Name: Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:05:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Ontdek twee innovatieve fenotyperingsmethoden voor stomatale ontwikkeling in Arabidopsis met toluidineblauw O-kleuring. Deze technieken bieden betrouwbare epidermale analyses zonder giftige chemicaliën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery-programma en Concordia University. K.B. wordt ondersteund door de National Overseas Scholarship uit India.

1. Arabidopsis zaadlobben kleuren met TBO
<ol><li>Zaadsterilisatie en groeiomstandigheden<ol><li>Steriliseer ~ 30 Arabidopsis-zaden per genotype in een microcentrifugebuis door 1 ml van een zaadsterilisatieoplossing toe te voegen (33% commercieel bleekmiddel, 0,1% Triton X-100) en rock zachtjes gedurende 10-12 minuten bij kamertemperatuur (RT). OPMERKING: Steriliseer ~30 zaden van het wildtype Arabidopsis accession Columbia (Col-0) en/of ~60 zaden van transgene planten die een chemisch induceerbaar gen dragen (bijv. Est::EPF27) om transgene zaailingen te gebruiken die zijn gekweekt op 1/2 Murashige en Skoog (MS) platen (2,16 g/L met 0,8% agar [w/v]) zonder inductor (bijv. β-oestradiol) als controles (figuur 1 en figuur 2).</li>
		<li>Verwijder de sterilisatieoplossing, was de zaden vier keer met 1 ml steriel water in een laminaire stroomkap en resuspensie ze in ~ 200 μL steriele 0,1% agar.</li>
		<li>Zaai ~30 zaden per genotype op 1/2 MS agarplaten of 1/2 MS agarplaten met een inductor (bijv. 10 μM β-oestradiol) voor de chemische inductie van het transgen (bijv. Est::EPF27) met behulp van een pipet en sluit af met microporiëntape. OPMERKING: De zaden moeten gelijkmatig op de plaat worden verdeeld om te voorkomen dat ze dicht bij elkaar worden geplaatst, omdat dit voorkomt dat de zaailingen gelijkmatig groeien.</li>
		<li>Stratificeer de zaden door de platen 3-5 dagen op 4 °C zonder licht te plaatsen om de kieming te synchroniseren.</li>
		<li>Incubeer de platen na stratificatie in een groeikamer bij 22 °C onder 120 μmol·m−2·s−1 licht met een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker gedurende 10 dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bemonstering en TBO-kleuring van Arabidopsis zaadlobben<ol><li>Selecteer en knip 10 dagen na het ontkiemen zorgvuldig een van de zaadlobben uit de individuele zaailingen die uniform groeien met andere zaailingen op de plaat om de variabiliteit te beperken. OPMERKING: Cotyledons worden bemonsterd van 10 dagen oude zaailingen omdat ze geen trichomen en onrijpe epidermiscellen hebben, wat de interpretatie van de epidermale fenotypen vereenvoudigt.</li>
		<li>Plaats elke zaadlob met behulp van een tang in een microcentrifugebuis met 1 ml fixatieoplossing (9:1 ethanol tot azijnzuur) en laat het monster een nacht in de fixatieoplossing zitten, minimaal en bij kamertemperatuur. OPMERKING: De monsters kunnen dan tot een paar jaar in deze toestand worden bewaard. De afbeelding Figuur 2E is genomen van een zaadlobbenmonster dat meer dan 3 jaar in een fixatieoplossing is opgeslagen. Het is belangrijk om de zaadlob onmiddellijk na het snijden in een fixatieoplossing te houden en niet meer dan vijf zaadlobben in elke microcentrifugebuis te plaatsen voor een homogene monstervoorbereiding later.</li>
		<li>Verwijder de fixatieoplossing en voeg 1 ml 70% ethanol toe. Nadat u de buis een paar keer hebt omgekeerd, laat u de buis met de monsters ~ 30 minuten op RT staan.</li>
		<li>Herhaal stap 1.2.3 met 1 ml 50% ethanol en vervolgens 20% ethanol.</li>
		<li>Vervang de 1 ml 20% ethanol door 1 ml gedestilleerd water en laat de buis met de zaadlobbige monsters gedurende ~ 30 minuten na het omkeren van de buis een paar keer. OPMERKING: De monsters kunnen langer dan 24 uur in gedestilleerd water blijven, maar dit wordt niet aanbevolen voor het verkrijgen van afbeeldingen van goede kwaliteit (goed gekleurde afbeeldingen voor verschillende epidermale celtypen) voor kwantitatieve analyse.</li>
		<li>Verwijder al het gedestilleerde water uit de buis. Voeg vervolgens onmiddellijk ~ 200 μL TBO-kleuringsoplossing (0,5% TBO in H 2 O, gefilterd) toe gedurende ~2minuten. OPMERKING: Zorg ervoor dat elk zaadlobbigmonster gelijkmatig wordt blootgesteld aan TBO-oplossing door de buizen tijdens de incubatie voorzichtig te laten flikkeren. Om overkleuring met TBO te voorkomen (de timing van de kleuring is essentieel en kan variabel zijn voor elk genotype), verwerk niet meer dan zes buizen met monsters tegelijk.</li>
