Name: Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Leer het monitoren van morfologische veranderingen in HUVECs tijdens virale infectie met behulp van real-time celanalyse. Deze niet-invasieve methode detecteert celafstoting en vasculaire lekkage continu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-programma (MO002-2019) en financiering in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).

1. Voorbereiding van de cel
<ol><li>Voorbereiding van HUVEC's<ol><li>Kweek 7,5 x 105 HUVEC-cellen/ml in een celkweekkolf van 75 cm2 (gecoat met 20 μg/ml collageen type 1) met 12 ml endotheelcelmedium (ECM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 0,01% endotheelcelgroeisupplement (ECGS) dat groeifactoren, hormonen en eiwitten bevat die nodig zijn voor de kweek van HUVEC's, en 0,01% penicilline-streptomycine (P/S). Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 (figuur 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Opzet van het RTCA-experiment
<ol><li>Weerstandsverificatie uitgevoerd op RTCA<ol><li>Dubbelklik op het RTCA-softwarepictogram op het bureaublad om de applicatie te starten. Er verschijnt een inlogvenster, typ de gebruikersnaam en het wachtwoord in om in te loggen.</li>
		<li>Plaats een RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.</li>
		<li>Typ op het tabblad Exp-notities van de RTCA-software de naam van het experiment, de SN van het apparaat en het apparaattype (QC-plaat).</li>
		<li>Markeer op het tabblad Lay-out onder het tabblad Cel van de RTCA-software alle putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld (grijs).</li>
		<li>Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Step_1. Voer sweeps in: 10 en interval: 30 s. Klik op Toepassen. Klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om de verificatierun te starten. NOTITIE: Zorg ervoor dat de aansluiting van de putten op het RTCA-station in orde is door te kijken naar "Plate Scanned. Aansluitingen OK" onderaan de pagina.</li>
	</ol></li>
	<li>Weerstandsverificatie uitgevoerd voor gegevensanalyse<ol><li>Controleer op het tabblad Celindex de gegevens na voltooiing van de uitvoering. Alle CI-waarden moeten lager zijn dan 0,063.</li>
		<li>Controleer in het onderste gedeelte van het tabblad Celindex de onbewerkte scangegevens. De onbewerkte scangegevens moeten herhaalde waardepatronen vertonen van 40,0 ± 2,0 (rijen A en H), 67,5 ± 2,5 (rijen B en G), 93,6 ± 2,9 (rijen C en F) en 117,6 ± 3,2 (rijen D en E).</li>
		<li>Als u de verificatierun wilt stoppen, klikt u op Plate > Release Plate. De RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes is nu klaar om van het RTCA-station te worden verwijderd.</li>
	</ol></li>
	<li>Achtergrondinformatie verkrijgen over RTCA<ol><li>Was de collageen type 1 gecoate gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat (gecoat met 20 μg/ml collageen type 1) met 60 μL/putje van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS; met natriumbicarbonaat, zonder calciumchloride en magnesiumsulfaat) 2x.</li>
		<li>Gooi de resterende HBSS weg en voeg 50 μL/putje ECM toe. Plaats de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met ECM met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.</li>
		<li>Typ op het tabblad Exp Notes van de RTCA-software de naam van het experiment, de SN van het apparaat en het apparaattype (indeling met 96 putjes).</li>
		<li>Markeer op het tabblad Lay-out onder het tabblad Cel van de RTCA-software de putten die zullen worden gebruikt en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld (grijs).</li>
		<li>Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Step_1 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om een achtergrondinformatie te verkrijgen. NOTITIE: Zorg ervoor dat de aansluiting van de putten correct is door te kijken naar "Plate Scanned. Aansluitingen OK" onderaan de pagina.</li>
		<li>Zodra de achtergrondmeting is verkregen, is de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat nu klaar voor celzaaien en klaar om te worden verwijderd uit het RTCA-station.</li>
	</ol></li>
	<li>HUVEC-bereiding in de gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat<ol><li>Zaai de HUVEC's in de gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat met 50 μL/putje geconditioneerd medium, 1 x 104 cellen/putje (geconditioneerd medium: ECM aangevuld met 10% FBS, 0,01% ECGS en 0,01% P/S). Plaats de plaat terug in het RTCA-station met de A1-put naar binnen gericht voor een nachtelijke incubatie in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2. OPMERKING: Er werd een celtelling uitgevoerd op de celsuspensie met een verdunningsfactor van twee met behulp van een hemocytometer.</li>
		<li>Klik op het tabblad Planning op Een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_2 en wijzig de Sweeps: 601 en Interval: 2 min. Klik op Toepassen. Klik op Step_2 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software.</li>
		<li>Na 20 uur incubatie en wanneer de CI-waarden in het tabblad Well Graph een plateau laten zien, is de plaat klaar voor infectie. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op Stap afbreken.</li>
		<li>De gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat is nu klaar om uit het RTCA-station te worden verwijderd voor verdere stappen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Virale infectie bij HUVEC's
<ol><li>Verdunning van het virus<ol><li>De ZIKV-stamcultuur wordt op -80 °C gehouden. Verwijder voor dit onderzoek de virusvoorraad die in de cryogene injectieflacons wordt bewaard en verdun de ZIKV-voorraad met serumvrije ECM in centrifugebuisjes van 1,5 ml om een multipliciteit van infecties (MOI's) van 0,1 en 1 te bereiken. OPMERKING: De ZIKV-voorraad werd eerder bereid door vermeerdering uit te voeren in Vero-cellen en het ZIKV-supernatans34 te oogsten.</li>
	</ol></li>
