Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse
5 mei 2023
De huidige studie beschrijft een protocol om de veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) tijdens virale infectie te volgen met behulp van een real-time celanalysesysteem (RTCA).
Dit protocol maakte de continue detectie van voorbijgaand effect mogelijk in de vorm van enkele morfologische veranderingen tijdens een virale infectie, zoals loslating en zweven van aanhangende cellen. Dit protocol maakte een niet-invasieve en niet-arbeidsintensieve aanpak mogelijk voor het continu monitoren van cellulaire morfologische veranderingen en het vastleggen van voorbijgaande effecten zoals vasculaire lekkage die konden worden gemist door een eindpunttest. Dit protocol kan worden gebruikt om vasculaire integriteitsveranderingen van andere cellijnen in verschillende experimentele opstellingen te analyseren als de cellen hechtende cellen zijn.
Nadat u de HUVEC's hebt voorbereid, start u de RTCA-softwaretoepassing door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad. Typ de gebruikersnaam en het wachtwoord in het inlogvenster. Plaats een RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.
Ga vervolgens naar het tabblad Experimentnotities van de RTCA-software en typ de naam van het experiment, het serienummer van het apparaat en het apparaattype. Markeer op het tabblad Lay-out onder het celtabblad van de RTCA-software alle putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld. Open vervolgens het planningstabblad van de RTCA-software.
Klik op Step_1 en stel sweeps in op 10 en interval op 30 seconden. Klik vervolgens op doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om de verificatierun te starten. Open na het uitvoeren het tabblad Celindex om de gegevens te controleren.
Alle celindexwaarden moeten lager zijn dan 0,063. Controleer vervolgens de onbewerkte scangegevens in het onderste deel van het tabblad Celindex op herhaalde waardepatronen zoals beschreven in het manuscript. Om de verificatierun te voltooien, klikt u op de plaat en selecteert u de ontgrendelingsplaat.
Verwijder de RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes van het RTCA-station. Om achtergrondinformatie over RTCA te verkrijgen, wast u de collageentype één gecoate gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat twee keer met 60 microliter HBSS per putje. Gooi de resterende HBSS weg en voeg 50 milliliter extracellulaire matrix per putje toe.
Plaats vervolgens de plaat in het RTCA-station in de celkweekincubator met de A1-put naar binnen gericht. Typ op het tabblad exp-notities van de RTCA-software de naam van het experiment, het serienummer van het apparaat en het apparaattype. Navigeer naar het celtabblad van de RTCA-software en selecteer het tabblad Lay-out.
Markeer de te gebruiken putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld. Ga nu naar het tabblad schema van de RTCA-software. Klik op Step_1 en klik op start of doorgaan in de linkerbovenhoek om een achtergrondinformatie te krijgen.
De plaat is nu klaar voor het zaaien van cellen en het verwijderen van het RTCA-station. Zaai daarna 10 tot de vierde cellen per putje HUVEC's in de gouden micro-elektrodeplaat met 50 microliter per putje geconditioneerd medium. Plaats de plaat terug in het RTCA-station in de celkweekincubator, met de A1-put naar binnen gericht.
Klik vervolgens op het tabblad Planning van de software op een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_2. Wijzig de sweeps in 601, het interval in twee minuten en klik op toepassen.
Klik op Step_2 en klik op start of doorgaan in de linkerbovenhoek van de software. Na 20 uur incubatie, wanneer de celindexwaarden in het tabblad Brongrafiek een plateau laten zien, is de plaat klaar voor infectie. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op stap afbreken.
De plaat is nu klaar om van het RTCA-station te worden verwijderd. Om de HUVEC's te infecteren, haalt u de Zika-virusvoorraad uit de vriezer van min 80 graden Celsius. Verdun de Zika-virusvoorraad met serumvrije extracellulaire matrix in centrifugebuisjes van 1,5 milliliter om multipliciteiten van infectie van 0,1 en één te bereiken.
Gooi vervolgens het geconditioneerde medium uit elke put weg en spoel elke put met 60 microliter HBSS terwijl u de zijkant van de put gebruikt. Voeg 40 microliter verdund virusmonster toe aan het putje, beginnend van de hoogste naar de laagste verdunning, met behulp van de zijkant van het putje. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om virusabsorptie mogelijk te maken.
Draai de plaat elke 15 minuten vijf keer rond om virusabsorptie door de monolaag van de cel mogelijk te maken. Verwijder na een uur incubatie de virussuspensie van de laagste naar de hoogste concentratie en gooi deze weg. Was de geïnfecteerde cellen twee keer met 60 milliliter HBSS.
Bedek de putjes met extracellulaire matrix aangevuld met 2%FBS. Verdun voor de positieve controleputjes de trombine in 20 eenheden per milliliter met extracellulaire matrix aangevuld met 2% FBS, en bedek de putjes met trombinehoudend extracellulair matrixmedium, met behulp van de zijkant van het putje. Klik nu op het tabblad planning en voeg een stap toe in de linkerbovenhoek.
Navigeer naar Step_3 en wijzig de sweeps in 3.601 en het interval in twee minuten. Klik op toepassen en klik vervolgens op OK in het pop-upvenster. Plaats de geïnfecteerde gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de kweekincubator.
Klik ten slotte op Step_3 en klik op doorgaan in de linkerbovenhoek van de software. De celindexwaarde van HUVEC's geïnfecteerd met Zika-virus P6-740 bij een infectieveelvoud van 0,1 begon 15 uur na infectie te dalen in vergelijking met de negatieve infectiecontrole. De HUVEC's die waren geïnfecteerd met een hogere dosis Zika-virus P6-740 bij een multipliciteit van infectie van één, vertoonden een daling van de celindex 11 uur na infectie.