		<li>Verwijder de TBO-kleuringsoplossing zo grondig mogelijk en was de monsters onmiddellijk een paar keer door 1 ml vers gedestilleerd water toe te voegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Beeldvorming en data-analyse<ol><li>Neem een microscoopglaasje en voeg een druppel van 15% glycerol (~ 50 μL) toe. Leg de zaadlob met de abaxiale kant omhoog in 15% glycerol op de dia met behulp van een fijne tang. Bedek het vervolgens voorzichtig met een afdekbrief, zodat eventuele gevormde luchtbellen uit het monster kunnen worden verwijderd.</li>
		<li>Stel de abaxiale kant van de zaadlobben epidermis voor met behulp van een brightfield-microscoop (figuur 1 en figuur 2) en onderzoek vervolgens het epidermale fenotype door het aantal huidmondjes en andere epidermale celtypen te tellen.</li>
		<li>Bereken voor elk genotype het epidermale fenotype met behulp van de volgende formules beschreven door Jangra et al.17: Stomatale index (%) = (Aantal huidmondjes/Totaal aantal epidermale cellen) × 100 Stomatale dichtheid (mm−2) = Aantal huidmondjes/oppervlakte (mm2) OPMERKING: Afbeelding van ten minste acht zaadlobben (N = 8) voor elk genotype en documenteer het epidermale fenotype van elk genotype door het te vergelijken met het fenotype van de wilde plant en / of transgene planten die een chemisch induceerbaar transgen tot expressie brengen dat zonder inductor is gekweekt.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Bioassays voor stomatale peptiden
OPMERKING: De procedure voor bioassays is weergegeven in figuur 3.
<ol><li>Zaadsterilisatie en groeiomstandigheden<ol><li>Steriliseer ~ 25 zaden voor elke behandeling zoals hierboven, en zaai ongeveer de helft van de zaden op elk van de twee 1/2 MS agarplaten in een laminaire stroomkap. OPMERKING: Gebruik het genotype met hoge en/of lage epidermale cellen (bijv. epf22) in plaats van een wild-type achtergrond (bijv. Col-0) om gemakkelijk de biologische activiteiten van de peptiden op de epidermale celpatronen en differentiatie te detecteren (figuur 4).</li>
		<li>Stratificeer de zaden gedurende 3 dagen bij 4 °C in het donker.</li>
		<li>Haal elk van de twee platen eruit met intervallen van ~10 uur en incuber de zaden op platen bij 22 °C onder 120 μmol·m−2·s−1 licht met een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker gedurende 1 dag.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptide behandeling en beeldvorming<ol><li>Transplanteer in een laminaire stroomkap zorgvuldig 10-12 aramidopsis-zaailingen van een dag oud van elk van de twee voorbereide platen in een 24-putplaat met 1,5 ml 1/2 MS vloeibaar medium in elke put (~ 20 zaailingen per put). OPMERKING: De timing van de peptidebehandeling voor de zaailingen is van cruciaal belang voor de fenotypische resultaten van de peptidebehandeling, dus bereid de zaden op twee afzonderlijke platen voor om twee verschillende ontwikkelingsstadia van zaailingen voor de behandeling te verkrijgen.</li>
		<li>Voeg ofwel een buffer alleen (50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) of twee verschillende concentraties van het peptide (typisch 1 μM en 2,5 μM peptide in 50 mM Tris-HCl [pH 8,0]) toe aan elke put met ~ 20 een dag oude Arabidopsis-zaailingen ontkiemd op 1/2 MS agarplaten. OPMERKING: Verwijder de aliquots van de peptideoplossing uit een vriezer en bewaar ze een paar minuten voor de behandeling bij RT. Peptiden die in een vriezer bij −80 °C worden bewaard, zijn een paar jaar stabiel, maar vries-dooicycli moeten worden vermeden door de peptideoplossing in kleine aliquots op te slaan.</li>
		<li>Nadat u de zaailingen voorzichtig hebt gemengd met alleen een buffer of een peptideoplossing met behulp van een pipet, sluit u de plaat af met microporiëntape. Incubeer de testplaat onder langdurige omstandigheden (16 uur fotoperiode, 120 μmol·m−2·s−1 licht) gedurende 5-7 dagen bij 22 °C. OPMERKING: Voorkom dat de zaailingen te dicht bij elkaar groeien om elke zaailing gelijkmatig bloot te stellen aan de peptide-oplossing. Draai de plaat voorzichtig gedurende 2-3 uur voordat u de plaat in een groeikamer incubeert om de beluchting te verhogen.</li>