	<li>Infectie van de celmonolaag<ol><li>Verwijder het geconditioneerde medium (ECM aangevuld met 10% FBS, 0,01% ECGS en 0,01% P/S) uit elk putje en gooi het weg. Spoel elk putje 2x met 60 μL HBSS. Plaats de HBSS met behulp van de zijkant van het putje; Schiet niet op de monolaag van de cel.</li>
		<li>Werk van de hoogste naar de laagste verdunning en voeg 40 μL van elk verdund virusmonster in serumvrije ECM toe aan het putje. Verdrievoudig het putje voor elke verdunning en behoud zes putjes zonder infectie (negatieve controle en positieve controle trombine). Schiet niet op de monolaag van de cel; Voeg in plaats daarvan het verdunde virus toe met behulp van de zijkant van het putje. Gebruik voor elke inbrenging een nieuwe pipetpunt. OPMERKING: Trombine werd gekozen als positieve controle omdat het de endotheelpermeabiliteit van HUVEC's snel kan verhogen.</li>
		<li>Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 °C met 5% CO2 om virusadsorptie mogelijk te maken. Draai de plaat 5x per 15 minuten om virusadsorptie door de monolaag van de cel mogelijk te maken.</li>
	</ol></li>
	<li>Toevoeging van het overlay celkweekmedium<ol><li>Verwijder na 1 uur incubatie de virussuspensie van de laagste concentratie naar de hoogste concentratie en gooi deze weg.</li>
		<li>Was de geïnfecteerde cellen met 60 μL HBSS 2x. Bedek het putje met ECM aangevuld met 2% FBS. Verdun voor de positieve controleputjes de trombine tot 20 E/ml met ECM aangevuld met 2% FBS en bedek de putjes met trombinehoudend ECM-medium. Schiet niet op de monolaag van de cel; Voeg in plaats daarvan overlay-media toe met behulp van de zijkant van de put.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaatsing van de geïnfecteerde gespecialiseerde goud-micro-elektrodeplaat terug in het RTCA-station<ol><li>Klik op het tabblad Planning op Een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_3 en wijzig de Sweeps: 3.601 en Interval: 2 min. Klik op Toepassen.</li>
		<li>Klik op OK in het pop-upvenster dat verschijnt. Plaats de geïnfecteerde gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.</li>
		<li>Klik op Step_3 en klik op Start/Doorgaan in de linkerbovenhoek van de software.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Data-analyse en data-export
<ol><li>Toevoeging van experimentele informatie van elk putje<ol><li>Klik op het tabblad Lay-out op het tabblad Cel (Figuur 2A). Om de informatie over de doelcel in te voeren en het puttype voor elk putje te bepalen, markeert u het putje en typt u de naam, het nummer en de kleur van de doelcel onder aan de software. Klik op Toepassen (Afbeelding 2B).</li>
		<li>Als u het puttype voor elk putje op het tabblad Cel wilt selecteren en bepalen, markeert u het putje , selecteert u het puttype (monster, positieve controle of negatieve controle) en klikt u op Instellen.</li>
		<li>Klik in het tabblad Lay-out op het tabblad Behandeling (Figuur 2C). Om behandelingsinformatie in te voeren, markeert u het putje en typt u de naam van de behandeling, de concentratie van de behandeling, de eenheid en de kleur in. Klik op Toepassen (Afbeelding 2D).</li>
		<li>Als u het puttype voor elk putje op het tabblad Behandeling wilt selecteren en bepalen, markeert u het putje, selecteert u het puttype (monster, positieve controle of negatieve controle) en klikt u op Instellen. OPMERKING: Voor elke selectie kunnen meerdere putjes tegelijkertijd worden gemarkeerd.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalisatie van CI-waarde<ol><li>Klik met de rechtermuisknop op het tabblad Gegevensanalyse en selecteer Genormaliseerde celindex in de vervolgkeuzelijst Y-as (Afbeelding 3A). Selecteer in het gedeelte X-as onderaan de genormaliseerde tijd als het laatst gemeten tijdstip waarop de gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat is verwijderd voor infectie (Figuur 3B). OPMERKING: Het normalisatieproces dat door de software wordt uitgevoerd, verwijdert het grootste deel van de variabiliteit als gevolg van de verschillen in putzaaiing en aanhechting, zolang het gekozen normalisatiepunt vóór de toevoeging van het virus en/of de behandeling ligt. Daarom moet het optimale normalisatietijdstip het laatste tijdstip zijn vóór toevoeging van het virus en/of de behandeling. Het tijdstip waarop moet worden genormaliseerd, kan worden gecontroleerd op het tabblad Planning onder Step_2. De totale aangegeven tijd is het tijdstip waarop moet worden genormaliseerd (Figuur 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Verkregen gegevens plotten met behulp van RTCA-software<ol><li>Selecteer op het tabblad Gegevensanalyse de putten die aan de grafiek moeten worden toegevoegd door de putten te markeren en op << Toevoegen te klikken. De genormaliseerde celindex ten opzichte van de tijdgrafiek is nu klaar om te worden gekopieerd en geëxporteerd. Zorg ervoor dat u het selectievakje Gemiddeld aanvinkt.</li>
	</ol></li>
	<li>Gegevens exporteren met RTCA-software<ol><li>Klik in de linkerbovenhoek van de RTCA-software op Plate > Export Experiment Info.... Vink het vakje aan om de gegevens te selecteren die u wilt exporteren. Klik op OK. OPMERKING: Onbewerkte gegevens (onbewerkte CI-waarden) kunnen worden geëxporteerd wanneer Celindex > Alles is aangevinkt.</li>
		<li>Selecteer de map om het exportbestand op te slaan. Klik op OPSLAAN. Er verschijnt een pop-upvenster dat het exporteren van experimentele informatie aangeeft. Zodra het exporteren is voltooid, verschijnt er een ander venster dat aangeeft dat de geëxporteerde experimentinformatie klaar is om te worden bekeken.</li>
	</ol></li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Cytocide virale infectie in permissieve cellen wordt meestal geassocieerd met substantiële veranderingen in celmorfologie en biosynthese36. De door het virus geïnduceerde cellulaire morfologische veranderingen, zoals celkrimp, celvergroting en/of syncytievorming, staan ook bekend als cytopathische effecten (CPE's), kenmerkend voor bepaalde viraleinfecties37. In EC's werd de CPE beschreven als de vernietiging van cellen en de afbraak van de tight junctions tussen elke EC, wa...