24 uur na infectie was er een daling van 5% en 7% in de genormaliseerde celindexwaarde wanneer de endotheelcellen werden geïnfecteerd met een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één. Een vermindering van 50% van de genormaliseerde celindexwaarde werd geregistreerd 96 uur na infectie en 66,75 uur na infectie na infectie bij een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één. De genormaliseerde celindexwaarde bereikte zijn laagste punt 107 uur na infectie, met een reductie van 51% en 60% bij infectie bij een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één.
De genormaliseerde celindexwaarde bleek een toename van 4% en 13% te hebben vanaf 107 uur na infectie tot het einde van het experiment 168 uur na infectie. Voorafgaand aan elk RTCA-experiment is een weerstandsverificatie met behulp van de RTCA-plaat met 96 putjes essentieel om ervoor te zorgen dat elke biosensor goed werkt om betrouwbare celindexwaarden te produceren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het monitoren van morfologische veranderingen in menselijke endotheliale cellen van de navelstrengvene (HUVECs) tijdens een virale infectie met behulp van een real-time cell analysis (RTCA) systeem. Via dit protocol wordt een niet-invasieve en continue detectie van transiënte effecten, zoals celdetachement en vasculaire lekkage, gerealiseerd, wat inzicht biedt in de vasculaire integriteit.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Effecten van virale infecties op endotheelcellen
- Real-time celanalysetechnologie
- Beoordeling van vasculaire integriteit
Achtergrond
- Belang van het monitoren van endotheliale celrespons tijdens virale infecties
- Beperkingen van traditionele eindpuntassays
- Behoefte aan niet-invasieve monitoringmethoden
Gebruikte methoden
- Real-time celanalyse (RTCA) voor continue monitoring
- Humane navelstrengader-endotheelcellen (HUVECs)
- Intraveneuze toediening van het Zika-virus bij verschillende multipliciteiten van infectie
Belangrijkste resultaten
- Detectie van morfologische veranderingen en dalingen in de celindex na infectie
- Normale reducties van de celindex van 5% tot 50% waargenomen op verschillende tijdstippen
- Het protocol maakt analyse van vergelijkbare cellijnen onder verschillende condities mogelijk
Conclusies
- De studie demonstreert een robuuste methode voor het bestuderen van de respons van endotheelcellen op virale infecties.
- Dit protocol levert waardevolle inzichten in de vasculaire biologie en ziektemechanismen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Continue, op impedantie gebaseerde monitoring van de integriteit van endotheelcellen maakt vroege detectie van barrièreverstoring tijdens virale infecties mogelijk, wat de voorspellende betrouwbaarheid in vasculair biologisch onderzoek ondersteunt. Deze benadering van real-time celanalyse (RTCA) beantwoordt aan de behoefte aan niet-invasieve, kwantitatieve beoordeling van transiënte cellulaire responsen, die cruciaal zijn voor het beperken van risico's bij targets en het informeren van de identificatie van lead-verbindingen in pipelines voor infectieziekten. De methode verbetert de besluitvorming over portfolio's door robuuste, reproduceerbare gegevens te leveren over de endotheelbarrièrefunctie onder pathogene uitdaging.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van de verstoring van de endotheelbarrière door virale agentia mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door transiënte morfologische veranderingen in real-time vast te leggen.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor signaalpaden van vasculaire integriteit.
- Levert gegevens om targets te prioriteren op basis van dynamische cellulaire responsen.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde, reproduceerbare meetwaarden voor de gezondheid en permeabiliteit van endotheelcellen.
- Standaardiseert assay-condities voor high-throughput screening van barrière-modulerende verbindingen.
- Genereert kwantitatieve cell-index outputs die geschikt zijn voor vergelijkende analyse.
- Maakt betrouwbare evaluatie mogelijk van kandidaat antivirale middelen of biologics die de vasculaire integriteit beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro endotheliale responsen uit met ziekterelevante fenotypen van vasculaire lekkage.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie van vasculaire targets.
- Levert voorspellende data voor de risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van therapeutische kandidaten.
- Faciliteert de ontwikkeling van biomarkers voor eindpunten van vasculaire integriteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit RTCA-protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar prekliniek door real-time, kwantitatieve monitoring van endotheliale celresponsen op virale infectie mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten over virale mechanismen van barrièreverstoring en endotheliale dysfunctie.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve cellindex-metingen voor assay-gereedheid en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking van infectiecondities en dosisafhankelijke effecten op de celintegriteit mogelijk.
- Translationeel Onderzoek: Slaat een brug tussen in vitro bevindingen en preklinische modellen van vasculair lekken en biomarker-afstemming.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar platform voor diverse adherente celtypen en experimentele opstellingen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in studies naar de endotheelbarrière en vermindert mechanische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Verbeterde standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van celgebaseerde assays.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het vroegtijdig leveren van bruikbare gegevens over vasculaire targets.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van kandidaten die de vasculaire integriteit beïnvloeden.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in celkweek en de bediening van assays op basis van impedantie.
- Toegang tot RTCA-instrumentatie en compatibele gouden microelektrodeplaten is noodzakelijk.
- Stelt een strikte standaardisatie van de assay-opzet en data-analyse tussen teams vereist.
- Aanpasbaar aan andere adherente celmodellen door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van biosensorverificatie en kwaliteitscontrole voor betrouwbare resultaten.