		<li>Breng elke zaailing over uit de put met alleen buffer of peptide op een afdekplaat en ontleed de zaadlob van de zaailing. Plaats de abaxiale kant van de zaadlob omhoog met een tang en snijd deze in kleine stukjes.</li>
		<li>Neem nog een schone microscoopglaasje en plaats daarop een druppel propidiumjodide-oplossing (~ 25 μL, 2 mg / ml in H2O).</li>
		<li>Plaats een van de kleine stukjes zaadlob in een druppel propidiumjodide-oplossing met een tang en plaats voorzichtig de dekslip. Breng extra propidiumjodide-oplossing aan op de rand van de afdekplaat om eventuele luchtbellen te verwijderen.</li>
		<li>Beeld de abaxiale kant van de zaadlob af met een confocale microscoop en vergelijk de afbeeldingen met de afbeeldingen van zaailingen gekweekt in 1/2 MS-medium dat alleen buffer bevat. OPMERKING: De afbeeldingen in figuur 4 zijn genomen van wild-type Col-0 of epf22,5 zaailingen die werden behandeld met alleen buffer (figuur 4A, B) of twee partijen EPF2-peptideoplossing (figuur 4C-F) en werden opgeslagen bij −80 °C gedurende 1 jaar.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Hara, K., Kajita, R., Torii, K. U., Bergmann, D. C., Kakimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretory+peptide+gene+EPF1+enforces+the+stomatal+one-cell-spacing+rule%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule.</a> Genes & Development. 21 (14), 1720-1725 (2007).</li>
<li>Hara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+density+is+autoregulated+via+a+secretory+peptide%2C+EPIDERMAL+PATTERNING+FACTOR+2+in+Arabidopsis+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 in Arabidopsis leaves.</a> Plant & Cell Physiology. 50 (6), 1019-1031 (2009).</li>
<li>Kondo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+density+is+controlled+by+a+mesophyll-derived+signaling+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+%26+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stomatal density is controlled by a mesophyll-derived signaling molecule.</a> Plant & Cell Physiology. 51 (1), 1-8 (2010).</li>
<li>Sugano, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomagen+positively+regulates+stomatal+density+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stomagen positively regulates stomatal density in Arabidopsis.</a> Nature. 463 (7278), 241-244 (2010).</li>
<li>Hunt, L., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signaling+peptide+EPF2+controls+asymmetric+cell+divisions+during+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development.</a> Current Biology. 19 (10), 864-869 (2009).</li>
<li>Hunt, L., Bailey, K. J., Gray, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signalling+peptide+EPFL9+is+a+positive+regulator+of+stomatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The signalling peptide EPFL9 is a positive regulator of stomatal development.</a> New Phytologist. 186 (3), 609-614 (2010).</li>
<li>Lee, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interaction+of+ligand-receptor+pairs+specifying+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Direct interaction of ligand-receptor pairs specifying stomatal patterning.</a> Genes & Development. 26 (2), 126-136 (2012).</li>
<li>Shpak, E. D., McAbee, J. M., Pillitteri, L. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stomatal+patterning+and+differentiation+by+synergistic+interactions+of+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases.</a> Science. 309 (5732), 290-293 (2005).</li>
<li>Nadeau, J. A., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+stomatal+distribution+on+the+Arabidopsis+leaf+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of stomatal distribution on the Arabidopsis leaf surface.</a> Science. 296 (5573), 1697-1700 (2002).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+function+of+Arabidopsis+SERK+family+receptor-like+kinases+in+stomatal+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential function of Arabidopsis SERK family receptor-like kinases in stomatal patterning.</a> Current Biology. 25 (18), 2361-2372 (2015).</li>
<li>Lampard, G. R., Macalister, C. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+stomatal+initiation+is+controlled+by+MAPK-mediated+regulation+of+the+bHLH+SPEECHLESS%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis stomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS.</a> Science. 322 (5904), 1113-1116 (2008).</li>