Endotheelcellen (EC's) bekleden het binnenoppervlak van alle bloed- en lymfevaten. Ze zijn verbonden door adherens, tight gap junctions, waardoor een semi-permeabele barrière ontstaat tussen bloed of lymfe en de omliggende weefsels 1,2. De intacte endotheelcel-celverbindingen zijn van cruciaal belang voor het reguleren van het transport van macromoleculen, opgeloste stoffen en vloeistoffen, cruciaal voor de fysiologische activiteiten van de overeenkomstige weefsels en organen. De endotheelbarrière is dynamisch en wordt gemoduleerd door specifieke stimuli4. Verstoring of verlies van de endotheliale barrièrefunctie is een kenmerk van de pathofysiologie van de ziekte bij acute en chronische ontsteking in de pathogenese van vele ziekten 5,6,7, waaronder virale infectie 8,9,10,11. Voor flavivirussen werd gevonden dat het niet-structurele eiwit NS1 de endotheliale permeabiliteit kan veranderen, bijvoorbeeld via verstoring van de endotheliale glycocalyx-achtige laag als gevolg van verhoogde expressie en activering van cathepsine L, sialidasen en endoglycosidase heparinase9. In de ziektetoestand wordt de integriteit van de endotheliale monolaag aangetast en worden cel-celverbindingen verstoord, wat kan leiden tot endotheelletsel en disfunctie12 en uiteindelijk wijdverspreide pathologische manifestaties in meerdere orgaansystemen 13,14. Virale infectie van EC's resulteert in veranderingen in de celsignaleringsroutes en het cellulaire genexpressieprofiel, wat de vloeistofbarrièrefuncties kan beïnvloeden, verstoring van de EC's kan veroorzaken en vasculaire lekkage kan veroorzaken10,15. Het is gebleken dat infectie met het Zika-virus (ZIKV) van EC's de junctie-integriteit verstoort die veranderingen in de vasculaire permeabiliteit veroorzaakt en leidt tot disfunctie van de endotheelbarrière, wat resulteert in vasculaire lekkage10,15. Studies hebben aangetoond dat ZIKV verband houdt met ernstige geboorteafwijkingen; Er is echter niet veel bekend over het exacte mechanisme waarmee dit gebeurt16,17. Het begrijpen van veranderingen in de endotheliale barrière tijdens een infectie is daarom van cruciaal belang om het ziektemechanisme te begrijpen.
EC's worden momenteel gebruikt als een belangrijk experimenteel in vitro vasculair modelsysteem voor verschillende fysiologische en pathologische processen 18,19,20,21. Menselijke endotheelcellen van de navelstrengader (HUVEC's) zijn op grote schaal gebruikt als een primair, niet-onsterfelijk celsysteem om het vasculaire endotheel en de vasculaire biologie in vitro te bestuderen 22,23,24,25. HUVEC's werden voor het eerst geïsoleerd voor in-vitrokweek in de vroege jaren 1970 uit de navelstrengader van de menselijke navelstreng26. HUVEC's hebben een geplaveide morfologie die gemakkelijk in het laboratorium kan worden verspreid. Als gevolg van schuifspanning na lange perioden in confluente toestand te zijn gehouden, wordt verlenging van de celvorm waargenomen. HUVEC's kunnen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van Weibel- en Palade-lichamen (WPB), pinocytische blaasjes, kleine hoeveelheden fibrillen in de buurt van de kern, mitochondriën met buisvormige vormen die zelden vertakkingen vertonen, een ellipsoïde kern met een fijn korrelig patroon van gecondenseerd chromatine en één tot drie nucleoli aanwezig in elke kern27. Hoewel HUVEC's talrijke morfologische kenmerken vertonen, kan de identificatie van HUVEC's niet worden bereikt door alleen optisch onderzoek. Assays, zoals immunofluorescentiekleuring van vasculaire endotheliale (VE)-cadherine, worden vaak gebruikt voor de monitoring van vasculaire integriteit in HUVEC's 28,29,30,31.
