire gezondheid.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Betrouwbare isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen uit longweefsel maakt de ontwikkeling van ziekte-relevante modellen en mechanische risicoreductie in vroege fasen van biofarmaceutische R&D mogelijk. Toegang tot hoogzuivere, locatie-specifieke endotheelcellen ondersteunt het voorspellende vertrouwen in studies naar vasculaire biologie en translationeel onderzoek. Deze mogelijkheid vult hiaten in het portfolio waar commerciële cellenbronnen of biobanken onvoldoende zijn voor genotype- of ziektespecifieke onderzoeken.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar de functie van endotheelcellen in ziekte-relevante contexten mogelijk.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door zuivere celpopulaties te leveren voor route-analyse.
- Faciliteert targetvalidatie door directe bestudering van site-specifieke endotheel-fenotypes mogelijk te maken.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde primaire cellen voor een robuuste assayontwikkeling en compoundscreening.
- Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay door contaminatie met niet-endotheliale cellen te minimaliseren.
- Maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van endotheliale responsen op kandidaat-therapeutica.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Rijgt in vitro modellen uit in lijn met ziekterelevante humane vasculaire biologie.
- Ondersteunt de ontdekking van translationele biomarkers door studies op primaire humane endotheelcellen mogelijk te maken.
- Faciliteert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in onderzoek naar vasculaire en inflammatoire ziekten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit isolatieprotocol bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en de ontwikkeling van preklinische modellen, waardoor downstream screening en translationele studies mogelijk worden.
- Discovery Biology: Levert zuivere endotheelcellen voor hypothesetoetsing en het verhelderen van signaalpaden.
- Screening: Levert gestandaardiseerde celpopulaties voor reproduceerbare assayplatforms.
- Analytics: Levert kwantitatieve resultaten zoals zuiverheid, markerexpressie en functionele buisvorming.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen met behulp van ziekte- en genotype-specifieke cellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een reproduceerbare, schaalbare methode die aanpasbaar is aan diverse behoeften binnen vasculair onderzoek.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in vasculaire studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert celisolatie, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen laboratoria wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door relevante biologische modellen vroeg in de pijplijn te bieden.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door gaten in de beschikbaarheid van ziekte- en genotype-specifieke cellen op te vullen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking en celkweektechnieken.
- Toegang tot basisinstrumentatie voor celbiologie, zoals centrifuges en steriele werkruimtes, is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor een consistente celzuiverheid en fenotype.
- Aanpasbaar aan verschillende weefselbronnen, maar optimalisatie van het protocol kan nodig zijn voor andere organen.
- Korte enzymatische digestietijden en zorgvuldige behandeling zijn cruciaal voor de cellevensvatbaarheid en zuiverheid.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Sample Preparation and Enzymatic Digestion
1:47
Recovery of the Digested Cells and Removal of Non-Endothelial Cells (EC) by Filtration
2:32
Sedimentation of Cell Clusters and Cell Seeding
3:16
Results: Purification and Characterization of Freshly Isolated HLMVECs
4:30
Conclusion