<li>Yang, M., Sack, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+too+many+mouths+and+four+lips+mutations+affect+stomatal+production+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The too many mouths and four lips mutations affect stomatal production in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 7 (12), 2227-2239 (1995).</li>
<li>Theunissen, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+studying+grass+leaf+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">An improved method for studying grass leaf epidermis.</a> Stain Technology. 64 (5), 239-242 (1989).</li>
<li>Venkata, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crw1--A+novel+maize+mutant+highly+susceptible+to+foliar+damage+by+the+western+corn+rootworm+beetle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">crw1--A novel maize mutant highly susceptible to foliar damage by the western corn rootworm beetle.</a> PLoS One. 8 (8), 71296(2013).</li>
<li>Tucker, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+small+RNA+pathways+promote+the+mitotic+events+of+megagametogenesis+during+female+reproductive+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Somatic small RNA pathways promote the mitotic events of megagametogenesis during female reproductive development in Arabidopsis.</a> Development. 139 (8), 1399-1404 (2012).</li>
<li>Ohki, S., Takeuchi, M., Mori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NMR+structure+of+stomagen+reveals+the+basis+of+stomatal+density+regulation+by+plant+peptide+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The NMR structure of stomagen reveals the basis of stomatal density regulation by plant peptide hormones.</a> Nature Communications. 2, 512(2011).</li>
<li>Jangra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplicated+antagonistic+EPF+peptides+optimize+grass+stomatal+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Duplicated antagonistic EPF peptides optimize grass stomatal initiation.</a> Development. 148 (16), (2021).</li>
<li>Zhao, C., Craig, J. C., Petzold, H. E., Dickerman, A. W., Beers, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+xylem+and+phloem+transcriptomes+from+secondary+tissues+of+the+Arabidopsis+root-hypocotyl%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The xylem and phloem transcriptomes from secondary tissues of the Arabidopsis root-hypocotyl.</a> Plant Physiology. 138 (2), 803-818 (2005).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+inflorescence+architecture+by+intertissue+layer+ligand-receptor+communication+between+endodermis+and+phloem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Regulation of inflorescence architecture by intertissue layer ligand-receptor communication between endodermis and phloem.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (16), 6337-6342 (2012).</li>
<li>Tameshige, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+peptide+and+its+receptors+shape+the+auxin+response+pattern+and+leaf+margin+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A secreted peptide and its receptors shape the auxin response pattern and leaf margin morphogenesis.</a> Current Biology. 26 (18), 2478-2485 (2016).</li>
<li>Abrash, E. B., Davies, K. A., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+signaling+specificity+in+Arabidopsis+by+spatially+restricted+buffering+of+ligand-receptor+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of signaling specificity in Arabidopsis by spatially restricted buffering of ligand-receptor interactions.</a> The Plant Cell. 23 (8), 2864-2879 (2011).</li>
<li>Uchida, N., Tasaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plant+vascular+stem+cells+by+endodermis-derived+EPFL-family+peptide+hormones+and+phloem-expressed+ERECTA-family+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Regulation of plant vascular stem cells by endodermis-derived EPFL-family peptide hormones and phloem-expressed ERECTA-family receptor kinases.</a> Journal of Experimental Botany. 64 (17), 5335-5343 (2013).</li>
<li>Kosentka, P. Z., Overholt, A., Maradiaga, R., Mitoubsi, O., Shpak, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EPFL+Signals+in+the+boundary+region+of+the+SAM+restrict+its+size+and+promote+leaf+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">EPFL Signals in the boundary region of the SAM restrict its size and promote leaf initiation.</a> Plant Physiology. 179 (1), 265-279 (2019).</li>
</ol>