Deze studie beschrijft het real-time celanalyse (RTCA) protocol van de infectie van HUVEC's. Het RTCA-systeem maakt gebruik van gespecialiseerde met goud beklede platen met micro-elektroden die een geleidend oppervlak bieden voor de celbevestiging. Wanneer de cellen zich hechten aan het oppervlak van de micro-elektrode, wordt een barrière gevormd die de elektronenstroom door de micro-elektroden belemmert. Meting van de impedantie die wordt gegenereerd door micro-elektroden kan worden gebruikt om informatie te verkrijgen over sommige cellulaire processen, waaronder celaanhechtingen, proliferatie en migratie32. De gerapporteerde test is een op impedantie gebaseerde cellulaire test die, in combinatie met een real-time celanalysator, continue meting biedt van de proliferatie van levende cellen, morfologische veranderingen (zoals celkrimp) en celhechtingskwaliteit op een niet-invasieve en labelvrije manier. In deze studie wordt de real-time celanalysator gebruikt om de endotheelintegriteit en morfologische veranderingen van HUVEC's tijdens ZIKV-infectie te monitoren. In het kort meet het instrument de elektronenstroom die wordt overgebracht in gespecialiseerde met goud met micro-elektroden gecoate microtiterplaten in aanwezigheid van een kweekmedium (elektrisch geleidende oplossing). Celhechting of veranderingen in het aantal cellen en de morfologie verstoren de elektronenstroom en veroorzaken impedantievariaties die door het instrument kunnen worden opgevangen (aanvullende figuur 1). Het verschil tussen HUVEC-groei, proliferatie en therapietrouw voor en na ZIKV-infectie wordt in realtime geregistreerd door een elektrisch impedantiesignaal en vervolgens vertaald naar celindex (CI)-waarde. De CI-waarde van de pre-infectie wordt gebruikt als basislijn voor normalisatie van de CI-waarde. De veranderingen in CI-waarden weerspiegelen cellulaire morfologische veranderingen of verlies van celhechting bij de infectie33. De onderzoeksresultaten tonen aan dat het RTCA-protocol de detectie van voorbijgaande effecten of celmorfologische veranderingen tijdens virale infectie mogelijk maakt in vergelijking met een eindpunttest, zoals immunofluorescentiekleuring van VE-cadherine. De RTCA-methode zou nuttig kunnen zijn voor het analyseren van de veranderingen in de vasculaire integriteit van HUVEC bij infectie door andere virussen.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tube</td><td>Nest</td><td>615601</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C incubator met 5% CO2</td><td>Sanyo</td><td>MCO-18AIC</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 weefselkweekkolf&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticumoplossing penicilline-streptomycine (P/S)</td><td>Sciencell</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>Biologische veiligheidskast, Klasse II</td><td>Holten</td><td>HB2448</td><td></td></tr><tr><td>Collagene Type 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Endothelecelgroeisupplement (ECGS)</td><td>Sciencell</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Endothelecelmedium (ECM)</td><td>Sciencell</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>E-plate 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>05232368001</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sciencell</td><td>0025</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometers</td><td>Laboroptik LTD</td><td>Neubauer verbeterd</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelecellen (HUVECs)</td><td>Sciencell</td><td>8000</td><td></td></tr><tr><td>Inverteer microscoop</td><td>ZEISS</td><td>TELAVAL 31</td><td></td></tr><tr><td>Latitude 3520 Laptop</td><td>Dell&nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals micropipet (10 - 100 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals micropipet (30 - 300 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>Reagens reservoir</td><td>Tarsons</td><td>T38-524090</td><td></td></tr><tr><td>RTCA weerstandsplaat 96</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>05232350001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Software Pro (Versie 2.6.1)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>5454433001</td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals pipetten (10 - 100 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals pipetten (100 - 1000 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals pipetten (20 - 200 &micro;L)</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigence Real-time cell analyzer SP (Model: W380)</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>00380601030</td><td>https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232</td></tr></tbody></table>

monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Monitoring Changes in Human Umbilical Vein Endothelial Cells upon Viral Infection Using Impedance-Based Real-Time Cell Analysis

Endotheelcellen bekleden het binnenoppervlak van alle bloed- en lymfevaten en creëren een semi-permeabele barrière die de uitwisseling van vocht en opgeloste stoffen tussen bloed of lymfe en de omliggende weefsels reguleert. Het vermogen van een virus om de endotheelbarrière te passeren is een belangrijk mechanisme dat de verspreiding van virussen in het menselijk lichaam vergemakkelijkt. Van veel virussen wordt gemeld dat ze de permeabiliteit van het endotheel veranderen en/of verstoring van de barrière van endotheelcellen veroorzaken tijdens infectie, wat vasculaire lekkage kan veroorzaken. De huidige studie beschrijft een real-time celanalyse (RTCA) -protocol, waarbij gebruik wordt gemaakt van een commerciële real-time celanalysator om de endotheelintegriteit en permeabiliteitsveranderingen te bewaken tijdens Zika-virus (ZIKV)-infectie van de endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's). De impedantiesignalen die voor en na ZIKV-infectie werden geregistreerd, werden vertaald naar celindexwaarden (CI) en geanalyseerd. Het RTCA-protocol maakt de detectie mogelijk van voorbijgaande effecten in de vorm van celmorfologische veranderingen tijdens een virale infectie. Deze test zou ook nuttig kunnen zijn voor het bestuderen van veranderingen in de vasculaire integriteit van HUVEC's in andere experimentele opstellingen.

