Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

De twee fenotypische analysemethoden die hier worden gepresenteerd, bieden afbeeldingen van hoge kwaliteit die voldoende zijn voor het uitvoeren van kwantitatieve fenotypische analyse en voor het aantonen van fenotypische reacties van peptidebehandeling met epidermale details. Bijgevolg kunnen deze twee methoden worden gebruikt voor het begrijpen van epidermale celpatronen en -ontwikkeling. Deze twee methoden zijn relatief eenvoudige en betrouwbare technieken omdat ze geen giftige chemicaliën of epidermale stukken vereisen die veel worden gebruikt voor epidermale fenotypische analyse.

De technieken zijn echter ingewikkeld en vereisen gespecialiseerde training. Om te beginnen, selecteer en knip zorgvuldig een van de zaadlobben uit de individuele zaailingen die uniform groeien met andere zaailingen op de plaat om de variabiliteit te beperken. Plaats elke zaadlob in een microcentrifugebuis met één milliliter fixatieoplossing met een tang en laat het monster een nacht bij kamertemperatuur in de fixatieoplossing staan.

Verwijder de bevestigingsoplossing en voeg een milliliter 70% ethanol toe. Keer de buis een paar keer om en laat de buis met de monsters ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur staan. Herhaal deze stap met één milliliter 50% ethanol en vervolgens 20% ethanol.

Vervang de ene milliliter 20% ethanol door één milliliter gedestilleerd water, keer de buis met de zaadlobbige monsters een paar keer om en laat het ongeveer 30 minuten staan. Verwijder al het gedestilleerde water uit de buis en voeg onmiddellijk ongeveer 200 microliter Toluidine Blue O- of TBO-kleuringsoplossing toe gedurende ongeveer twee minuten. Verwijder de TBO-kleuringsoplossing zo grondig mogelijk en was de monsters vervolgens onmiddellijk een paar keer door een milliliter vers gedestilleerd water toe te voegen.

Transplanteer in een laminaire stroomkap zorgvuldig 10 tot 12 eendaagse Arabidopsis-zaailingen van elk van de twee voorbereide platen in een 24-putplaat met 1,5 milliliter half MS-vloeibaar medium in elke put. Voeg ofwel 50 millimolar tris HCL-buffer alleen of twee verschillende concentraties van het peptide toe aan elke put met de zaailingen ontkiemd op halve MS-agarplaten. Meng de zaailingen voorzichtig met de buffer alleen of een peptide-oplossing met behulp van een pipet en sluit de plaat af met microporiëntape.

Incubeer de testplaat onder lange dagomstandigheden gedurende vijf tot zeven dagen bij 22 graden Celsius. Breng zaailing uit de put over op een dekplaat en ontleed de zaadlob van de zaailing. Plaats de abaxiale kant van de zaadlob met een tang omhoog en snijd deze in kleine stukjes.

Neem nog een schone microscoopglaasje en plaats er een druppel propidiumjodide-oplossing op. Plaats een van de kleine stukjes zaadlob met een tang in de druppel en plaats voorzichtig de dekslip. Breng extra propidiumjodide-oplossing aan op de rand van de afdekplaat om eventuele gevormde luchtbellen te verwijderen.

Beeld de abaxiale kant van de zaadlob af met een confocale microscoop en vergelijk de afbeeldingen met de afbeeldingen van zaailingen gekweekt in een half MS-medium dat alleen buffer bevat. Abaxiale zaadlobbigbeelden van 10 dagen oude zaailingen van drie Arabidopsis-genotypen, wild type, een STOMAGEN silenced line en epf1 epf2-mutanten worden hier getoond. Hier vertegenwoordigt de STOMAGEN-zwijgenlijn de genotypen met lage aantallen huidmondjes en de epf1 epf2-mutanten de genotypen met hoge aantallen huidmondjes.

De representatieve epidermisbeelden van zaadlobben van 10 dagen oude zaailingen van wild type, tmm en transgene lijnen met een oestradiol induceerbare epf2 of epf1 overexpressie construct werden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van het epidermale fenotype. De representatieve confocale beelden van wild type en epf2 cotyledon epidermis gekweekt gedurende zes tot zeven dagen in een bufferoplossing en een epf2 cotyledon epidermis gekweekt met twee verschillende partijen epf2 peptiden zijn weergegeven in deze figuur. Door deze procedure uit te voeren, moet u ervoor zorgen dat u een van de zaadlobben snijdt van een individuele zaailing die al uniform groeit met de andere zaailingen.

Kies ook een zaailing die de MS-media niet raakt om de variabiliteit te beperken. Een ander punt om te onthouden is dat plaats niet meer dan vijf zaadlobben in een enkele microcentrifugebuis. Veeg ook voorzichtig over de buis om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de TBO-vlekken rond de zaadlobben om ze goed te kleuren.

Aangezien er meerdere structurele peptiden bestaan in een peptideoplossing, zal deze bioassay-methode zeer nuttig zijn voor de identificatie van goed gevouwen en bioactieve vormen van peptide en hun biologische functies.