Er werden geen belangenconflicten verklaard.

De twee fenotypische analysemethoden voor het identificeren en karakteriseren van de genen die stomatale patronen en differentiatie regelen, die hier worden gepresenteerd, zijn handige en betrouwbare testen, omdat de protocollen geen epidermale peelings en gespecialiseerde apparatuur vereisen (die tijdrovend zijn en speciale training vereisen voor monstervoorbereiding), maar wel beelden van hoge kwaliteit produceren voor de kwantitatieve analyse van epidermale fenotypen.
Een beperking van deze...

Een goede patroonvorming en differentiatie van de plantenhuidmondjes zijn van cruciaal belang voor hun functie in twee fundamentele biologische processen, fotosynthese en transpiratie, en worden afgedwongen door EPF-peptidesignaleringsroutes. In Arabidopsis controleren drie uitgescheiden cysteïnerijke peptiden, EPF1, EPF2 en STOMAGEEN / EPFL9, verschillende aspecten van stomatale ontwikkeling en worden waargenomen door celoppervlakreceptorcomponenten, waaronder ERECTA-familie receptorkinasen (ER, ERL1 en ERL2), SERKs en TMM 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Deze herkenning leidt vervolgens tot de downregulatie van de transcriptiefactoren die stomatale differentiatie bevorderen door een MAPK-afhankelijk proces11. De ontdekking van deze kernstomatale genen wordt voornamelijk bereikt door de fenotypische screening van mutanten die epidermale defecten vertonen. Dit artikel presenteert relatief eenvoudige en efficiënte fenotyperingsmethoden voor het visualiseren van de huidmondjes en andere epidermale cellen, die nodig zijn om de potentiële genen te identificeren en te karakteriseren die stomatale patronen en differentiatie regelen.
De observatie van de details van de epidermis van de plant is meestal bereikt door epidermale peelings te gebruiken met of zonder kleuring met een kleurstof zoals toluidineblauw O (TBO) of safranine12,13,14. De grootste uitdaging van deze methoden is echter dat ze gespecialiseerde training vereisen om de bladepidermis te pellen zonder de weefsels te scheuren en om de patroongegevens zorgvuldig te observeren en te analyseren terwijl de afbeeldingen uit verschillende delen van het blad worden vermeden. Chemische behandelingen om de weefselmonsters te zuiveren met reagentia zoals op chloraalhydraat gebaseerde reinigingsoplossingen zijn ook op grote schaal gebruikt voor een verschillende reeks biologische materialen 8,15; Deze behandelingen genereren veel fenotypische informatie door beelden van hoge kwaliteit te leveren, maar vereisen ook het gebruik van gevaarlijke chemicaliën (bijv. Formaldehyde, chloraalhydraat). Dit artikel presenteert eerst een relatief eenvoudige en handige fenotyperingsmethode die beelden produceert die voldoende zijn voor kwantitatieve analyse, maar waarvoor geen gevaarlijke chemicaliën en epidermale bladschillen nodig zijn voor de monstervoorbereiding. Een TBO-gekleurde zaadlobben epidermis is ook ideaal voor de studie van stomatale ontwikkeling omdat het ontbreken van trichomen en de kleinere ontwikkelingsgradiënt in zaadlobben de eenvoudige en handelbare interpretatie van de epidermale fenotypen mogelijk maken.
Stomatale EPF-peptiden behoren tot de groep van plantspecifieke, cysteïnerijke peptiden met relatief grote volwassen afmetingen en intramoleculaire disulfidebindingen tussen geconserveerde cysteïneresiduen. Correcte conformatievouwing is van cruciaal belang voor hun biologische functie, maar cysteïnerijke peptiden, die worden geproduceerd door chemische synthese of een heterologe recombinatiesysteem, kunnen inactief zijn en zijn een mengsel van zowel correct gevouwen als ongevouwen peptiden 3,7,16. De screening van bioactieve peptiden die een rol spelen bij het beheersen van de stomatale ontwikkeling is dus een zeer uitdagende taak geweest. Dit manuscript beschrijft bovendien een bioassay voor de betere identificatie en karakterisering van bioactieve stomatale peptiden. Bij deze methode worden Arabidopsis-zaailingen gedurende 6-7 dagen gekweekt in een multi-well plaat met media met en zonder potentiële peptiden. Vervolgens wordt de zaadlobben epidermis gevisualiseerd met behulp van een confocale microscoop. In het algemeen, om de biologische activiteit van potentiële peptiden in de stomatale ontwikkeling duidelijk te visualiseren, worden de genotypen die meer en / of minder stomatale afstammingscellen produceren, zoals de epf2-mutant, die meer epidermale cellen produceert, en de STOMAGEN-ami-lijn, die een verminderde epidermale celdichtheid 2,4,5 verleent, gebruikt naast de wild-type Arabidopsis-controle (Col-0) voor de bioassays.
Over het algemeen kunnen de twee hier gepresenteerde protocollen worden gebruikt voor de snelle en efficiënte beoordeling van verschillende epidermale fenotypen en voor het screenen van kleine peptiden en hormonen die een rol spelen bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling.