Vóór de ZIKV-infectie was de CI die werd geregistreerd voor de HUVEC-monolaag gekweekt op een gespecialiseerde met goud met micro-elektrode gecoate microtiterplaat hoger dan 8, wat wijst op sterke hechtingseigenschappen. Platen of putjes met een CI-index van minder dan 8 moeten worden weggegooid. De HUVEC's werden vervolgens geïnfecteerd met ZIKV met een MOI van 0,1 en 1, en de celimpedantie werd gedurende 7 dagen geregistreerd. De CI-waarde van HUVEC's geïnfecteerd met ZIKV P6-740 bij een MOI van 0,1 (lichtblauwe lijn) ...

De huidige studie beschrijft een protocol om de veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) tijdens virale infectie te volgen met behulp van een real-time celanalysesysteem (RTCA).

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Endothelial cells line the inner surface of all blood and lymphatic vessels, creating a semi-permeable barrier regulating fluid and solute exchange ...

Dit protocol maakte de continue detectie van voorbijgaand effect mogelijk in de vorm van enkele morfologische veranderingen tijdens een virale infectie, zoals loslating en zweven van aanhangende cellen. Dit protocol maakte een niet-invasieve en niet-arbeidsintensieve aanpak mogelijk voor het continu monitoren van cellulaire morfologische veranderingen en het vastleggen van voorbijgaande effecten zoals vasculaire lekkage die konden worden gemist door een eindpunttest. Dit protocol kan worden gebruikt om vasculaire integriteitsveranderingen van andere cellijnen in verschillende experimentele opstellingen te analyseren als de cellen hechtende cellen zijn.Nadat u de HUVEC's hebt voorbereid, start u de RTCA-softwaretoepassing door te dubbelklikken op het pictogram op het bureaublad. Typ de gebruikersnaam en het wachtwoord in het inlogvenster. Plaats een RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de celkweekincubator.Ga vervolgens naar het tabblad Experimentnotities van de RTCA-software en typ de naam van het experiment, het serienummer van het apparaat en het apparaattype. Markeer op het tabblad Lay-out onder het celtabblad van de RTCA-software alle putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld. Open vervolgens het planningstabblad van de RTCA-software.Klik op Step_1 en stel sweeps in op 10 en interval op 30 seconden. Klik vervolgens op doorgaan in de linkerbovenhoek van de software om de verificatierun te starten. Open na het uitvoeren het tabblad Celindex om de gegevens te controleren.Alle celindexwaarden moeten lager zijn dan 0,063. Controleer vervolgens de onbewerkte scangegevens in het onderste deel van het tabblad Celindex op herhaalde waardepatronen zoals beschreven in het manuscript. Om de verificatierun te voltooien, klikt u op de plaat en selecteert u de ontgrendelingsplaat.Verwijder de RTCA-weerstandsplaat met 96 putjes van het RTCA-station. Om achtergrondinformatie over RTCA te verkrijgen, wast u de collageentype één gecoate gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat twee keer met 60 microliter HBSS per putje. Gooi de resterende HBSS weg en voeg 50 milliliter extracellulaire matrix per putje toe.Plaats vervolgens de plaat in het RTCA-station in de celkweekincubator met de A1-put naar binnen gericht. Typ op het tabblad exp-notities van de RTCA-software de naam van het experiment, het serienummer van het apparaat en het apparaattype. Navigeer naar het celtabblad van de RTCA-software en selecteer het tabblad Lay-out.Markeer de te gebruiken putten en klik met de rechtermuisknop op de gemarkeerde putten om ervoor te zorgen dat alle putten zijn ingeschakeld. Ga nu naar het tabblad schema van de RTCA-software. Klik op Step_1 en klik op start of doorgaan in de linkerbovenhoek om een achtergrondinformatie te krijgen.De plaat is nu klaar voor het zaaien van cellen en het verwijderen van het RTCA-station. Zaai