<table><tbody><tr><td>18 mm x 18 mm dekglasje</td><td>VWR</td><td>16004-326</td><td></td></tr><tr><td>24-well steriele platen met deksel</td><td>VWR</td><td>CA62406-183</td><td></td></tr><tr><td>3M Micropore chirurgisch pleister</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-027-761</td><td>Microporeuze chirurgische papiertape gebruikt om MS-platen af te sluiten</td></tr><tr><td>76 x 26 mm Microscoopglas</td><td>TLG</td><td>GEW90-2575-03</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur, &ge;99,8%&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bleekmiddel</td><td>Huishoudbleek (bijv. Clorox)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop&nbsp;</td><td>Nikon&nbsp;</td><td></td><td>Nikon C2 bediend door NIS-Elements&nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Greenfield</td><td>P210EAAN</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>Open-source</td><td>(Fiji Is Just) ImageJ v2.1/1.5.3j</td><td>Gedownload van https://imagej.net/software/fiji/</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gamborg's vitaminemengsel</td><td>Cassson Labs</td><td>GBL01-100ML</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Kweekkamers</td><td>Conviron,&nbsp;model E15</td><td></td><td>16 uur lichtcyclus, ingesteld op 21&deg;C met een lichtintensiteit van 120 &micro;mol&middot;m-2&middot;s-1.</td></tr><tr><td>Lichten</td><td>HD Supply</td><td>25272</td><td>Fluorescente&nbsp; lampen in kweekkamers, Sylvania F72T12/CW/VHO 72"T12 VHO 4200K&nbsp;</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-155</td><td>Buisjes waarin Arabidopsis thaliana zaden worden geplaatst om sterilisatie uit te voeren</td></tr><tr><td>Microscoop&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse TiE uitgerust met een DsRi2 digitale camera</td></tr><tr><td>Murashige en Skoog basale zouten&nbsp;</td><td>Cassson Labs</td><td>MSP01-1LT</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Petrischaal 100 mm x 20 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-11Z</td><td>Petrischalen waarin MS-medium wordt gegoten voor het kweken van Arabidopsis thaliana</td></tr><tr><td>Propidiumjodide&nbsp;</td><td>VWR</td><td>39139-064</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-916-5A</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC700.5</td><td></td></tr><tr><td>Toluidine blauw O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr></tbody></table>

identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Identification of the Genes Involved in Stomatal Development via Epidermal Phenotype Scoring

Huidmondjes zijn kleine poriën op het oppervlak van landplanten die betrokken zijn bij gasuitwisseling en waterdampafgifte, en hun functie is van cruciaal belang voor de productiviteit en overleving van planten. Als zodanig heeft het begrijpen van de mechanismen waarmee huidmondjes zich ontwikkelen en patroon een enorme agronomische waarde. Dit artikel beschrijft twee fenotypische methoden met behulp van Arabidopsis zaadlobben die kunnen worden gebruikt om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling en patronen regelen. Eerst worden procedures gepresenteerd voor het analyseren van de stomatale fenotypes met behulp van toluidineblauwe O-gekleurde zaadlobben. Deze methode is snel en betrouwbaar en vereist geen gebruik van epidermale peelings, die veel worden gebruikt voor fenotypische analyses, maar gespecialiseerde training vereisen. Vanwege de aanwezigheid van meerdere cysteïneresiduen is de identificatie en generatie van bioactieve EPF-peptiden die een rol spelen bij de stomatale ontwikkeling een uitdaging geweest. De tweede wordt dus een procedure gepresenteerd die wordt gebruikt om stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteit te controleren door middel van bioassays. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het relatief gemakkelijk reproduceerbare gegevens produceert, terwijl de hoeveelheid peptide-oplossing en de tijd die nodig is om de rol van de peptiden bij het beheersen van stomatale patronen en ontwikkeling te karakteriseren, worden verminderd. Over het algemeen verbeteren deze goed ontworpen protocollen de efficiëntie van het bestuderen van de potentiële stomatale regulatoren, waaronder cysteïnerijke secretoire peptiden, die zeer complexe structuren vereisen voor hun activiteit.

Verschillende stomatale transgene planten en mutanten waarvan bekend is dat ze minder of meer stomatale dichtheid en clustering hebben (epf2 2,5, epf1 epf2 2,5, tmm12, een STOMAGEN-gedempte lijn4, en transgene lijnen met de estradiol-induceerbare Est::EPF1 of Est::EPF2 overexpressieconstruct7</e...

Dit artikel beschrijft twee fenotyperingsmethoden zonder het gebruik van epidermale peelings om de genen te karakteriseren die de stomatale ontwikkeling regelen. De eerste methode demonstreert hoe een stomataal fenotype kan worden geanalyseerd met behulp van een toluidineblauwe O-gekleurde plantenepidermis. De tweede methode beschrijft hoe stomatale liganden te identificeren en hun biologische activiteiten te volgen.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Stomata are small pores on the surface of land plants that are involved in gas exchange and water vapor release, and their function is critical for plant ...

De twee fenotypische analysemethoden die hier worden gepresenteerd, bieden afbeeldingen van hoge kwaliteit die voldoende zijn voor het uitvoeren van kwantitatieve fenotypische analyse en voor het aantonen van fenotypische reacties van peptidebehandeling met epidermale details. Bijgevolg kunnen deze twee methoden worden gebruikt voor het begrijpen van epidermale celpatronen en -ontwikkeling. Deze twee methoden zijn relatief eenvoudige en betrouwbare technieken omdat ze geen giftige chemicaliën of epidermale stukken vereisen die veel worden gebruikt voor epidermale fenotypische analyse.De technieken zijn echter ingewikkeld en vereisen gespecialiseerde training. Om te beginnen, selecteer en knip zorgvuldig een van de zaadlobben uit de individuele zaailingen die uniform groeien met andere zaailingen op de plaat om de variabiliteit te beperken. Plaats elke zaadlob in een microcentrifugebuis met één milliliter fixatieoplossing met een tang en laat het monster een nacht bij kamertemperatuur in de fixatieoplossing staan.Verwijder de bevestigingsoplossing en voeg een milliliter 70% ethanol toe. Keer de buis een paar keer om en laat de buis met de monsters ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur staan. Herhaal deze stap met één milliliter 50% ethanol en vervolgens 20% ethanol.Vervang de ene milliliter 20% ethanol door één milliliter gedestilleerd water, keer de buis met de zaadlobbige monsters een paar keer om en laat het ongeveer 30 minuten staan. Verwijder al het gedestilleerde water uit de buis en voeg onmiddellijk ongeveer 200 microliter Toluidine Blue O- of TBO-kleuringsoplossing toe gedurende ongeveer twee minuten. Verwijder de TBO-kleuringsoplossing zo grondig mogelijk en was de monsters vervolgens onmiddellijk een paar keer door een milliliter vers gedestilleerd water toe te voegen.Transplanteer in een laminaire stroomkap zorgvuldig 10 tot 12 eendaagse Arabidopsis-zaailingen van elk van de twee voorbereide platen in een 24-putplaat met 1,5 milliliter half MS-vloeibaar medium in elke put. Voeg ofwel 50 millimolar tris HCL-buffer alleen of twee verschillende concentraties van het peptide toe aan elke put met de zaailingen ontkiemd op halve MS-agarplaten. Meng de zaailingen voorzichtig met de buffer alleen of een peptide-oplossing met behulp van een pipet en sluit de plaat af met microporiëntape.Incubeer de testplaat onder lange dagomstandigheden gedurende vijf tot zeven dagen bij 22 graden Celsius. Breng zaailing uit de put over op een dekplaat en ontleed de zaadlob van de zaailing. Plaats de abaxiale kant van de zaadlob met een tang omhoog en snijd deze in kleine stukjes.Neem nog een schone microscoopglaasje en plaats er een druppel propidiumjodide-oplossing op. Plaats een van de kleine stukjes zaadlob met een tang in de druppel en plaats voorzichtig de dekslip. Breng extra propidiumjodide-oplossing aan op de rand van de afdekplaat om eventuele gevormde luchtbellen te verwijderen.Beeld de abaxiale kant van de zaadlob af met een confocale microscoop en vergelijk de afbeeldingen met de afbeeldingen van zaailingen gekweekt in een half MS-medium dat alleen buffer bevat. Abaxiale zaadlobbigbeelden van 10 dagen oude zaailingen van drie Arabidopsis-genotypen, wild type, een STOMAGEN silenced line en epf1 epf2-mutanten worden hier getoond. Hier vertegenwoordigt de STOMAGEN-zwijgenlijn de genotypen met lage aantallen huidmondjes en de epf1 epf2-mutanten de genotypen met hoge aantallen huidmondjes.De representatieve epidermisbeelden van zaadlobben van 10 dagen oude zaailingen van wild type, tmm en transgene lijnen met een oestradiol induceerbare epf2 of epf1 overexpressie construct werden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van het epidermale fenotype. De representatieve confocale beelden van wild type en epf2 cotyledon epidermis gekweekt gedurende zes tot zeven dagen in een bufferoplossing en een epf2 cotyledon epidermis gekweekt met twee verschillende partijen epf2 peptiden zijn weergegeven in deze figuur. Door deze procedure uit te voeren, moet u ervoor zorgen dat u een van de zaadlobben snijdt van een individuele zaailing die al uniform groeit met de andere zaailingen.Kies ook een zaailing die de MS-media niet raakt om de variabiliteit te beperken. Een ander punt om te onthouden is dat plaats niet meer dan vijf zaadlobben in een enkele microcentrifugebuis. Veeg ook voorzichtig over de buis om te zorgen voor een gelijkmatige verdeling van de TBO-vlekken rond de zaadlobben om ze goed te kleuren.Aangezien er meerdere structurele peptiden bestaan in een peptideoplossing, zal deze bioassay-methode zeer nuttig zijn voor de identificatie van goed gevouwen en bioactieve vormen van peptide en hun biologische functies.

identification-genes-involved-stomatal-development-via-epidermal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We hebben een eenvoudige en reproduceerbare protocol om stomatale reactie op de levende bacteriën te openen. Deze methode minimaliseert verwonden en manipulatie van het blad ten opzichte van het gebruik van de epidermale schillen eerder gerapporteerd.