daarna 10 tot de vierde cellen per putje HUVEC's in de gouden micro-elektrodeplaat met 50 microliter per putje geconditioneerd medium. Plaats de plaat terug in het RTCA-station in de celkweekincubator, met de A1-put naar binnen gericht.Klik vervolgens op het tabblad Planning van de software op een stap toevoegen in de linkerbovenhoek. Klik op Step_2. Wijzig de sweeps in 601, het interval in twee minuten en klik op toepassen.Klik op Step_2 en klik op start of doorgaan in de linkerbovenhoek van de software. Na 20 uur incubatie, wanneer de celindexwaarden in het tabblad Brongrafiek een plateau laten zien, is de plaat klaar voor infectie. Klik op het tabblad Schema van de RTCA-software op stap afbreken.De plaat is nu klaar om van het RTCA-station te worden verwijderd. Om de HUVEC's te infecteren, haalt u de Zika-virusvoorraad uit de vriezer van min 80 graden Celsius. Verdun de Zika-virusvoorraad met serumvrije extracellulaire matrix in centrifugebuisjes van 1,5 milliliter om multipliciteiten van infectie van 0,1 en één te bereiken.Gooi vervolgens het geconditioneerde medium uit elke put weg en spoel elke put met 60 microliter HBSS terwijl u de zijkant van de put gebruikt. Voeg 40 microliter verdund virusmonster toe aan het putje, beginnend van de hoogste naar de laagste verdunning, met behulp van de zijkant van het putje. Incubeer de plaat in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide om virusabsorptie mogelijk te maken.Draai de plaat elke 15 minuten vijf keer rond om virusabsorptie door de monolaag van de cel mogelijk te maken. Verwijder na een uur incubatie de virussuspensie van de laagste naar de hoogste concentratie en gooi deze weg. Was de geïnfecteerde cellen twee keer met 60 milliliter HBSS.Bedek de putjes met extracellulaire matrix aangevuld met 2%FBS. Verdun voor de positieve controleputjes de trombine in 20 eenheden per milliliter met extracellulaire matrix aangevuld met 2% FBS, en bedek de putjes met trombinehoudend extracellulair matrixmedium, met behulp van de zijkant van het putje. Klik nu op het tabblad planning en voeg een stap toe in de linkerbovenhoek.Navigeer naar Step_3 en wijzig de sweeps in 3.601 en het interval in twee minuten. Klik op toepassen en klik vervolgens op OK in het pop-upvenster. Plaats de geïnfecteerde gespecialiseerde gouden micro-elektrodeplaat met de A1-put naar binnen gericht in het RTCA-station in de kweekincubator.Klik ten slotte op Step_3 en klik op doorgaan in de linkerbovenhoek van de software. De celindexwaarde van HUVEC's geïnfecteerd met Zika-virus P6-740 bij een infectieveelvoud van 0,1 begon 15 uur na infectie te dalen in vergelijking met de negatieve infectiecontrole. De HUVEC's die waren geïnfecteerd met een hogere dosis Zika-virus P6-740 bij een multipliciteit van infectie van één, vertoonden een daling van de celindex 11 uur na infectie.24 uur na infectie was er een daling van 5% en 7% in de genormaliseerde celindexwaarde wanneer de endotheelcellen werden geïnfecteerd met een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één. Een vermindering van 50% van de genormaliseerde celindexwaarde werd geregistreerd 96 uur na infectie en 66,75 uur na infectie na infectie bij een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één. De genormaliseerde celindexwaarde bereikte zijn laagste punt 107 uur na infectie, met een reductie van 51% en 60% bij infectie bij een multipliciteit van infectie van respectievelijk 0,1 en één.De genormaliseerde celindexwaarde bleek een toename van 4% en 13% te hebben vanaf 107 uur na infectie tot het einde van het experiment 168 uur na infectie. Voorafgaand aan elk RTCA-experiment is een weerstandsverificatie met behulp van de RTCA-plaat met 96 putjes essentieel om ervoor te zorgen dat elke biosensor goed werkt om betrouwbare celindexwaarden te produceren.