Het beoordelen van stomatale Reactie op bacteriële cellen Live met behulp van Whole Leaf Imaging

We beschrijven een protocol met behulp van dia's kamer en de media te planten zaadlobben voor confocale beeldvorming van de opperhuid te immobiliseren over meerdere dagen van de ontwikkeling, het documenteren van stomata differentiatie. Fluorofoor-gemerkte eiwitten kan dynamisch worden gevolgd door expressie en subcellulaire lokalisatie, het verhogen van het inzicht in de mogelijke rollen tijdens de celdeling en cel-type differentiatie.

Lange termijn, hoge resolutie Confocale Time Lapse Imaging van<em&gt; Arabidopsis Cotyledon</em&gt; Epidermis Bij het ontkiemen

Ontrafelen hoe fysiologie en morfologie worden gekoppeld staat een dieper inzicht in de mechanistische werking van de bladeren van de planten. We presenteren zowel een procedure om de parameters van stomataire regelgeving ontlenen stomatale geleidbaarheid metingen en correlaties met traditionele functionele blad kenmerken.

Betrekking stomatale geleidbaarheid om Leaf functionele kenmerken

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe fluorescent-gelabelde eiwit dynamiek op plantencel oppervlakken met een variabele hoek epifluorescentiemicroscopie, waaruit blijkt knipperende stippen van GFP-gelabeld PATROL1, een membraan mensenhandel eiwit te controleren, in de cel cortex van de stomatale complex in Arabidopsis thaliana.

Real-time beeldvorming van Plant Cell Surface Dynamics met variabele hoek epifluorescentiemicroscopie

Op subcellulair niveau worden signaleringsgebeurtenissen dynamisch gemoduleerd door ontwikkelings- en omgevingssignalen. Hier beschrijven we een protocol dat het tabaks-transiente expressiesysteem gebruikt om dynamische eiwit-eiwitinteracties te monitoren en om de ruimtelijke organisatie van signaaltransductie in plantencellen bekend te maken.

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Dit protocol beschrijft een methode voor te bereiden van verrijkte stomatal guard cellen die nuttig is voor fysiologische en andere biologische studies.

Stoma Tape-Peel: Een verbeterde methode voor de bereiding van de monsters van de Guard cel

Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.

Identificatie van nieuwe regulatoren van plantaardige transpiratie door grootschalige thermische beeldvorming screening in Helianthus Annuus

Het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) biedt de mogelijkheid om ontwikkelingsprogramma's te ontleden met minimale verwerking van organen en weefsels. Het protocol levert hoogwaardig RNA op uit cellen die zijn gericht op een groene fluorescerende eiwit (GFP)-gelabelde ribosomalsubunit. Downstream analysetools, zoals qRT-PCR of RNA-seq, onthullen weefsel- en celtypespecifieke expressieprofielen.

Het vertalen van Ribosome Affinity Purification (TRAP) om Arabidopsis thaliana Root Development te onderzoeken op een cell type-specifieke schaal

Verschillende veelgebruikte methoden worden hier geïntroduceerd om de membraanhandelgebeurtenissen van een plasmamembraanreceptorkinase te bestuderen. Dit manuscript beschrijft gedetailleerde protocollen, waaronder de bereiding van het plantmateriaal, de farmacologische behandeling en de confocale beeldvorming.

Op afbeeldingen gebaseerde methoden om membraanhandelgebeurtenissen in somatale afstammingscellen te bestuderen

Hier presenteren we een eenvoudige methode voor directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale reacties op bacteriële invasie in Arabidopsis thaliana. Deze methode maakt gebruik van een draagbaar stomatale beeldvormingsapparaat, samen met een beeldanalysepijplijn die is ontworpen voor bladbeelden die door het apparaat zijn vastgelegd.

Directe observatie en geautomatiseerde meting van stomatale responsen op Pseudomonas syringae pv. tomaat DC3000 in Arabidopsis thaliana

Dit protocol presenteert een vergelijkende methode om huidmondjes- en epidermale kenmerken bij twee verschillende soorten te beoordelen met behulp van epidermale peelings, clearingtechnieken en AI-ondersteunde beeldanalyse. Het doel is om een hoog-doorvoerbare, reproduceerbare kwantificatie van cellulaire structuren die ten grondslag liggen aan de functie van huidmondjes mogelijk te maken voor landbouwtoepassingen en breed plantenonderzoek.

Karakterisering van huidmondjes en epidermale kenmerken met behulp van peelings, clearing en AI-gebaseerde beeldanalyse

Ontdek twee innovatieve fenotyperingsmethoden voor stomatale ontwikkeling in Arabidopsis met toluidineblauw O-kleuring. Deze technieken bieden betrouwbare epidermale analyses zonder giftige chemicaliën.

Identificatie van de genen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van stomato via epidermale fenotypescores

Meer video's verkennen