monitoring-changes-human-umbilical-vein-endothelial-cells-upon-viral

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video protocol illustreert de isolatie en de cultuur van humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) van menselijke navelstreng. Eenmaal geïsoleerd deze cellen kunnen worden gebruikt voor in-vitro angiogenese assays, zoals de Optimized fibrinegel Bead Assay ook aangetoond door de Hughes lab.

Isolatie van de Mens navelstreng endotheel cellen (HUVEC)

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

In dit artikel wordt eerst een procedure voor het isoleren van humane endotheelcellen van de navelstreng aderen en dan laat zien hoe deze cellen te gebruiken om neutrofielen transmigratie onderzoeken op stromingscondities. Door een laag volume stromingskamer gemaakt van een polymeer met de optische eigenschappen van glas levende cellen fluorescerende beeldvorming zeldzame celpopulaties is ook mogelijk.

Isolatie van humane navelstreng endotheel cellen en hun gebruik in de studie van de neutrofielen transmigratie onder stroomtoestanden

In this video, we demonstrate the process of real-time monitoring of cellular events, including the proliferation of adherent cells, via a cellular impedance assay. Here, the adherent cells act as insulators, restricting the current flow between the electrodes and increasing the impedance.

Cellular Impedance-Based Analysis for Monitoring of Cellular Processes in Real-Time

This video describes a cellular impedance-based technique to study the survival kinetics of viruses that induce cytopathic effects. The method measures the electrical impedance of virus-infected adherent cells pre-treated with saline.

Cellular Impedance-Based Survival Kinetics Assay to Assess Virus Survival

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Protocollen voor de kweek van humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC), tijdelijke transfectie van fluorescerend gelabelde markers van microtubulusgroei, beeldvorming van levende cellen en geautomatiseerde analyse van interfase-microtubulusgroeidynamiek worden gedetailleerd beschreven.

Hoge-resolutie time-lapse beeldvorming en geautomatiseerde analyse van de dynamiek van microtubuli in Living humane navelstreng endotheelcellen

Hier is een protocol gerapporteerd voor de kwantificering van infectieuze virale deeltjes met behulp van real-time monitoring van elektrische impedantie van geïnfecteerde cellen. Een praktische toepassing van deze methode wordt gepresenteerd door het kwantificeren van influenza A-virusverval onder verschillende fysisch-chemische parameters die omgevingsomstandigheden nabootsen.

Monitoring influenzavirusoverleving buiten de gastheer met behulp van real-time celanalyse

Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.

Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

De hier gerapporteerde TCID50-assay maakt gebruik van labelvrije realtime impedantiemetingen en de Virologiemodule van het systeem om objectief virus-geïnduceerde cytopathische effecten (CPE) in realtime te monitoren. Deze gestroomlijnde assay vermindert de hands-on tijd aanzienlijk, ondersteunt hoog-doorvoer, kwantitatieve kinetische CPE-metingen en maakt geautomatiseerde, realtime TCID50-berekeningen mogelijk.

Een gestroomlijnde, labelvrije realtime 50% weefselcultuur infectieuze dosis (TCID50) assay met impedantie voor geautomatiseerde kwantificatie van virale titers

Leer het monitoren van morfologische veranderingen in HUVECs tijdens virale infectie met behulp van real-time celanalyse. Deze niet-invasieve methode detecteert celafstoting en vasculaire lekkage continu.

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse (Video) | JoVE Journal

Monitoring van veranderingen in endotheelcellen van de menselijke navelstrengader bij virale infectie met behulp van op impedantie gebaseerde real-time celanalyse

Meer video's verkennen